唐 敏，嚴建業(yè)，2，徐 博，趙小芳，王學生，李順祥，2＊＊

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院 長沙 410208；2.湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心長沙 410208；山東一笑堂阿膠集團百年制藥有限公司 新蔡 463500）

基于UPLC-ESI-QTOF-MS/MS技術檢測龜甲膠中新阿膠成分＊

唐 敏1，嚴建業(yè)1，2，徐 博1，趙小芳1，王學生3，李順祥1，2＊＊

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院 長沙 410208；2.湖南省中藥活性物質篩選工程技術研究中心長沙 410208；山東一笑堂阿膠集團百年制藥有限公司 新蔡 463500）

目的：檢測龜甲膠中新阿膠特征肽成分。方法：采用胰蛋白酶進行酶解，利用超高效液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間質譜法（UPLC-ESI-QTOF-MS/MS）對龜甲膠樣品進行測定，選定新阿膠特征肽離子m/z 925.4作為檢測離子。結果：龜甲膠特征成分含量偏低的樣品（但不含有牛皮元和驢皮元特征肽成分）中檢測出新阿膠特征肽離子m/z 925.4信號，其MS/MS裂解規(guī)律與文獻報道一致，而龜甲膠標準品中未檢測出該特征肽信號。結論：該方法專屬性強、靈敏度高，可檢測出龜甲膠中是否摻雜新阿膠成分，可用于龜甲膠的質量控制。

UPLC-ESI-QTOF-MS/MS 新阿膠 龜甲膠 肽段

根據(jù)2015版中國藥典記載，龜甲為龜科動物烏龜Chinemy sreevesii（Gray）的背甲及腹甲，龜甲膠是龜科動物烏龜?shù)谋臣准案辜捉?jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠。龜甲膠在歷版《中國藥典》中均有收載，是中國名貴藥材。其味甘、咸，性平，歸肝、腎經(jīng)，可滋陰，補血[1]，主治陰虛潮熱、骨蒸盜汗、腰膝酸軟、血虛萎黃。近年來，由于其價格昂貴，以致烏龜被過度捕殺，其資源面臨嚴重短缺。諸多報道稱，一些不良廠家為了節(jié)省成本，利用其它來源的動物甲殼和皮革為原料來生產(chǎn)龜甲膠，其中包括在原料中摻雜豬皮來生產(chǎn)龜甲膠的情況。

膠類藥材是指由動物的皮革、骨骼等加工而成的膠原蛋白水解肽[2]。近年來，膠類物質在世界范圍內(nèi)均被廣泛使用，據(jù)相關報道數(shù)據(jù)分析[2]，膠類產(chǎn)品每年生產(chǎn)量已超32萬噸，其中豬皮膠的產(chǎn)出就占據(jù)46%。豬皮膠亦稱新阿膠，是動物豬Sus scrofadomestica Brisson的皮去毛熬制而成的膠塊，其標準收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》第19冊。由于豬皮資源比較豐富，且價廉易得，從而常被不良商家作為原料用于生產(chǎn)其他膠類以牟取暴利。同時從一些宗教信仰層面考慮，摻雜了新阿膠的其他膠類在消費和使用方面也受到一定限制[3]。根據(jù)不同動物的同類型膠原蛋白的氨基酸序列存在差異[4]，其胰蛋白酶水解產(chǎn)物所含肽段之間存在差異性。利用蛋白質酶切技術和基于HPLC-MS的多肽識別技術，找出這種差異，是鑒別膠類藥材的關鍵所在[5-7]。近年來，該分析方法日趨成熟[8-11]，而被廣泛用于膠類制劑的檢測。現(xiàn)行的《中國藥典》及其補充批件中對龜甲膠的檢測項目只對龜甲膠特征肽、牛皮元特征肽和驢皮元特征肽的檢測有要求，但未包括新阿膠特征肽的檢測項目。在龜甲膠的實際檢測工作中發(fā)現(xiàn)部分不合格產(chǎn)品中雖可檢測出龜甲膠特征肽，且該產(chǎn)品中未檢測出牛皮元和驢皮元特征肽，但龜甲膠特征肽含量偏低，此時應考慮是否摻雜新阿膠成分的情況。據(jù)文獻報道[12-14]，新阿膠經(jīng)酶解后的產(chǎn)物中可檢測出特征肽段離子m/z 925.4、m/z 774.3、m/z 739.8信號，以上三個特征肽段離子是龜甲膠酶解產(chǎn)物所不含有的，因此可通過對新阿膠酶解產(chǎn)物中特征肽離子進行檢測，判斷龜甲膠產(chǎn)品中是否摻雜了新阿膠成分，可用于龜甲膠的質量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相系統(tǒng)（Waters公司），Waters-Xevo-G2-QTOF質譜系統(tǒng)（Waters公司）；ACQUITY UPLC-BEHC18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）（美國Waters公司）；Mettler MS205DU型電子分析天平（德國METTLER公司）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；ELGA PURELAB OPTION-R 7超純水儀（英國ELGA公司）。

