張瑋瑋，楊慧霞

（寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏銀川 750021）

專論與綜述

基于磁性納米載體的固定化脂肪酶在生物柴油中的應(yīng)用研究進(jìn)展

張瑋瑋，楊慧霞

（寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏銀川 750021）

由于化石燃料的全球性短缺和日益嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，固定化脂肪酶在制備生物柴油中的應(yīng)用研究已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)。磁性納米載體不僅具有納米尺寸的特性，而且易于從反應(yīng)體系中分離，在固定化酶領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注。本文綜述了國(guó)內(nèi)外基于磁性納米載體的固定化脂肪酶在生物柴油轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究進(jìn)展，并結(jié)合綠色高效生物催化過(guò)程的發(fā)展要求對(duì)新型磁性固定化脂肪酶的研究方向及發(fā)展前景提出了展望。

脂肪酶；固定化；磁性納米載體；生物柴油

近年來(lái)，由于化石燃料的全球性短缺，以及由化石燃料產(chǎn)生的大量溫室氣體帶來(lái)的日益加劇的環(huán)境壓力（溫室效應(yīng)、臭氧空洞、霧霾天氣等），使得全球都面臨著嚴(yán)峻的能源危機(jī)和環(huán)境挑戰(zhàn)。生物柴油是由一系列脂肪酸烷基酯（FAAEs）組成的混合物，可以由植物油，動(dòng)物脂肪或餐廳食用廢棄油與醇類的酯交換反應(yīng)而得到，相對(duì)安全，無(wú)毒，可生物降解。作為一種可再生的替代能源，與化石燃料相比產(chǎn)生較少的空氣污染物，是目前一種重要的新型替代燃料，已經(jīng)獲得越來(lái)越多的關(guān)注[1，2]。目前全球的生物柴油供應(yīng)幾乎全部來(lái)源于堿或酸催化的化學(xué)催化過(guò)程。雖然化學(xué)催化的酯交換過(guò)程具有反應(yīng)時(shí)間短和產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)，但是同時(shí)也存在若干不可避免的缺點(diǎn)，例如較高的能量需求，催化劑和甘油的回收困難，以及對(duì)環(huán)境的潛在污染等[3]。因此，高效綠色的制備生物柴油燃料替代化石燃料的方法正吸引全球越來(lái)越多的關(guān)注。而脂肪酶催化的酯交換過(guò)程由于其良好的轉(zhuǎn)化率，溫和的反應(yīng)條件和相對(duì)簡(jiǎn)單的產(chǎn)物及副產(chǎn)物的提純步驟等突出優(yōu)勢(shì)，在生物柴油生產(chǎn)中有重要的應(yīng)用潛力[1，4]。

然而，從經(jīng)濟(jì)角度來(lái)說(shuō)，酶催化過(guò)程在工業(yè)規(guī)模上的應(yīng)用仍然存在較大的挑戰(zhàn)，包括催化效率，操作穩(wěn)定性，可回收性等。同時(shí)，酶的高成本，也將不可避免地增加工業(yè)生產(chǎn)的成本和能量消耗。酶的固定化技術(shù)可以有效地提高酶的催化性能和操作穩(wěn)定性，并降低其制造成本，而成為一種廣泛使用的技術(shù)[5，6]。脂肪酶的固定化技術(shù)可以提高生物柴油的生產(chǎn)量和效率。大大提高了生物柴油在未來(lái)的經(jīng)濟(jì)可行性。與游離的脂肪酶相比，固定化脂肪酶在生物柴油轉(zhuǎn)化反應(yīng)中有許多優(yōu)勢(shì)，例如固定化酶便于從反應(yīng)體系中分離，可以回收進(jìn)行連續(xù)操作，以及簡(jiǎn)單的產(chǎn)品純化過(guò)程等。盡管經(jīng)過(guò)固相載體固定化的酶可以通過(guò)簡(jiǎn)單過(guò)濾從反應(yīng)體系中分離，但與游離的酶相比，反應(yīng)底物和產(chǎn)物在酶分子內(nèi)部的擴(kuò)散，仍然存在傳質(zhì)阻力的影響而導(dǎo)致催化效率較低。納米材料作為固定化酶載體的應(yīng)用則可以避免傳質(zhì)阻力的影響。然而，基于納米材料固定化酶由于載體尺寸太小難以從反應(yīng)體系中分離。隨著磁性納米載體的不斷研究可以很好地解決上述兩方面問(wèn)題。由于磁性納米載體比表面積大、飽和磁矩高、表面易功能化修飾、具有良好的磁導(dǎo)向性、生物相容性、生物降解性，可以結(jié)合多種生物功能分子，且通過(guò)外加磁場(chǎng)很容易從反應(yīng)體系中分離出來(lái)，因此被廣泛應(yīng)用于不同方法制備的固定化脂肪酶領(lǐng)域[7-9]。

