張傳志 曹洪輝 周 庾 胡曉波 盧衛(wèi)忠 張?zhí)?/p>

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

·研究報告·

淫羊藿苷/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料制備及特性研究*

張傳志 曹洪輝 周 庾 胡曉波 盧衛(wèi)忠 張?zhí)?/p>

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

目的構(gòu)建淫羊藿苷/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料，觀察材料特征和裝載的淫羊藿苷、TGF-β1釋放情況。方法利用乳化交聯(lián)技術(shù)構(gòu)建PRP微球，原位復(fù)合+冷凍干燥技術(shù)構(gòu)建淫羊藿苷/羥基磷灰石支架，二者復(fù)合構(gòu)建淫羊藿苷/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料（EP/PRP/CS/HA），觀察其物理特性；利用ELISA法測定TGF-β1體外釋放，利用液相光譜儀測定淫羊藿苷體外釋放。結(jié)果淫羊藿苷/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料體外TGF-β1、淫羊藿苷釋放均接近3周，植入/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料的骨缺損骨修復(fù)良好。結(jié)論EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料能夠?qū)崿F(xiàn)生長因子和淫羊藿苷的長程作用，有望成為一種骨缺損修復(fù)材料的方法。

淫羊藿苷 富血小板血漿 生長因子 骨修復(fù)

骨缺損指骨的結(jié)構(gòu)完整性被破壞，創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)以及各種先天性疾病是導(dǎo)致骨缺損的主要原因［1］。盡管骨折治療的方式與方法有較大的進步，但是骨缺損的發(fā)生率仍然較高。骨缺損是臨床治療中的一個難題和挑戰(zhàn)［2］，給患者及社會帶到沉重精神負擔和醫(yī)療負擔。促進骨缺損修復(fù)對縮短臨床治療時間和保留患者肢體功能，避免和減少勞動力喪失，降低醫(yī)療費用等均具有重要意義。研究表明富血小板血漿（PRP）、淫羊藿苷能夠促進骨修復(fù)，但骨折愈合過程較長，上述物質(zhì)的長時間作用更利于骨修復(fù)重建。如果通過構(gòu)建殼聚糖富血小板血漿載藥微球和淫羊藿苷羥基磷灰石支架，同時實現(xiàn)生長因子和中藥淫羊藿長程緩放釋放，可能更有效影響骨修復(fù)的過程。本實驗基于上述設(shè)想，通過構(gòu)建淫羊藿苷/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料（EP/PRP/CS/HA），并觀察該材料中淫羊藿和TGF-β1（PRP活化后眾多影響骨修復(fù)的生長因子之一）能否實現(xiàn)長時間釋放。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性新西蘭大白兔，新橋醫(yī)院動物中心提供。

1.2 儀器與試劑 冷凍干燥機，北京博醫(yī)康FD-1A-80；恒溫震蕩機，萬合儀器THZ-D；萬能試驗機，上海企想檢測儀器有限公司；XDS-200C X線機，北京島津醫(yī)療有限公式BR-120M；羥基磷灰石，Amresco（上海信裕生物科技有限公司）；殼聚糖，MERCK MILLIPORE（上海鈺博生物科技有限公司）；淫羊藿苷，Amresco（上海信裕生物科技有限公司）；乙酸（重慶齊星化工）；2%NaOH（重慶齊星化工）；無水酒精（重慶齊星化工）；水合氯醛（重慶齊星化工）；Span80（天津市光復(fù)精細化工有限公司）；異丙醇（重慶齊星化工）；無水乙醚（重慶齊星化工）；EDTA（重慶齊星化工）；Elisa兔TGF-β1檢測試劑盒（上海彩佑生物發(fā)展有限公司）。

