劉曉霞，李娜，苗麗華，申佩娟，馮欣，2，孟慶恒，2*，孫建華，2

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

海洋枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液殺線蟲組分的分離及活性測定

劉曉霞1，李娜1，苗麗華1，申佩娟1，馮欣1，2，孟慶恒1，2*，孫建華1，2

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

實(shí)驗(yàn)采用生物活性跟蹤法，通過超濾、Sephadex凝膠層析、離子交換樹脂、硅膠板薄層層析，以及特異性鑒別染色等方法對海洋枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液的殺線蟲活性組分進(jìn)行分級分離和初步的性質(zhì)分析。結(jié)果表明，Sephadex凝膠柱層析（G-25，G-10）可有效分離獲得殺線蟲活性組分，3 d的線蟲校正死亡率達(dá)98.33%；以正丁醇:水:無水乙醇=1∶1∶1(V/V)為展開劑的薄層層析，可將活性組分有效分離，Rf=0.31，斑點(diǎn)洗脫物的線蟲校正死亡率達(dá)到94.00%；定性染色結(jié)果顯示，茚三酮反應(yīng)陽性，證實(shí)有α-氨基存在，茚三酮吡啶呈紅色，顯現(xiàn)出寡肽性質(zhì)；雙甲酮染色呈亮黃色，表明具有酮糖性質(zhì)。結(jié)果表明，BH0531殺線蟲活性代謝物應(yīng)為含有酮糖基團(tuán)的短肽類化合物。

海洋枝頂孢霉；殺線活性組分；活性跟蹤；分離

植物寄生線蟲是一類世界性分布的重要植物病原物，全球每年因植物線蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)千億美元[1]，已成為僅次于真菌病害的第二大植物病害[2]，防控形勢嚴(yán)峻。真菌殺線劑（具殺線活性的代謝產(chǎn)物）作為繼殺線蟲活菌劑（淡紫擬青霉活菌劑）之后的第二代生防制劑，已引起國際上的廣泛重視[3]。而海洋真菌因其特殊的生境，秉承了代謝物種類和代謝途徑的多樣性，業(yè)已成為尋找新型殺線蟲活性物質(zhì)的的資源庫。已有來自海洋的真菌Lachnumpapyraceum（Karst.）產(chǎn)生的異香豆素（isocoumarin）的鹵化衍生物被證實(shí)具有明顯的殺線蟲活性[4]；澳大利亞學(xué)者從南澳大利亞海篩選出兩株具有殺線蟲活性的海洋真菌Aspergilluscaneus和Raspailiasp.[5]。肖永堂等[6]對188株海洋真菌代謝物進(jìn)行了殺線蟲毒力測定，并觀察到一株海洋真菌的代謝物對小桿線蟲有作用，推測該菌株代謝物作用機(jī)理可能與伊維菌素類似，是一種神經(jīng)毒劑。郭道森等[7]先后從青島近海分離得到了具有殺線活性的輪枝孢霉（Verticilliumsp.）和青霉（Penicilliumsp.）。這些研究進(jìn)展顯示，從海洋真菌中篩選殺線蟲活性代謝物已成為可能。

海洋枝頂孢霉BH0531是一株從渤海水域自主分離得到的具有明確殺線蟲活性的絲狀真菌，其殺線活性與代謝產(chǎn)物密切相關(guān)[8]。進(jìn)一步的黃瓜盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該菌所產(chǎn)生的活性代謝物對南方根結(jié)線蟲（Meloidogyneincognita）同樣有明確的殺線活性，并使根結(jié)指數(shù)明顯降低，同時還具有改善土壤微生態(tài)環(huán)境的作用[9]；研究還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液對染病植株的生長及保護(hù)酶具有促進(jìn)作用[10]，而對線蟲體內(nèi)保護(hù)酶則呈現(xiàn)出抑制作用[11]?；钚晕镞€具有分子質(zhì)量小、水溶性好、耐熱和pH適應(yīng)范圍寬的特點(diǎn)[8]。為進(jìn)一步明確其活性組分的理化特性，闡明相關(guān)物質(zhì)與殺線蟲功能的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)采用生物活性跟蹤法，以松材線蟲為靶標(biāo)線蟲，對殺線蟲活性組分進(jìn)行了初步的分離純化和殺線活性測定，旨在為菌株BH0531的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531，菌種保藏號CGMCC-5445：由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試線蟲