目前常見(jiàn)的固定化方法可以分為以下四大類方法：物理吸附法、包埋法、共價(jià)偶聯(lián)法和交聯(lián)法。而根據(jù)其作用方式的不同，又可以分為物理法和化學(xué)法。本文對(duì)近幾年在固定化脂肪酶催化的生物柴油研究進(jìn)行了一個(gè)系統(tǒng)的分類，并闡述了磁性載體的結(jié)構(gòu)及固定化方法的選擇對(duì)脂肪酶在催化生物柴油反應(yīng)中的活性差異的影響。

1 物理法

磁性納米粒子之間存在的磁引力使其易于聚集而影響載體的分散性能，且在空氣中容易發(fā)生氧化，因此常常使用其他試劑對(duì)磁性離子表面進(jìn)行修飾，形成核殼結(jié)構(gòu)。一方面減少磁性納米粒子的氧化和聚集，一方面提高酶的負(fù)載率，是當(dāng)前廣泛使用的保護(hù)方法。

物理吸附是通過(guò)氫鍵、疏水性相互作用和π-電子親和力等物理作用力將酶分子固定在不溶性載體上的一種固定化方法，是最簡(jiǎn)單的酶固定方法。對(duì)于脂肪酶來(lái)說(shuō)，疏水作用通常是最常見(jiàn)的作用方式。由于脂肪酶比起其他種類的蛋白質(zhì)，可以更高效自發(fā)地從水溶液吸附到疏水表面，因此該方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)脂肪酶的純化和固定化[10，11]。有趣的是，吸附在載體上往往會(huì)提高脂肪酶的催化活性[11]。這可能是由于載體與脂肪酶分子間的疏水作用，類似于界面活化現(xiàn)象，促進(jìn)了酶分子結(jié)構(gòu)中“蓋子”的打開(kāi)。

Tran等[12]將從伯克霍爾德菌脂酶（lipase from Burkholderia sp.C20）吸附固定在用二甲基十八烷基［3-（三甲氧基硅基）丙基］氯化銨修飾的磁性納米粒子上催化生物柴油的合成。長(zhǎng)鏈?zhǔn)杷曰鶊F(tuán)的表面修飾促進(jìn)了酶分子的吸附固定化，在橄欖油的甲酯化反應(yīng)中，反應(yīng)30 h可以得到90%的轉(zhuǎn)化率，且可以有效回收10次。

Liu等[13]將lipase from Burkholderia sp.（BCL）吸附固定化在疏水性表面修飾的磁性載體上，在酯交換反應(yīng)中回收6次，活性沒(méi)有明顯降低。同時(shí)采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了固定化酶催化的酯交換反應(yīng)條件制備生物柴油，在最優(yōu)的反應(yīng)條件下，固定化BCL表現(xiàn)出和市售的脂肪酶Novozyme 435相當(dāng)?shù)孽ソ粨Q效率。

物理固定化方法相對(duì)操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件相對(duì)溫和，不影響酶分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心，利于酶的活性保留，但是缺點(diǎn)在于，物理法固定的酶與載體相互作用力弱，酶易從載體上脫落下來(lái)。因此，基于磁性載體的物理固定化酶在生物柴油應(yīng)用中的相關(guān)報(bào)道并不多。

2 化學(xué)法

化學(xué)固定法的反應(yīng)條件較為劇烈，容易引起酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞酶的活性中心，甚至酶的底物專一性等性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，尤其是當(dāng)共價(jià)結(jié)合涉及到酶的活性中心的氨基酸時(shí)，酶的失活較為嚴(yán)重。此外，共價(jià)結(jié)合法是一種不可逆的固定化方法，載體不能回收，操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，以致固定化成本較高[14]。但優(yōu)點(diǎn)是酶與載體的結(jié)合較為牢固，酶分子不易脫落，有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，更利于酶的多次回收使用和工業(yè)化應(yīng)用的拓展。

Wang 等[15]將 lipase of Pseudomonas cepacia（PCL）共價(jià)交聯(lián)在氨基修飾的磁性納米顆粒上，并應(yīng)用于大豆油和甲醇的酯交換反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，經(jīng)過(guò)共價(jià)固定化以后PCL對(duì)甲醇的耐受性顯著提高，反應(yīng) 24 h得到95%的轉(zhuǎn)化率，且回收3次以后轉(zhuǎn)化率沒(méi)有明顯的下降。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將該固定化PCL應(yīng)用于葉輪攪拌的反應(yīng)器中，活性顯著提高，推測(cè)應(yīng)該是充分的攪拌促進(jìn)了反應(yīng)物的混合和擴(kuò)散。

Xie和Wang[16]制備了一種磁性的聚（苯乙烯-co-甲基丙烯酸）微球復(fù)合材料，通過(guò)1-乙基-3-（3-（二甲基氨基）丙基）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDAC）共價(jià)法固定皺褶假絲酵母脂肪酶（CRL）。與游離的CRL相比，經(jīng)過(guò)共價(jià)固定以后的酶熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均有明顯提高，且在大豆油的酯交換生物柴油反應(yīng)中表現(xiàn)出較高的活性。在35℃下反應(yīng)24 h達(dá)到86%的轉(zhuǎn)化率，回收使用4次活性沒(méi)有明顯的降低。