1.2 試藥

亮氨酸腦啡肽（美國 Waters公司，批號：700008842-1）；甲酸（德國 CNW公司，批號：N030K060）、乙腈（色譜純，德國MERCK公司，批號：1746030430）均為色譜純；V5117序列分析級胰蛋白酶（美國Promega公司，批號：00001807271）；NH4HCO3（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150119）；龜甲膠對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121693-201301）；龜甲膠樣品選自本實驗室檢測過程中發(fā)現(xiàn)的不合格樣品，其龜甲膠特征肽含量較低，但未被檢測出牛皮元和驢皮元成分，共計4批。另加一組龜甲膠標準品作為對照。

2 方法

2.1 液相條件

流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，進行梯度洗脫（0-2 min，5%B→20%B；2-4 min，20%B→50% B；4-6 min，50%B→99%B；6-7 min，99%B；7-10 min， 99%B→5%B；10-11 min，5%B）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40℃；進樣量為1 μL。

2.2 質譜條件

離子化模式為ESI+，毛細管電壓為3 kV，錐孔電壓為40 V，除溶劑溫度為450℃，除溶劑氣體為600 L·h-1。離子源溫度為120℃。對龜甲膠特征離子m/z 631.3→546.2、牛皮元特征肽離子m/z 641.3→726.3、驢皮元特征肽離子m/z 539.8→612.5、新阿膠特征肽離子m/z 925.4→832.6進行質譜分析，采集方式為MS/MS，采集時間11 min，掃描范圍100-1500 amu，掃描時間為0.2 s。錐孔電壓為40 V，碰撞能量為25 V。碰撞氣體為高純氬氣。

2.3 樣品處理

取龜甲膠樣品（其龜甲膠特征肽成分含量偏低，且不含牛皮元和驢皮元成分）4批，各批樣品均稱取0.1 g，分別置于50 mL量瓶中，加1%NH4HCO3溶液溶解并定容至刻度，過0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液100 μL，加胰蛋白酶溶液（取序列分析純胰蛋白酶適量，加1% NH4HCO3溶液溶解，制成每1 μL中含1 μg胰蛋白酶的溶液）10 μL，搖勻，37℃恒溫酶解12 h，得供試品溶液1-4。

2.4 對照品溶液制備

稱取龜甲膠標準品0.1 g，置于50 mL量瓶中，處理方法同“2.3”，制得對照品溶液。

3 結果與分析

3.1 試驗結果

4批龜甲膠樣品中均可檢測到龜甲膠特征肽離子m/z 631.3→546.2信號，但積分偏低，未檢測到牛皮元特征肽離子m/z 641.3→726.3和驢皮元特征肽離子m/ z 539.8→612.5信號，均檢測到新阿膠特征肽離子m/z 925.4→832.6信號，試驗結果見表1，新阿膠特征肽m/z 925.4→832.6和龜甲膠特征肽m/z 631.3→546.2質譜提取離子峰見圖1。新阿膠特征肽離子MS/MS裂解規(guī)律與文獻報道一致[7]，該特征肽段的氨基酸序列為GEPGPTGVQGPPGPAGEEGK（圖2）。

3.2 方法學考察

3.2.1 精密度試驗

取龜甲膠樣品1，按“2.3”項下方法制得供試品溶液，以新阿膠特征肽離子m/z 832.6和龜甲膠特征肽子離子m/z 546.2作為選擇離子進行檢測，連續(xù)測定6次，新阿膠特征肽離子m/z 832.6的保留時間分別為2.71、2.69、2.71、2.71、2.71、2.71 min，平均值為2.70 min，RSD為0.30%（n=6）；龜甲膠特征肽子離子m/z 546.2的保留時間分別為2.97、2.95、2.97、2.97、2.97、2.97 min，平均值2.97 min，RSD為0.28%（n=6），表明本方法精密度良好。

3.2.2 穩(wěn)定性試驗

取龜甲膠樣品1制得的供試品溶液，以新阿膠特征肽離子m/z 832.6和龜甲膠特征肽子離子m/z 546.2作為選擇離子進行檢測，分別于0、2、4、6、8、10 h測定，結果2個特征峰均可被檢出，新阿膠特征肽m/z 832.6的保留時間分別為2.71、2.71、2.75、2.71、2.75、2.71 min，平均值為2.72 min，RSD為0.77%；龜甲膠特征肽子離子m/z 546.2的保留時間分別為2.97、2.97、2.99、2.95、2.99、2.95 min，平均值為2.97 min，RSD為0.60%，說明供試品溶液在10 h內(nèi)均可滿足定性需要。

