張曉東+姚芳

[摘要]目的 通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）建立結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中利福霉素鈉的測定方法。方法 采用XTerraRMS C18色譜柱（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm），以醋酸銨（0.01 mol/L）-甲醇（10∶90）為流動相，流速為0.4 ml/min。經(jīng)HPLC分離，以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）測定。結(jié)果 本方法在0.4～4.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好（r=0.9997）；檢出限為100 ng/ml。結(jié)論 本方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于結(jié)核患者腦脊液中利福霉素鈉含量測定。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；結(jié)核性腦膜炎；腦脊液；利福霉素鈉

[中圖分類號] R969 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（b）-0012-03

[Abstract]Objective To establish a method for determination Rifamycin sodium in the cerebrospinal fluid of patients with tuberculous meningitis by HPLC-MS/MS.Methods Column was XTerraRMS C18（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）.Mobile phase was Ammonium acetate （0.01 mol/L）-Methanol（10：90）.Flow rate was 0.4 ml/min.Multiple reaction monitoring（MRM） was used by HPLC.Results The linear ranges of 0.4-4.0 μg/ml （r=0.9997） was better；Detection limit was 100 ng/ml.Conclusion The method is simple，rapid，accurate，and it can be used for therapeutic drug monitoring.

[Key words]HPLC-MS/MS；Tuberculous meningitis；Cerebrospinal fluid；Rifamycin sodium

結(jié)核病，又稱癆病，是一種古老的傳染病，它曾在世界范圍廣泛流行，并奪取數(shù)億人的生命。自1944年發(fā)現(xiàn)鏈霉素對結(jié)核分枝桿菌有效及1962年利福霉素應(yīng)用于臨床以來，異煙肼等大量抗結(jié)核藥物的出現(xiàn)，開創(chuàng)了以利福霉素、利福平、異煙肼為主的結(jié)核化療時代，并使流行得到了一定的控制。結(jié)核性腦膜炎（tubercular meningitis，TBM）是由于結(jié)核分枝桿菌感染所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，是結(jié)核病中最嚴(yán)重的一種，若治療不及時，可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，最終引起患者死亡或遺留嚴(yán)重后遺癥[1]。

治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM）是應(yīng)用現(xiàn)代分析技術(shù)測定患者體液中的藥物及其代謝產(chǎn)物濃度，以優(yōu)化設(shè)計或調(diào)整給藥方案，以實現(xiàn)個體化治療，提高療效，減免毒副作用的藥學(xué)技術(shù)方法[2]。TDM是近代臨床藥物治療劃時代的重大進展之一，也是結(jié)核化療中的一個新的發(fā)展方向。血藥濃度監(jiān)測只是TDM的一個重要組成部分。本課題擬建立測定抗結(jié)核藥物利福霉素在TBM患者腦脊液中濃度的方法并進行分析，制訂合理的給藥方案，以避免藥物過量引起的不良反應(yīng)及藥物不足導(dǎo)致的治療失敗，也為今后其他項目（尿藥濃度、痰藥濃度、胸腹水藥物濃度等）的TDM工作提供依據(jù)。

1儀器與材料

質(zhì)譜儀：美國AB公司API3200LC-MS/MS質(zhì)譜儀；液相色譜儀：日本島津公司LC-20A型高效液相色譜儀，大氣壓化學(xué)電離源[3]；流動相為醋酸銨（0.01 mol/L）-甲醇（10∶90），醋酸銨、甲醇為色譜純，利福霉素鈉為標(biāo)準(zhǔn)品。

2方法與結(jié)果

2.1分析條件

2.1.1液相色譜條件 色譜柱：沃特世公司C18柱，標(biāo)準(zhǔn)：4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm；流動相：0.01 mol/L的醋酸銨-甲醇（10∶90）；流速：0.4 ml/min；柱溫：室溫。

2.1.2質(zhì)譜條件 減簇電壓（DP）：95 V；碰撞室入口電壓（CEP）：20 V；Q1入口電壓（EP）：8.0 V；碰撞室出口電壓（CXP）：20 V；離子源電壓（IS）：5500 V；碰撞電壓（CAD）：8.0 V；離子源：APCI，ESI；掃描方式：正離子掃描；溫度（TEM）：500℃；氣簾氣（CUR）：20 psi；GS1：50 psi；GS2：50 psi；MRM：719.9/688.2，CE：35 V；MRM：719.9/660.1，CE：40 V；MRM：719.9/295.0，CE：62 V[4-6]。

2.2溶液制備

2.2.1利福霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液制備 稱取利福霉素鈉對照品0.010 03 g，置100 ml量瓶中，配制為100.3 μg/ml的溶液。

2.2.2利福霉素鈉工作溶液制備 取利福霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液， 置10 ml量瓶中，加甲醇-水（50∶50）溶液稀釋至刻度，搖勻，得10.03 μg/ml的工作溶液。取10.03 μg/ml的利福霉素鈉工作溶液1 ml置100 ml量瓶中，加甲醇-水（50∶50）溶液稀釋至刻度，搖勻，得100.3 ng/ml的工作溶液。