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）：中國農(nóng)科院植保所提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextrose agar，PDA））：去皮土豆200 g/L煮汁，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，pH自然。121℃、0.1 MPa滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：去皮土豆200 g/L（浸汁），葡萄糖20 g/L，pH自然。121℃、0.1 MPa滅菌20 min。

1.1.4 供試藥品

葡聚糖凝膠Sephadex G-25、G-10：北京索萊寶科技有限公司；離子交換樹脂：南開大學(xué)化工廠；水合茚三酮：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；雙甲酮（98%）：北京百靈威科技有限公司；正丁醇、吡啶、甲醛（均為分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；HSGF245薄層層析硅膠板：煙臺市黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5810R型冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf AG公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；GZX-9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BSZ-100型自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠；TP10-20型超濾泵、MT系列UEOS-503中空纖維膜組件（50 mm×386 mm，截留分子質(zhì)量6 ku）：天津天膜工程技術(shù)有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度儀：美國Varian公司；DME/MVC2000型顯微鏡：德國徠卡公司；凝膠柱層析（0.5 cm×40 cm）：上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠；96孔板：美國Costar公司；無菌式針頭過濾器（0.22 μm孔徑）：德國Sartorius公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵液小分子粗提物的制備

將4℃保藏的海洋枝頂孢霉BH0531菌種接入活化培養(yǎng)基（PDA），26℃條件下生化培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)7 d活化。加入無菌水洗下孢子，制備成106個/mL的孢子懸液，以1%的接種量將孢子懸液接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，26℃、120 r/min培養(yǎng)4 d[12]。將發(fā)酵好的發(fā)酵液8 000 r/min離心30 min除菌體，再經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，即為發(fā)酵大分子濾液。采用截留分子質(zhì)量為6 000 u的中空纖維膜組件對發(fā)酵濾液進(jìn)行超濾。超濾后濾液置于真空干燥箱內(nèi)，抽真空710 MPa，50～60℃進(jìn)行干燥。

1.3.2 代謝物分級分離及殺線蟲活性

Sephadex G-25凝膠柱層析：取1.48 g萃取后真空干燥濃縮的發(fā)酵液干物質(zhì)溶于10 mL無菌水中，經(jīng)過孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾后，上樣量為1 mL，超純水做洗脫劑。通過恒流泵控制流速1mL/管，用自動收集器收集30管。共收集10次，收得總液體300 mL，平均每個組分10 mL。將分離收集得到的分離活性物的每個組分的10 mL液體濃縮為2.5 mL，分別檢測殺線蟲活性。Sephadex G-10凝膠柱層析：將經(jīng)過Sephadex G-25凝膠柱有活性管合并，過G-10凝膠柱收集（同上G-25），做殺線活性檢驗(yàn)。

1.3.3 分離物性質(zhì)及活性分析

溶解性質(zhì)采用水飽和乙酸乙酯萃取法，將分離物萃取3次后收集酯相和水相，分別檢測殺線活性，以判斷活性代謝物的溶解性質(zhì)。萃取后有活性相，分別采用001×7型陽離子交換樹脂和201×7型陰離子交換樹脂分離活性組分，并通過殺線活性分析判斷帶電荷情況。裝柱高2/3、平衡、上樣量1 mL、超純水洗脫。

1.3.4 活性組分的薄層分離及初步定性分析

以正丁醇∶水∶無水乙醇（1∶1∶1，V/V）的比例作為展開劑，在10cm×5cm的硅膠板下端1cm處點(diǎn)樣，點(diǎn)樣間距為1.5cm，密閉式展開，展開方式為上行展開，展開時間為90 min。用茚三酮溶液（0.2 g本品溶于100 mL無水乙醇）噴板，于110℃烘箱內(nèi)烘烤30 min顯色檢驗(yàn)α-氨基酸[13]；用1%茚三酮吡啶溶液與冰醋酸按5∶1混合，噴板后于100℃加熱5 min顯色檢驗(yàn)二肽或三肽短肽類物質(zhì)；用雙甲酮溶液（10 g雙甲酮溶于90 mL乙醇與10 mL 85%磷酸中）顯色，噴板后于110℃加熱15～20 min檢驗(yàn)酮糖[14]。根據(jù)顯色的Rf值將斑點(diǎn)溶解做殺線活性檢驗(yàn)。斑點(diǎn)洗脫物進(jìn)一步在波長200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長掃描，并以超純水作空白校準(zhǔn)基線，用以判定紫外吸收特性。