1.3 構(gòu)建方法 1）淫羊藿苷/殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合材料構(gòu)建（EP/CS/HA）［3］。精確稱量HA、CS（HA∶CS質(zhì)量比為5∶5）的粉體后，放入盛有淫羊藿溶液（淫羊藿的質(zhì)量占總質(zhì)量的10%）的燒杯中，加入一定量蒸餾水，使有機相濃度介于10%（W/V）之間，再加入一定量的乙酸溶液，使CS充分溶解。將該混合物于40℃水浴中充分攪拌成乳液狀后，超聲波處理消除氣泡。將此乳液傾入金屬模具（4 mm×15 mm），在4℃的冰箱中冷藏過夜，然后分別在-20℃、-80℃下預(yù)冷凍48 h后，真空冷凍干燥48 h，得EP/CS/HA復(fù)合支架材料。用含2% NaOH的乙醇浸泡2 h中和乙酸，蒸餾水沖洗，二次冷凍干燥后備用。所有支架材料均采用20 kGy60Co輻照滅菌消毒標記備用。2）淫羊藿苷/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料（EP/PRP/CS/HA）構(gòu)建。新西蘭大白兔采用水合氯醛腹腔注射的方法進行麻醉（10%，400 mg體質(zhì)量）。先給予總量的2/3，根據(jù)麻醉效果追加麻藥。麻醉成功后兔取俯臥位，四肢綁縛固定。備皮消毒，從兔耳中央動脈抽取5 mL血，裝在預(yù)先放有0.5 mL復(fù)方枸櫞酸鈉抗凝劑的10 mL離心管中，參照文獻［4］方法進行PRP提取：將新鮮血分2次離心，第1次200×g離心10 min，吸管吸取全部上清液至交界面下3 mm，移至另一離心管，平衡后再次200×g離心10 min，此時離心管中液體分為兩層，吸取約3/4上清液棄掉，搖勻剩余液體，即為PRP（約0.5 mL），搖勻，備用。將殼聚糖溶于5%的醋酸溶液中，得到3%的殼聚糖溶液；PRP加入3%的殼聚糖溶液10 mL中并充分攪拌（體積比1∶1），制成殼聚糖/PRP混合液。在500 mL燒杯中加入100 mL無菌液體石蠟，1 mL Span80，一定速度磁攪拌下逐滴加入殼聚糖/PRP混合液10 mL，使水油比達到1∶10，常溫下攪拌，乳化15 min。反應(yīng)完成用3號砂芯漏斗真空抽濾，用異丙醇、無水乙醚反復(fù)沖洗，靜置備用［5］。制作過程嚴格無菌操作。將富血小板血漿微球（CS-PRP）置入一定量PBS緩沖液中，淹沒EP/CS/HA復(fù)合支架材料，恒溫勻速震蕩1 h備用，干燥備用。3）淫羊藿苷/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料（EP/PRP/CS/HA）力學(xué)、形態(tài)學(xué)檢測。將材料攝片，并用萬能試驗機進行力學(xué)檢測。4）淫羊藿苷/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料（EP/PRP/CS/ HA）淫羊藿苷體外釋放［3］。將Ep-PRP-CS/HA材料放入盛有5 mL PBS（pH7.4）的密閉玻璃離心管中，37℃恒溫低速振蕩，分別于1，2，3，4，5，6，7，14，21 d定時收集全部溶液，4℃避光儲存待檢，補足等體積的PBS。將上述提取液離心，取0.5 mL上清于另一離心管中，加入0.5 mL的乙腈，15000 r/min離心10 min，取上清20 μL過膜，高效液相色譜儀（杭州海普科技有限公司賽爾泰Syltech500型高效液相色譜儀，檢測波長270 nm）檢測并記錄峰面積積分值，根據(jù)標準曲線換算出每次測量的藥物釋藥量（表2），并得出累計釋放量，得出累積釋放藥物占總載藥量百分率并繪制曲線。5）淫羊藿苷/富血小板血漿微球/羥基磷灰石復(fù)合材料（EP/PRP/CS/HA）TGF-β1體外釋放。將材料小心碾碎后加入含1 mL PBS液的EP管中，37℃搖床震蕩，10000 r/min離心10 min，收集全部上清液標記，4℃?zhèn)溆?，ELISA法測定上述液體中TGF-β1量，沉淀物再次加入等量PBS液，繼續(xù)震蕩。依法測量1，2，3，4，7，14，21，60，90 d時間點材料提取液中TGF-β1并記錄分析。