余孝其課題組[17]報(bào)道了一例表面活性劑活化結(jié)合磁性脂肪酶交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）的固定化脂肪酶模型，并將其應(yīng)用在連續(xù)生產(chǎn)生物柴油中。采用3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的磁性納米粒子為載體，與表面活性劑活化的TLL交聯(lián)酶聚集體交聯(lián)。在酶分子沉淀之前加入修飾的磁性納米粒子，既可以作為酶分子沉淀的內(nèi)核，同時(shí)與酶分子發(fā)生交聯(lián)。不但可以避免二次粒子的生成，降低固定化酶結(jié)構(gòu)內(nèi)部的傳質(zhì)阻力，而且可以有效提高交聯(lián)酶聚集體的固定化效率和穩(wěn)定性。在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，生物柴油反應(yīng)得到88%的產(chǎn)率，且回收10次活性幾乎沒(méi)有降低。

介孔二氧化硅作為目前發(fā)展最成熟、研究最透徹的介孔材料具有獨(dú)特的孔道結(jié)構(gòu)，可以提高載體的比表面積和固定化酶的活性及穩(wěn)定性，也可以對(duì)磁性納米粒子進(jìn)行修飾，形成復(fù)合材料來(lái)制備酶固定化載體[18]。Xie等[19]通過(guò)化學(xué)共沉淀法制備得到磁性納米粒子，再通過(guò)stober法在其表面包裹介孔材料MCM-41，從而得到負(fù)載MCM-41的Fe3O4核殼結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)氨基修飾以后的復(fù)合載體，可以通過(guò)戊二醛交聯(lián)，共價(jià)固定褶皺假絲酵母脂肪酶（CRL）。固定化的CRL在大豆油和動(dòng)物油脂的生物柴油反應(yīng)中表現(xiàn)出優(yōu)良的催化活性和選擇性，在5次的回收實(shí)驗(yàn)中活性基本保持不變。同時(shí)MCM-41的負(fù)載不但有效降低了Fe3O4粒子之間的強(qiáng)磁偶極-偶極相互作用，還不影響Fe3O4粒子的飽和磁矩，使得固定化酶可以通過(guò)外加磁場(chǎng)從反應(yīng)體系中快速分離。

固定化酶技術(shù)展示出優(yōu)異的穩(wěn)定性和較高的活性保留，大大提高了反應(yīng)過(guò)程的經(jīng)濟(jì)效益。但固定化過(guò)程也可能會(huì)導(dǎo)致不同程度的酶的失活，且固定化過(guò)程的復(fù)雜程度不同。固定化方法的差異會(huì)得到不同的固定化效果，而且同一種方法也不會(huì)適用于所有的酶。因此，固定化方法的選擇尤為重要。

隨著磁性納米載體研究的不斷深入，磁性復(fù)合材料在固定化酶領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用。利用磁性納米材料良好的生物相容性、大比表面積、且易于表面修飾，易磁性分離便于回收使用的優(yōu)勢(shì)，使得磁性的固定化脂肪酶在生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用中存在巨大潛力，也已經(jīng)取得一定的進(jìn)展。盡管如此，磁性固定化脂肪酶在生物柴油的工業(yè)應(yīng)用中仍存在一些需要進(jìn)一步研究、解決的問(wèn)題：（1）通常磁性納米粒子需要進(jìn)行表面修飾，使得磁性載體的制備相對(duì)復(fù)雜，限制了磁性固定化酶在工業(yè)上的應(yīng)用；（2）現(xiàn)階段關(guān)于磁性固定化脂肪酶在填充床反應(yīng)器中的應(yīng)用研究較少。發(fā)展制備簡(jiǎn)單、高酶活保留、適用性廣、易于大規(guī)模制備的磁性固定化脂肪酶將對(duì)促進(jìn)可持續(xù)和具有成本效益的生物柴油生產(chǎn)的發(fā)展具有重要意義，仍需要進(jìn)一步深入研究。

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Research advances in magnetic nanocarriers immobilized lipase for biodiesel production

ZHANG Weiwei，YANG Huixia
（College of Chemistry&Chemical Engineering，Ningxia University，Yinchuan Ningxia 750021，China）

Due to limited energy reserves and the increasing environmental pressure,the application of immobilized lipase is becoming the hot topic in the field of biodiesel production.Among all types of nanoparticles,magnetic iron oxide nanoparticles have attracted a great deal of attention because of their high specific surface area,which can efficiently improve enzyme loading and be easily recycled using a magnetic field.This review covers recent advances in the recent developments of potential lipase immobilization based on magnetic nanoparticles and their application in biodiesel production.The outlook of lipase immobiliza－tion is also prospected.

lipase；immobilization；magnetic nanoparticles；biodiesel

TE667

A

1673-5285（2017）12-0001-04

10.3969/j.issn.1673-5285.2017.12.001

2017－11-22

寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：NZ1645；寧夏高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：NGY2017045；寧夏青年科技人才托舉工程項(xiàng)目資助；寧夏大學(xué)引進(jìn)人才項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：BQD2015012。

張瑋瑋，女（1987－），講師，博士研究生，主要研究方向?yàn)樯锎呋吧镔|(zhì)轉(zhuǎn)化，郵箱：zhangww@nxu.edu.cn。