1.3.5 殺線蟲活性（殺線率）的測定方法

以無菌水為對照組，松材線蟲為靶標(biāo)線蟲，取無菌96孔板，每孔加入100 μL的靶標(biāo)懸蟲液（約100頭），再將收集的分離液分別取100 μL等體積加入。設(shè)3組重復(fù)，26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d于顯微鏡下觀測靶標(biāo)線蟲的死亡情況，線蟲校正死亡率的公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 分級分離物及殺線蟲活性

超濾獲得的菌株BH0531發(fā)酵液粗提物進(jìn)一步經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱層析分離，分離結(jié)果如表1所示。

表1 菌株BH0531發(fā)酵液G-25凝膠柱層析分離的各組分線蟲存活率（3 d）Table 1 Mortality for each component of BH0531 fermentation broth by G-25 gel chromatography on nematodes(3 d)

從表1可以看出，殺線活性組分主要集中在13～25管收集物（殺線率≥60%），達(dá)到A級（殺線率≥90%）的有5管，其中殺線率≥95%的主要集中在14～17管，處于分離過程的中段區(qū)域。另有5管（18～21、24管）達(dá)到B級（殺線率≥80%），主要出現(xiàn)在分離過程的后段。這一現(xiàn)象表明，活性組分為Sephadex G-25分離范圍內(nèi)的分子質(zhì)量相對較小的組分。先行收集的相對分子質(zhì)量較大的組分未表現(xiàn)出明顯的殺線活性（殺線率≤40%）。在此基礎(chǔ)上，將G-25凝膠柱分離收集的有活性管合并，進(jìn)一步進(jìn)行了分離范圍更小的Sephadex G-10凝膠柱分離檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，G-10凝膠柱的分離物3 d的線蟲死亡率為88.72%，校正死亡率達(dá)到88.20%，接近A級。提示活性物質(zhì)的分子質(zhì)量介于G-25分離范圍的下限和G-10的上限之間。

2.2 分離物性質(zhì)及活性分析

為進(jìn)一步判別活性組分的理化性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)采用水飽和乙酸乙酯萃取和離子交換的方法對分離物進(jìn)行了進(jìn)一步的分離和活性檢驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 菌株BH0531發(fā)酵液不同萃取相的殺線蟲活性（3 d）Table 2 Nematicidal activity of different extraction phases of BH0531 fermentation broth(3 d)

由表2可知，分離物的殺線蟲活性主要出現(xiàn)在水相組分，校正死亡率達(dá)到B級，而酯相殺線活性較弱，表明殺線蟲活性組分為具有一定極性的水溶性物質(zhì)。

用處理好的001×7型陽離子交換樹脂、201×7型陰離子交換樹脂洗脫分離物見表3。

表3 菌株BH0531發(fā)酵液水相萃取物離子交換樹脂的殺線蟲活性（3 d）Table 3 Nematicidal activity of aqueous phase of BH0531 fermentation broth by different anion-exchange resins(3 d)

由表3可知，經(jīng)過陽離子交換并洗脫后殺線蟲校正死亡率達(dá)91.24%，而201×7型陰離子樹脂交換后，因結(jié)合牢固而未能將活性組分洗脫下來。表明海洋枝頂孢霉BH0531殺線蟲活性物質(zhì)含有較強(qiáng)的正電荷。

2.3 分離物屬性的定性分析

對G25凝膠柱分離的菌株BH0531殺線活性物進(jìn)行了進(jìn)一步的硅膠板薄層層析色譜分離，紫外觀察可見到明顯的分離物顯色斑點(diǎn)（圖1A），茚三酮乙醇溶液染色呈陽性（圖1B），表明分離物含α-氨基，印證了前期研究提出的活性物可能為含氮糖類的推測[12]。隨后的茚三酮吡啶溶液染色可見紅色顯色斑點(diǎn)（Rf3=0.31），提示該組分應(yīng)為二肽或三肽（圖1C）。雙甲酮溶液染色可見到亮黃色斑點(diǎn)組分（Rf4=0.31），表明含有酮糖基團(tuán)（圖1D）。紫外-可見光全波長掃描結(jié)果顯示（圖2），在波長217.5 nm處有單一較大吸收峰（Abs=3.704），表明活性組分存在n→π*、π→π*躍遷的吸收帶，提示有C=O，N=O等基團(tuán)[15]。依據(jù)Rf對未染色的相應(yīng)組分進(jìn)行洗脫并進(jìn)行殺線活性檢驗(yàn)的結(jié)果表明，3 d的線蟲校正死亡率為94.32%，證實(shí)該組分即為殺線蟲活性組分。

