張志麗，張 煦

1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)研究所(甘肅 蘭州 730000) 2.酒泉市第二人民醫(yī)院病理科(甘肅 酒泉 735000)

組織芯片檢測溶血磷脂酸受體2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

張志麗1,2，張 煦1*

1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)研究所(甘肅 蘭州 730000) 2.酒泉市第二人民醫(yī)院病理科(甘肅 酒泉 735000)

目的 探討溶血磷脂酸受體2(LPA2)蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法 選取52例手術(shù)切除胃癌組織標(biāo)本、22例上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本及13例正常胃黏膜標(biāo)本為研究對象，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測上述3組標(biāo)本組織芯片中LPA2的表達(dá)水平；分析LPA2表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征(年齡、性別、臨床分期、部位、浸潤深度、腫瘤分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況)是否存在相關(guān)性。結(jié)果 LPA2主要表達(dá)于細(xì)胞膜和胞漿，呈棕褐色顆粒狀，在胃癌組織、上皮內(nèi)瘤變及正常胃粘膜中的陽性表達(dá)率分別為73.1% (38/52)、54.5%(12/22)和46.2%(6/13),癌組織中的陽性率顯著高于上皮內(nèi)瘤變及正常胃粘膜(P<0.05)；LPA2陽性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)(P<0.05)。浸潤漿膜層、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期患者LPA2陽性率顯著高于未浸潤漿膜層、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和早期患者。結(jié)論 LPA2在胃癌組織中陽性表達(dá)率較高，并與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，可作為胃癌預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

胃癌；組織芯片；上皮內(nèi)瘤變；溶血磷脂酸受體2

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下，胃癌的發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制目前仍未完全闡明。近年來研究[1-2]顯示腫瘤癌基因的過表達(dá)與抑癌基因的低表達(dá)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。溶血磷脂酸受體2(lysophosphatidic acid 2,LPA2)在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與患者臨床特征和預(yù)后有關(guān)[3]。LPA2蛋白由LPA基因編碼，定位于人19號染色體，編碼蛋白LPA2為G蛋白偶聯(lián)受體，LPA2與其配體結(jié)合后可激活溶血磷脂酸信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[4]。文獻(xiàn)報(bào)道[5]LPA2在乳腺癌等實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)并參與了腫瘤的增殖與侵襲過程，但LPA2在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究選取52例胃癌組織、22例胃粘膜上皮內(nèi)瘤變組織及13例正常胃粘膜上皮為研究對象，探討LPA2在上述組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2010年3月—2016年4月酒泉市第二人民醫(yī)院收治并手術(shù)切除的52例胃癌組織標(biāo)本、22例上皮內(nèi)瘤變標(biāo)本及13例正常胃黏膜標(biāo)本為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有明確病理學(xué)診斷；②術(shù)前未接受過新輔助治療包括放療、化療和生物治療；③有完整的臨床病理資料；④組織標(biāo)本獲取經(jīng)患者及家屬同意；排除組織病理學(xué)診斷不明確、術(shù)前接受過新輔助放化療及臨床資料不完整者。52例胃癌患者男性32例，女性20例，平均年齡(66.8±15.6)歲，賁門癌20例，胃體癌15例，幽門癌17例；按照AJCC(2002)胃癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期15例，Ⅳ期13例，高分化腺癌16例，中分化17例，低分化19例。22例上皮內(nèi)瘤變患者男性18例，女4例，平均年齡(56.7±13.6)歲。13例正常胃粘膜組男性12例，女1例，平均年齡(55.7±17.1)歲。

