王 玉 劉 靜 薛亞東 田 靜

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枸地氯雷他定對小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎中Th1/Th2的影響

王 玉 劉 靜 薛亞東 田 靜

目的： 明確枸地氯雷他定對變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)小鼠耳廓腫脹程度的抑制作用以及對Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響。方法： 建立ACD小鼠模型，觀察口服不同劑量(1 mg/kg，2 mg/kg，3 mg/kg，4 mg/kg)枸地氯雷他定對ACD小鼠耳廓腫脹的抑制作用(應(yīng)先造模，后飼藥物)，采用ELISA 法檢測小鼠血清中IL-4、IFN-γ,TNF-α的水平。結(jié)果： 口服各劑量枸地氯雷他定均能明顯抑制ACD小鼠的耳廓腫脹程度， 且具有劑量依賴性。模型組血清IFN-γ,IL-4,TNF-α水平明顯高于正常對照組(P<0.01)，藥物干預(yù)后血清IFN-γ,IL-4,TNF-α水平呈劑量依賴性下降。結(jié)論： 枸地氯雷他定可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ,IL-4,TNF-α水平對ACD小鼠的治療發(fā)揮作用。

枸地氯雷他定； 變應(yīng)性接觸性皮炎； 干擾素γ; 腫瘤壞死因子α; 白介素4

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)，是一種常見、具有高度遺傳傾向的瘙癢性皮膚病。通常與過敏性鼻炎和哮喘等過敏性疾病相關(guān)。其特征是皮膚干燥、瘙癢劇烈，反復(fù)發(fā)作。可因感染、精神壓力、氣候變化、刺激物和過敏原等因素而加重。瘙癢常夜間加重，導(dǎo)致睡眠不足，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。近年來，有關(guān)AD 的基礎(chǔ)和臨床研究日益深入，研究表明本病與免疫失調(diào)有密切關(guān)系，存在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)異常等[1]。細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡可能是發(fā)病機(jī)制中的重要組成部分。在疾病狀態(tài)下，Th1/Th2的動(dòng)態(tài)平衡被打破，偏向于Th1優(yōu)勢應(yīng)答或 Th2優(yōu)勢應(yīng)答，與自身免疫病、過敏性疾病、腫瘤、移植排斥反應(yīng)以及感染性疾病的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系。本研究通過構(gòu)建變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)小鼠模型，檢測枸地氯雷他定喂食前后干預(yù)小鼠Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子(IL-4、IFN-γ,TNF-α)水平的變化情況，觀察其是否可能通過干預(yù)細(xì)胞合成及分泌環(huán)節(jié)，影響Th1/Th2細(xì)胞的平衡。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只7周齡SPF級雌性Balb/c小鼠，體重17～19 g，購自于維通利華(許可證號：SCXK(京)2006-0009)。飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，期間自由飲水、攝食，環(huán)境溫度控制在(23±3)℃，濕度控制在40%～70%。為了確保統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的有效性，在實(shí)驗(yàn)分組中每個(gè)實(shí)驗(yàn)組有8只小鼠。

1.2 主要試劑 2,4-二硝基氟苯(DNF，西亞試劑，分析純)，丙酮(上海高東化工實(shí)業(yè)有限公司，分析純)， 枸地氯雷他定(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)廣州海瑞藥業(yè)有限公司)，IL-4、IFN-γ,TNF-α(武漢博士德生物工程有限公司)，氯化鈉(北京化學(xué)試劑公司，分析純)

1.3 儀器設(shè)備 分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)，微量進(jìn)樣針(上海安亭微量進(jìn)樣器廠)，SIGMA 1-14小型臺(tái)式離心機(jī)(德國SIGMA公司)一次性無菌注射器(1 mL，常州市遠(yuǎn)東醫(yī)療器械有限公司)

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠ACD模型的建立 用DNFB丙酮橄欖油溶液(丙酮-橄欖油4∶1)致敏和激發(fā)小鼠皮膚建立小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)模型。Balb/c小鼠正常飼養(yǎng)與SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)1周，于實(shí)驗(yàn)前1天在腹部用脫毛膏脫毛，范圍約3 cm×3 cm，實(shí)驗(yàn)第1天脫毛部位用微量進(jìn)樣針均勻涂以1% DNFB丙酮橄欖油溶液50 μL致敏，實(shí)驗(yàn)第2天重復(fù)強(qiáng)化致敏1次。實(shí)驗(yàn)第7天，小鼠右耳滴涂1 % DNFB丙酮橄欖油溶液10 μL進(jìn)行激發(fā)，左耳滴涂丙酮橄欖油(丙酮-橄欖油4∶1)溶液10 μL作為對照?？瞻捉M在相同部位僅涂以丙酮橄欖油溶液(4∶1)10 μL作對照。誘發(fā)后24小時(shí)鼠耳出現(xiàn)明顯的紅斑、腫脹，認(rèn)為建模成功。