3.3 討論

豬皮的來源豐富，且價廉易得，常被不良商家作為原料用于生產(chǎn)名貴膠類產(chǎn)品以牟取暴利。同時，從一些宗教信仰層面考慮，原料中摻雜了豬皮的膠類產(chǎn)品在消費和使用方面會受到一定的限制，對膠類制劑中新阿膠成分的檢測顯得十分必要?，F(xiàn)行的藥典標準利用LC-MS技術對龜甲膠中龜甲膠特征肽的檢測只限于定性而沒有定量要求，其補充批件中只對牛皮元和驢皮元有定性和定量要求，均未涉及對豬皮元成分的檢測項目，因此在一定程度上存在不足。在對龜甲膠的實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)，有部分不合格產(chǎn)品中雖可被檢出龜甲膠特征肽，但含量偏低，且未被檢出牛皮元和驢皮元成分。因此，應該考慮此類龜甲膠樣品的生產(chǎn)原料中可能摻雜了除牛皮和驢皮以外的其他動物甲殼或皮革。根據(jù)文獻報道[15]，由豬皮熬制的新阿膠的酶解產(chǎn)物中含有特征肽段GEPGPTGVQGPPGPAGEEGK、GETGPAGPAGPVGPVGAR和TGETGASGPPGFAGEK，利用LC-MS技術對此類特征肽進行分析，可從膠類制劑中檢測出是否含有豬皮元成分。鑒于以上分析，一方面建議龜甲膠檢測項目中除對龜甲膠特征肽的定性要求外，應該增設其定量標準；另一方面建議龜甲膠檢測項目中還應增設對新阿膠成分的檢測項目。

本試驗選定新阿膠酶解產(chǎn)物中含有的特征肽段離子m/z 925.4進行MS/MS質譜分析，在選擇液相條件時發(fā)現(xiàn)，與藥典中55 min梯度洗脫時間相比，由于本試驗選用的色譜柱為ACQUITY UPLC-BEHC18（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），將梯度洗脫時間縮短至11 min，同樣取得了很好的試驗結果。新阿膠胰蛋白酶水解產(chǎn)物中除特征肽離子m/z 925.4外，m/z 774.3和m/z 739.8應該同樣可以作為檢測膠類制劑中是否含有豬皮元成分的指標，該方案雖在本研究中未被應用，但將會在后續(xù)研究中重點考察。本研究利用UPLC-ESI-QTOF-MS/MS技術，針對新阿膠酶解產(chǎn)物所含特征肽段離子m/z 925.4進行分析，檢測龜甲膠中是否摻雜豬皮元成分，本方法專屬性強，靈敏度高，可作為現(xiàn)行龜甲膠檢測項目的有力補充。

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現(xiàn)在的公司，更多的注重生產(chǎn)，產(chǎn)品的生產(chǎn)力成為一個企業(yè)發(fā)展的重要依據(jù)，因此，更多的企業(yè)對技術工人的重視程度越來越高，會計專業(yè)的難度，也造成了會計人才的稀缺，高工資高待遇往往出現(xiàn)在大型企業(yè)中，中小企業(yè)無力與其競爭，這些問題導致了很多企業(yè)的財務管理隊伍不成熟，甚至人員都不健全，企業(yè)發(fā)展離不開財務管理，管理者一定要重視財務管理隊伍建設，加大投入，只有將財務工作做好，公司才能合理的依據(jù)盈虧情況對今后的發(fā)展進行規(guī)劃，當今社會，人才是最重要的，重視財務管理隊伍建設，為公司今后的發(fā)展奠定良好的基礎。

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Identification of Pig-Hide Gelatin from Tortoise-Shell Glue by UPLC-ESI-QTOF-MS/MS

Tang Min1,Yan Jianye1,2,Xu Bo1,Zhao Xiaofang1,Li Shunxiang1,2
(1.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China;2.Hunan Province Engineering Research Center of Bioactive Substance Discovery of TraditionalChinese Medicine,Changsha 410208,China)

This study aimed at identifying pig-hide gelatin from tortoise shell glue using ultra-performance liquid chromatography-electrospray-time of flight mass spectrometry(UPLC-ESI-QTOF-MS/MS).The samples of tortoise shell glue were digested by trypsin before the analysis on UPLC coupled with QTOF mass spectrometry.The ions at m/z 925.4 were selected as the marker peptides of pig-hide gelatin.It was found that the test results of the ions at m/z 925.4 were positive in the samples with low contents of the marker peptides of tortoise shell glue,indicating the existence of pig-hide gelatin.However,the result of bovine-hide gelatinordonkey-hide gelatin was negative,while negative results were detected in tortoiseglue standard.The finding was in conformity with previous references over the fragmentation regularity of MS/MS.In conclusion,the method can be adopted to identifying the pig-hide gelatin from tortoise shell glue and applied to the quality control of tortoise shell glue with high specificity and sensibility.

Ultra-performance liquid chromatography-electrospray-time of flight mass spectrometry,pig-hide gelatin, tortoise shell glue,peptide

10.11842/wst.2017.02.024

R283.3

A

（責任編輯：陳 寧，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-13

修回日期：2016-12-10

＊ 國家中醫(yī)藥管理局“藥用植物學”重點學科課題（國中醫(yī)藥發(fā)[2009]30號），負責人：李順祥；湖南省教育廳“中藥學”重點學科（湘教通[2011]76號），負責人：李順祥；湖南省教育廳高?？萍紕?chuàng)新團隊（湘教通[2010]212號），負責人：李順祥。

＊＊ 通訊作者：李順祥，本刊編委，博士，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥成分與資源研究。