1.2 試劑與儀器 兔抗人LPA2單克隆抗體(北京博奧森公司)1∶500稀釋、SP9001試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)。石蠟切片機(jī)(德國徠卡公司)，顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、電熱恒溫箱(上海榮珂檢測儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片制作 復(fù)查HE切片, 在顯微鏡下對需要穿取組織定位，并對照蠟塊的位置作標(biāo)記，確定取材位點(diǎn)。用制備組織芯片的模具制作2 mm的空心蠟?zāi)?，?nèi)徑為2 mm的組織芯片取樣器在蠟塊的標(biāo)記位點(diǎn)取出組織蠟芯, 將其放入空心蠟?zāi)？字?，制?×7組織微陣列并對組織芯片蠟塊進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片, 裱附于APES防脫片載玻片上。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精水化后，pH 6.0檸檬酸高溫高壓修復(fù)抗原，3%過氧化氫處理10 min，用于清除內(nèi)源酶活性，試劑A室溫封閉10 min，滴加一抗4 ℃冰箱過夜，二抗37 ℃孵育16 min，試劑C 37℃孵育18 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片后進(jìn)行顯微鏡下觀察，以PBS代替一抗做陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 兩位資深的病理?？漆t(yī)師獨(dú)立進(jìn)行閱片，在高倍鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野下的LPA2陽性細(xì)胞比例。陽性細(xì)胞均以細(xì)胞質(zhì)/胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為主。陽性細(xì)胞<5%為(-)；陽性細(xì)胞5%～25%為(+)；陽性細(xì)胞25%～50%為(++)；陽性細(xì)胞>50%為(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，LPA2在胃癌組織、上皮內(nèi)瘤變和正常胃粘膜中的表達(dá)采用率表示，組間比較采用趨勢卡方檢驗(yàn)(chi-square)；LPA2陽性表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組中LPA2陽性表達(dá)率 LPA2主要表達(dá)于細(xì)胞膜和胞漿，呈棕褐色顆粒狀(圖1)。在胃癌組織、上皮內(nèi)瘤變及正常胃粘膜中的陽性表達(dá)率分別為73.1% (38/52)、54.5%(12/22)和46.2%(6/13)，癌組織中的陽性率顯著高于上皮內(nèi)瘤變及正常胃粘膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.36, 3.96，P<0.05)。

2.2 LPA2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 LPA2陽性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位、分化程度無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)(P<0.05)。浸潤漿膜層、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期患者LPA2陽性率顯著高于未浸潤漿膜層、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和早期患者(P<0.05)，見表1。

A：LPA2在胃癌組織中呈陽性表達(dá)；B：LPA2在上皮內(nèi)瘤變組織中呈陽性表達(dá)；C: LPA2在正常胃粘膜組織中呈陽性表達(dá)；D: LPA2在胃癌組織中呈陰性表達(dá)； E: LPA2在上皮內(nèi)瘤變組織中呈陰性表達(dá)； F: LPA2在正常胃粘膜組織中呈陽性表達(dá)。圖1 LPA2在胃癌組織、上皮內(nèi)瘤變和正常胃粘膜中的表達(dá)(×20)

特征nLPA2+-χ2P性別 男3224(75．0)8(25．0)0．160．69 女2014(70．0)6(30．0)年齡(歲) <503124(77．4)7(22．6)0．740．39 ≥502114(66．7)7(33．3)腫瘤部位 賁門2014(70．0)6(30．0) 胃體1511(73．3)4(26．7)0．050．98 幽門1712(70．6)5(29．4)浸潤深度 侵及漿膜層4329(67．4)14(32．6)4．010．04 未侵及漿膜層99(100．0)0(0．0)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是2018(90．0)2(10．0)4．370．03 否3220(62．5)12(37．5)臨床分期 Ⅰ104(40．0)6(60．0) Ⅱ149(64．3)5(35．7)9．620．02 Ⅲ1513(86．7)2(13．3) Ⅳ1312(92．3)1(7．7)分級 高分化1612(75．0)4(25．0) 中分化1712(70．6)5(29．4)0．090．96 低分化1914(73．7)5(26．3)

3 討論

胃癌在臨床上較為常見，北美流行病學(xué)資料顯示[6]，2012年美國胃癌新發(fā)病例為21 000余例，當(dāng)年胃癌死亡病例為10 000余例。我國尚缺乏全國范圍內(nèi)胃癌發(fā)病率方面的權(quán)威流行病學(xué)數(shù)據(jù)，但區(qū)域流行病數(shù)據(jù)顯示[7]，我國胃癌的發(fā)病率一直居高不下，農(nóng)村發(fā)病率顯著高于城市，欠發(fā)達(dá)地區(qū)高于發(fā)達(dá)地區(qū)，且近年來發(fā)病率有升高趨勢。與日本、歐美等發(fā)達(dá)國家不同，我國胃癌患者存在自身的流行病學(xué)特點(diǎn)，發(fā)病年齡輕，青年胃癌患者比例較高，同時(shí)晚期患者比例較高，大多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[8]。雖然胃癌在全世界范圍內(nèi)高發(fā)，但其發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制目前仍不完全明顯。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多的研究顯示[9]癌基因的異常激活和抑癌基因的缺失表達(dá)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并與其惡性生物學(xué)行為如異常分裂增殖、遷移能力增強(qiáng)、凋亡比例降低等有關(guān)。