2.3樣品的來源和制備

2.3.1樣品的來源 TBM患者腦脊液：2016年1～6月在內(nèi)蒙古第四醫(yī)院住院的TBM患者，住院期間行腰椎穿刺術(shù)取腦脊液。

2.3.2樣品的制備 取患者腦脊液1 ml置15 ml塑料離心管中，精密加甲醇-水溶液（50∶50）4 ml，渦旋3 min，溶液經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過濾后，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定[7]。

2.4 LC-MS/MS的條件

2.4.1 LC-MS/MS的條件選擇 篩選不同的液相色譜柱及色譜、質(zhì)譜條件[8-11]，最后確定為“2.1”項下的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件檢測利福霉素鈉，應(yīng)用“2.1”項下的色譜-質(zhì)譜條件進行分析。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 取2 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進樣1、2、4、5、6、8、10 μl，用“2.1”項下的LC-MS/MS條件進行測定，得到定量離子對719.9/688.2的峰面積。以測定濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)與峰面積（Y，counts）為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析，線性方程為Y=5.22e+004X-1.52e+003（r=0.9997）。結(jié)果見表1、圖1，提示利福霉素鈉在0.4～4.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3檢測限 將100 ng/ml的利福霉素鈉工作溶液進樣5 μl，得信噪比S/N=3.6，該方法的檢出限為100 ng/ml。

2.4.4精密度試驗 將利福霉素鈉制成0.4 g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，分別通過“2.1”項下的方法檢測，得到的峰面積分別為19 754、18 965、20 038、18 997、19 765、18 661（RSD=2.9%），方法精密度較好。

2.4.5穩(wěn)定性試驗 將0.8 μg/ml的利福霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于0、1、4、8、12、24 h分別進樣5 μl。采用上述液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件進行分析，得到峰面積分別為38 970、41 120、40 665、38 385、38 100、36 919（RSD=4.1%），顯示利福霉素鈉在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6實際樣品的測定試驗 以時間（min）為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)濃度（cps）為縱坐標(biāo)，分別做陰性對照色譜圖及利福霉素鈉對照品色譜圖，分別見圖2、3，應(yīng)用本方法測定6例不同TBM患者腦脊液中利福霉素鈉的量分別為0.51、0.43、0.40、0.68、0.35、0.28 μg/ml。

3討論

利福霉素為半合成的廣譜抗菌素，它對分枝桿菌，特別是對結(jié)核菌有強力的抑菌作用。利福霉素行靜脈注射或局部應(yīng)用效果較好，口服幾乎不能達到有效的血藥濃度；藥代動力學(xué)方面，單次靜脈滴注利福霉素鈉0.5、1.0、2.0 g后的血藥峰濃度（Cmax）分別為28、46、90 mg/L，1 h后即下降至50%左右。每6小時靜注利福霉素鈉0.5 g，穩(wěn)態(tài)血藥濃度為36 mg/L。血漿蛋白結(jié)合率<5%。血液消除半衰期（t1/2）為3～5 h[12]。該藥在腦脊液中的分布情況及濃度少見詳細報道，希望通過該項研究，彌補腦脊液中利福平、利福霉素藥物濃度測定的不足，為進一步研究血液、腦脊液中藥物代謝情況提供技術(shù)支持[13]。

同時，利福霉素的殺菌能力與藥物在病灶區(qū)域的濃度有密切關(guān)系，但其具有肝臟毒性、胃腸功能紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、血小板減少癥和變態(tài)反應(yīng)等嚴(yán)重的毒副作用[14]。因此，本課題通過監(jiān)測生物體液中藥物的濃度，以達到最佳治療效果，并盡量減少毒副作用，具有重要的臨床意義。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在分析藥物及其在各種復(fù)雜生物基質(zhì)（全血、血漿、尿、膽汁及生物組織）中的代謝產(chǎn)物時，由于其選擇性強、靈敏度高，不僅可以避免復(fù)雜、繁瑣、耗時的樣品前處理工作，而且能分離鑒定以往難于辨識的痕量藥物代謝產(chǎn)物，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）的應(yīng)用，通過多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），可以大大提高分析的專一性，改善信噪比，提高靈敏度，從而快速、方便地解決問題[15]。

本研究采用液質(zhì)聯(lián)用的方法對TBM患者腦脊液中利福霉素進行檢測，具有方法靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。腦脊液中藥物濃度監(jiān)測只是TDM中的一個重要組成部分。本課題通過建立結(jié)核藥物監(jiān)測的方法并進行藥動學(xué)分析，以制訂合理的給藥方案，為今后其他藥物治療學(xué)監(jiān)測工作提供依據(jù)。

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（收稿日期：2016-12-23 本文編輯：方菊花）

[基金項目]內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生計生科研計劃項目（2013 03027）