1.4.2 分組及給藥 將48只小鼠按體重隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為空白組、模型組、治療組(枸地氯雷他定1，2，3，4 mg/kg)，小鼠按上述分組方法于致敏后每日灌胃受試物0.2 mL，模型組給予等體積的生理鹽水。造模成功并采集數(shù)據(jù)后，各組動(dòng)物以摘眼球法取血，收集血液于EDTA 抗凝管中，2000 r/min，離心15 min， 取血清于-70℃ 冰箱保存用于細(xì)胞因子檢測。隨后頸椎脫臼處死，取下小鼠雙耳于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4.3 耳厚度差 在激發(fā)后24 h以游標(biāo)卡尺測量小鼠雙側(cè)耳中部的厚度，計(jì)算誘發(fā)后左右耳厚度差。

1.4.4 細(xì)胞因子水平分析 ELISA檢測：用ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書檢測血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平，分析治療前后細(xì)胞因子水平的變化情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 小鼠ACD模型的建立 激發(fā)24 h后，模型組小鼠耳腫脹度明顯，空白組小鼠耳部幾乎不腫脹。模型組與空白組有顯著性差異(P<0.01)。見圖1。

圖1 模型組小鼠耳腫脹度

2.2 枸地氯雷他定對小鼠耳腫脹度的影響 見表1。小鼠耳部激發(fā)24 h后模型組小鼠耳腫脹度明顯(P<0.01)。與模型相比，不同劑量的枸地氯雷他定不同程度地抑制了小鼠耳腫脹程度，其中高劑量組與模型組有顯著性差異(P<0.05)。表明枸地氯雷他定能夠減輕小鼠ACD模型耳腫脹度，且具有劑量依賴性。

表1 枸地氯雷他定對小鼠耳腫脹度的影響mm

注：☆P<0.01 vs空白對照組；*P<0.05 vs模型組；n=8

2.3 枸地氯雷他定對過敏性接觸性皮炎模型小鼠血清細(xì)胞因子的影響 采用ELISA法檢測血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平，模型組和正常對照組比較，血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平有明顯的升高(P<0.01)。藥物干預(yù)后血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平呈劑量依賴性下降趨勢，表明枸地氯雷他定能夠減輕小鼠ACD模型血清IFN-γ、IL-4、TNF-α等炎癥因子的改變。見表2。

表2 枸地氯雷他定對ACD模型小鼠血清細(xì)胞因子的影響 pg/mL

注：☆P<0.01 vs空白對照組；*P<0.01 vs模型組；n=8

3 討論

研究表明在AD中存在著多層次T細(xì)胞活化和廣泛的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，Th細(xì)胞是細(xì)胞因子的重要來源，所分泌的細(xì)胞因子被分為兩大類：Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞主要分泌TNF-α、IFN-γ、IL-12,Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等。Th1、Th2型細(xì)胞發(fā)揮著不同的功能，在機(jī)體免疫中起不同作用。Th1細(xì)胞與遲發(fā)型超敏反應(yīng)性T細(xì)胞(TDTH細(xì)胞)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的增殖、分化、成熟有密切關(guān)系，可增強(qiáng)殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，激發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2型細(xì)胞與B細(xì)胞的增殖、成熟和抗體生成有關(guān)，可增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。這兩類細(xì)胞因子的作用不同，且通常相互對抗。在疾病狀態(tài)下，Th1/Th2的動(dòng)態(tài)平衡被打破，偏向于Th1優(yōu)勢應(yīng)答或Th2優(yōu)勢應(yīng)答，與自身免疫病、過敏性疾病等的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系。目前AD被認(rèn)為主要是由Th2細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)所致，IL-4刺激和活化B細(xì)胞,刺激T細(xì)胞增殖及促進(jìn)IgG向IgE類型轉(zhuǎn)化,因而是Th2型最具代表性的細(xì)胞因子，IFN-γ主要由活化的Th1亞群產(chǎn)生,被認(rèn)為是促使T輔助細(xì)胞向Th1分化的始動(dòng)因素，大量的IFN-γ能夠刺激皮膚常駐細(xì)胞如角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子，從而引起外周炎性細(xì)胞對表皮和真皮的浸潤。枸地氯雷他定屬于第三代抗組胺藥物，為地氯雷他定與枸櫞酸氫二鈉結(jié)合形成，由于水溶性提高， 能在體內(nèi)快速分解為地氯雷他定而起作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示枸地氯雷他定除具有高效的抗過敏作用外，人體藥代動(dòng)力學(xué)研究表明枸地氯雷他定血藥濃度達(dá)峰更快[3，4]。能選擇性地拮抗外周H1受體，抑制肥大細(xì)胞釋放組胺，同時(shí)還能有效抑制炎癥初期及進(jìn)展期多個(gè)環(huán)節(jié)炎性介質(zhì)及其釋放，減少嗜酸粒細(xì)胞趨化。