LPA2蛋白由LPA基因編碼，該基因定位于人19號染色體，編碼蛋白LPA2為G蛋白偶聯(lián)受體，LPA2與其配體結(jié)合后可激活溶血磷脂酸信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[10-11]。LPA2蛋白在多種實(shí)體腫瘤中異常表達(dá)與患者預(yù)后及臨床病理特征相關(guān)已有報(bào)道。高峰等[5]采用real-time PCR和免疫組織化學(xué)法檢測了乳腺癌組織和癌旁組織中LPA2的表達(dá)情況，并探討了其表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，LPA2在乳腺癌組織中高表達(dá)者高于低表達(dá)者，提示LPA2可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。同時(shí)，LPA2陽性表達(dá)與乳腺癌患者的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且陽性者無疾病進(jìn)展生存時(shí)間短于陰性患者。上述結(jié)果提示LPA2陽性表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。但關(guān)于LPA2在胃癌中的表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本研究選取了52例胃癌組織、22例胃粘膜上皮內(nèi)瘤變組織及13例正常胃粘膜組織為研究對象，探討LPA2在上述組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中的陽性率顯著高于上皮內(nèi)瘤變及正常胃粘膜，提示LPA2蛋白的異常表達(dá)可能在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。但其調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制并未完全闡明。LPA2陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P<0.05)。侵潤漿膜層、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期患者LPA2陽性率顯著高于未侵潤漿膜層、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和早期患者。浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期是胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，陽性表達(dá)患者中，腫瘤浸潤較深、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且臨床分期較晚， LPA2陽性患者提示預(yù)后可能較差，并可作為胃癌預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

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[5] 高峰,肖棟,李曉軍.溶血磷脂酸受體2在乳腺癌中的表達(dá)及預(yù)后相關(guān)性分析[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(10):1 590-1 593.

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責(zé)任編輯：艾 茜

LPA2 Expression in Gastric Cancer and Its Clinical Significance by Tissue Chip Detection

Zhang Zhili1,2,Zhang Xu1*

(1.TheDepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciencesinLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China; 2.TheDepartmentofPathology,theSecondPeople′sHospitalofJiuquan,Jiuquan735000,China)

Objective To evaluate the LPA2 expression in gastric cancer and its clinical significance by tissue chip detection.Methods 52 gastric cancer tissues, 22 intraepithelial neoplasia specimen and 13 normal gastric tissues were collected and were tested the LPA2 expression by tissue microarray immuno histochemistry assay.The LPA2 expression pattern and patients′ clinical pathological features such as age, gender, location invasion depth and lymph node metastasis were analyzed.Results The LPA2 was mainly expressed in the cell membrane and patina with brown granular.The positive expression rates were 73.1% (38/52),54.5%(12/22) and 46.2%(6/13)for cancer tissue,intraepithelial neoplasia and normal gastric mucosa respectively with statistical difference (P<0.05).The positive rate of cancer tissue was significantly higher than that of intraepithelial neoplasia and normal gastric mucosa (P<0.05).The LPA2 positive expression was not associated with age,gender,tumor location and tumor grading (P>0.05),but was related with tumor invasion depth,lymph node metastasis and clinical stage (P<0.05).The LPA2 positive rates of patients with infiltrating serosa and lymph node metastasis in the advanced stage were significantly higher than those of patients without infiltrating serosa and lymph node metastasis in the early stage.Conclusion The LAP was highly expressed in gastric cancer correlating with tumor invasion depth,lymph node metastasis and clinical stages.It could be a potential biomarker for prognosis of gastric cancer.

gastric cancer;tissue chip;intraepithelial neoplasia;lysophosphatidic acid 2;clinical pathology features

張志麗，女，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤病理與臨床;*

張煦，男，副教授，主要從事消化系統(tǒng)臨床病理研究。

R735.2

A

1008-8164(2017)01-0016-04

2016-12-09