2 結(jié) 果

2.1 材料結(jié)果 見圖1?？梢姴牧蠟槎嗫拙|(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料力學(xué)性能方面，斷裂強度為（1.1±0.3）MPa，彈性模量為（26±5.1）kPa。

圖1 支架照片

2.2 EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料的淫羊藿苷釋放時間見表1、圖2。測定第1周每天、第2周末、第3周末提取液中淫羊藿苷上樣檢測峰面積，換算出每次測樣淫羊藿苷含量和累積含量，可以看出EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料到第3周仍有淫羊藿苷釋放，而前3 d到達了36%，表明該支架材料仍存在一定程度藥物突釋，之后釋放量相對穩(wěn)定，第2周末、第3周末有超過10%的釋放，60 d、90 d仍有少量釋放。

2.3 EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料TGF-β1體外釋放時間

見表2、圖3。第1周釋放較快，其中前3 d到達61%，其后釋放較為緩慢，第2、3周仍有釋放，釋放量約占1.54%、1.30%。

表1 EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料的淫羊藿苷釋放時間

圖2 EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料的淫羊苷藿釋放時間

表2 EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料TGF-β1體外釋放時間

圖3 EP/PRP/CS/HA復(fù)合材料TGF-β1體外釋放時間

3 討 論

骨缺損在臨床診療中常常面臨可供骨移植材料不夠、患處成骨能力下降的困境，如何在提供有效的，容易獲得的骨移植材料并提高成骨能力是所有醫(yī)務(wù)人員面臨的難題。由于骨缺損的修復(fù)需要有移植材料相容性同時具有骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性及骨祖細胞，如果一種移植復(fù)合物結(jié)合了全部3種骨再生所需要的成分，可望為骨缺損治療帶來莫大好處。目前，傳統(tǒng)吻合血管的自體/異體骨移植、人工合成替代物移植等多種方法成為臨床常用的骨缺損修復(fù)技術(shù)［6］。但是這些方法應(yīng)用過程中存在重要缺限，如易出現(xiàn)并發(fā)癥的供骨區(qū)、有限的供體來源、而無活性的異體骨雖然不受數(shù)量的限制，卻存在排異和傳染疾病的可能。近年來，骨組織工程技術(shù)的實驗研究給骨缺損的治療帶來無限發(fā)展前景。這些組織工程技術(shù)包括多種生物元素，如骨傳導(dǎo)性支架、緩釋誘導(dǎo)成骨生長因子、負載具有成骨潛能的細胞以及組織工程骨血管化或充足的血供等［7-11］?？梢?，組織工程技術(shù)成為修復(fù)骨缺損的趨勢，積極開發(fā)與研究不同因素的治療技術(shù)成為骨缺損治療的重要內(nèi)容。

淫羊藿又名仙靈脾，是小檗科植物，為傳統(tǒng)補益中藥，辛溫，無毒，堅筋骨，益精氣，補腰膝，強心力。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可以有效影響兔頜骨骨缺損的愈合時期［12］，對成骨細胞調(diào)亡的影響有明顯作用［13］，可以有效影響干預(yù)人工關(guān)節(jié)磨損微粒誘導(dǎo)的骨溶解現(xiàn)象［14］。說明中藥淫羊藿苷能有效影響骨代謝、骨修復(fù)過程。為實現(xiàn)淫羊藿的長時間作用，不少研究者嘗試不同方法探討實現(xiàn)藥物緩釋的可行性。席與斌等［15］利用二氯甲烷溶解淫羊藿苷，與大豆磷脂、膽固醇共同構(gòu)建脂質(zhì)體，證實可以實現(xiàn)淫羊藿苷的長程釋放，但72 h釋放量到達81%，且存在二氯甲烷殘留毒性問題；李群芳等［16］構(gòu)建載CaCO3微球并實現(xiàn)18 h的釋放，而骨折愈合時間往往更長，數(shù)周至數(shù)月不等，探索新的載藥方式具有較大意義，研究表明，EP-PRP-CS/HA材料能夠至少實現(xiàn)3周的淫羊藿苷釋放，且2、3周仍有較為平穩(wěn)的釋放，分別可到達13.70%，11.80%。骨折后修復(fù)過程需要經(jīng)歷肉芽組織修復(fù)期、原始骨痂形成期、成熟骨板期、塑形期，其中肉芽組織修復(fù)期中通過肉芽組織實現(xiàn)骨折的初步連接，在成人約需2~3周，是骨折修復(fù)開始的關(guān)鍵時期。研究表明EP-PRP-CS/HA材料能夠提供2~3周較為穩(wěn)定的淫羊藿苷釋放，提示該方法可能對促進骨折修復(fù)重建有較為重要意義。