本研究通過在實(shí)驗(yàn)小鼠腹部脫毛并使用DNFB丙酮橄欖油溶液反復(fù)刺激，成功建立小鼠ACD模型，進(jìn)一步研究了枸地氯雷他定對模型耳部紅腫程度，血清炎性細(xì)胞因子水平的影響，結(jié)果顯示枸地氯雷他定能夠減輕模型耳部腫脹度和抑制模型皮膚水腫形成。血清IFN-γ，IL-4,TNF-α細(xì)胞因子檢測顯示誘發(fā)后血清IFN-γ，IL-4,TNF-α水平均明顯升高，枸地氯雷他定各劑量組對IFN-γ，IL-4,TNF-α均有明顯抑制作用,大量的IFN-γ能夠刺激皮膚常駐細(xì)胞如角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和趨化因子，從而引起外周炎性細(xì)胞對表皮和真皮的浸潤，枸地氯雷他定明顯降低血清IFN-γ水平，從而減少了皮膚炎癥因子的級聯(lián)反應(yīng)。從給藥前后各細(xì)胞因子變化的比值來看，模型組的比值低于正常，提示Th2細(xì)胞占優(yōu)勢，給藥治療后比值上升，提示Th1型逐漸占優(yōu)勢。出現(xiàn)這種變化趨勢的可能原因是：在ACD發(fā)展過程中I型和II型T細(xì)胞因子在病變的不同時(shí)期交互出現(xiàn)，有時(shí)相互促進(jìn)，有時(shí)相互抑制。Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡或偏移，可能取決于抗原的特性、接觸途徑、劑量和頻率，并影響著ACD損傷的急、慢性發(fā)展。本研究中用化學(xué)物質(zhì)引起的ACD是典型的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，過敏個(gè)體之所以呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞因子反應(yīng)模式可能與致敏原在致敏和激發(fā)過程的接觸途徑有關(guān)，也可能是不同的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)Th1或Th2型細(xì)胞因子表達(dá)，或兩者協(xié)同表達(dá)的能力不同?；瘜W(xué)品誘導(dǎo)的ACD可能不單純是典型的IV型變態(tài)反應(yīng)，致敏化學(xué)品的刺激特性與過敏特性共存在ACD發(fā)展過程中的作用也很重要。

[1] 吳忠,李宏.特應(yīng)性皮炎的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制[J].中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志,2008,4(2):291-296.

[2] Tworek D, Bochenska-Marciniak M, Kupczyk M, et al. The effect of weeks treatment with desloratadine (5mg daily) on levels of interleukin (IL)-4, IL-10, IL-18 and TGF beta in patients suffering from seasonalAllergic rhinitis[J]. Pulm Pharmacol Ther,2007,20(3):244-249.

[3] Bachert C, van Cauwenberge P. Desloratadine for intermittent and persistent allergic rhinitis:a review[J]. Clin Ther,2007,29(9):1795-1802.

[4] Reinartz SM, Overbeek SE, Klejnjan A, et al. Desloratadin treatment reduces systemic allergic inflammation following nasal allergen provocation in patients with allergic rhinitis and astma[J]. Allergy,2005,60(10):1301-1307.

(收稿：2016-09-14 修回：2016-10-18)

Effects of desloratadine citrate disodium on the Th1/Th2 in mice ACD model

WANGYu,LIUJing,XUEYadong,TIANJing.

TheFirstAffiliatedHospitalofHaerbinMedicalUniversity,Haerbin150001,China

TIANJing,E-mail: 953273917@qq.com

Objective: To determine the effects of desloratadine citrate disodium on the edema degree of ears and the cytokine expression of Th1/Th2 cell in murine allergic contact dermatitis (ACD). Methods: The animal model of allergic contact dermatitis was established and then the inhibition effect of desloratadine citrate disodium in different doses (1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg and 4 mg/kg) on edema degree of ACD was assessed and the expression levels of IFN-γ, TNF-α and IL-4 were detected by ELISA. Results: Desloratadine citrate disodium can reduce the edema degree of ears. The levels of IFN-γ, TNF-α and IL-4 in serum of ACD mice were higher than that in blank controls (P<0.01) and the levels of the three cytokines in serum were all decreased after interfered by desloratadine citrate disodium, with a dose-dependent. Conclusion: Desloratadine citrate disodium is effective in the treatment of allergic contact dermatitis, which may be through regulating the levels of IFN- γ, TNF- α and IL- 4.

desloratadine citrate disodium; ACD; IFN-γ; TNF-α; IL-4

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱,150001

田靜，E-mail: 953273917@qq.com