生長因子對成骨細胞分化增殖有重要調(diào)節(jié)作用，如BMP、TGF-β、bFGF、IGF、PDGF等，但多為單一生長因子作用觀察［17-18］，部分研究［19］嘗試聯(lián)合兩種以上生長因子進行研究，均證實生長因子不同程度上促進了骨修復(fù)。但是，體內(nèi)骨修復(fù)過程中多種生長因子序貫、長程作用卻成為當前認為是促進骨修復(fù)的關(guān)鍵因素。因此，如何改變當前的單一生長因子的作用，實現(xiàn)生長因子長時間，模仿機體內(nèi)生長因子作用模式仍是組織工程困難所在，亦是目前組織工程研究熱點和難點。富含血小板血漿（PRP）是自體源性、濃縮的含血小板的血漿，是全血經(jīng)過分離而得到的血小板濃縮物。在PRP形成富含血小板凝膠（PRG）的過程中，血小板通過脫顆粒作用釋放血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β2、IGF、表皮生長因子和血管內(nèi)皮細胞生長因子等，其濃度約為體內(nèi)正常濃度的3~ 8倍。因此，研究人員［19］嘗試將PRP復(fù)合到各種支架載體上探討骨修復(fù)可行性，取得一定成果。鐘達［20］將PRP和支架復(fù)合后證實成骨效應(yīng)類似自體髂骨，許永偉等［21］利用殼聚糖制備PRP載藥微球，證實至少3周的TGF-β1釋放，第1周釋放量較大，第2、3周釋放量較小、穩(wěn)定，和本研究結(jié)果類似。因為生長因子性質(zhì)相對不穩(wěn)定，往往只能通過高濃度浸泡材料來實現(xiàn)載藥，本研究嘗試利用微球?qū)ζ溥M行包裹，實現(xiàn)了3周左右的釋放，但仍然存在一定的問題：雖然利用ELISA方法測定了TGF-β1含量，但實驗中的化學(xué)物質(zhì)對生長因子活性影響尚需進一步研究。

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Co nstruction and Characterization Study of Combined Graft （Epimedium-chitosan-hydroxyapatite Loaded with Platelet Rich Plasma Microspheres）

ZHANG Chuanzhi，CAO Honghui，ZHOU Yu，et al. Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400021，China.

Objective：To prepare combine graft（Epimedium-chitosan-hydroxyapatite loaded with Platelet Rich Plasma microspheres EP/CS/PRP/HA）and observe their characteristics and release behavior in vitro of Epimedium and transforming growth factor-beta1（TGF-β1）.Methods：Platelet Rich Plasma chitosan microspheres were prepared by emulsion cross-linking method and scaffold of epimedium-chitosan-hydroxyapatite（EP/CS/HA）was built by in-situ hybridization and cryogenic freeze drying technology，the Platelet Rich Plasma microspheres were soaked in EP/CS/HA and their characteristics were observed and release behavior in vitro of Epimedium was detected by ultra-performance liquid chromatography（UPLC）and transforming growth factor-beta1（TGF-β1）was detected by Elisa.Results：The combine graft（EP/CS/PRP/HA）presented a homogeneous porous form and had long time release of Epimedium and TGF-β1.Conclusion：The combined graft（EP/CS/PRP/HA）can achieve long time release of Epimedium and TGF-β1 and might be a promising reconstruction material for bone defect treatment.It is expected to be a possible method in bone defect treatment as it shows enhanced bone repairing.

Epimedium；Platelet-rich plasma（PRP）；Growth factor；Bone repair

Q95

A

1004-745X（2017）03-0390-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.005

2016-11-14）

重慶市衛(wèi)計委面上項目基金資助（2013-2-089）