圖1 分離物硅膠板薄層層析色譜分離及顯色結(jié)果Fig.1 Isolation and chromogenic results of silica gel plate by thin layer chromatography

圖2 分離物紫外可見全波長掃描結(jié)果Fig.2 Scanning results of ultraviolet visible wavelength of the separated products

3 結(jié)論

上述研究結(jié)果表明，采用殺線蟲活性跟蹤檢測的方法，經(jīng)6 000 u超濾、Sephadex G-25、G-10凝膠柱層析等分級分離方法可有效獲得海洋枝頂孢霉BH0531殺線蟲活性組分，活性物殺線蟲校正死亡率最高可達(dá)98.33%。進(jìn)一步的水飽和乙酸乙酯萃取法萃取、離子交換結(jié)果證實(shí)該活性組分為帶正電的水溶性物質(zhì)。硅膠板薄層層析可進(jìn)一步分離、并純化獲得該組分。定性分析結(jié)果表明，殺線蟲活性組分應(yīng)為含有酮糖基團(tuán)的短肽類物質(zhì)。這類物質(zhì)的生物活性在其他領(lǐng)域已有研究報(bào)道，如MALMSTRM J等[17]在裸孢殼菌Emericella variecolor代謝物中發(fā)現(xiàn)三種聚酮varitriol，varioxirane，dihydroterrein具有抗菌作用；CHEN Z M等[18]在海洋真菌枝頂孢霉SCSIO 115的發(fā)酵液中分離了對腫瘤細(xì)胞具有毒性的三種新環(huán)肽。但在殺線蟲活性的研究中的有相關(guān)報(bào)道還不多見，其具體化學(xué)結(jié)構(gòu)和殺線蟲作用的機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入研究。

[1]CHITWOOD D J.Research on plant-parasitic nematode biology conducted by the United States department of agriculture-agricultural research service[J].Pest Manag Sci,2003,59(6-7):748-753.

[2]路雪君.根結(jié)線蟲的生物防治研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010，12（4）：44-48.

[3]ANASTASIADIS I A,GIANNAKOU I O,PROPHETOU-ATHANASIADOU D A.et al.The combined effect of the application of a biocontrol agentPaecilomyces lilacinus,with various practices for the control of root-knot nematodes[J].Crop Protect,2008,27(3-5):352-361.

[4]STADLER M,ANKE H,STERNER O.New metabolites with nematicidal and antimicrobial activities from the ascomyceteLachnum papyraceum (Karst.)Karst.VII.structure determination of brominated lachnumon and mycorrhizin A derivatives[J].Cheminform,1995,26(42):149-153.

[5]WEST L M.Two new clerodane diterpenes from the New Zealand marine spongeRaspailiasp.[J].Aust J Chem,1998,51(12):1097-1101.

[6]肖永堂，鄭忠輝，黃耀堅(jiān)，等.海洋真菌殺蟲活性的初步研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，44（6）：847-850.

[7]李子，周長景，陳聰聰，等.殺松材線蟲海洋真菌的鑒定及培養(yǎng)條件研究[J].青島大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，30（2）：102-107.

[8]MENG Q H,SHI X X.Isolation of anAcremoniumsp．From a screening of 52 seawater fungal isolates and preliminary characterization of its growth conditions and nematicidal activity[J].Biotechnol Lett,2012,34 (10):1847-1850.

[9]黃敏，劉曉霞，申佩娟，等.海洋枝頂孢霉BH0531對黃瓜根結(jié)線蟲防治的微生態(tài)效應(yīng)[J].中國釀造，2016，35（3）：52-56.

[10]杜海霞，蒙春蕾，王勇勇，等.海洋枝頂孢霉BH0531代謝物對松材線蟲形態(tài)和酶活的影響[J].中國釀造，2014，33（6）：23-26.

[11]蔡爽，申佩娟，劉曉霞，等.海洋真菌BH0531對黃瓜促生長作用的研究[J].中國釀造，2016，35（3）：27-31.

[12]史曉訊.絲狀海洋真菌殺線蟲代謝物的性質(zhì)及發(fā)酵條件研究[D].天津：天津師范大學(xué)，2010.

[13]楊遠(yuǎn)帆，倪輝，吳黎明.茚三酮法測定蜂蜜及果葡糖漿中的氨基酸含量[J].中國食品學(xué)報(bào)，2013，13（2）：171-176.

[14]張維杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1987：37-45.

[15]常建華，董綺功.波普原理及解析[M].北京：科學(xué)出版社，2005：26-31.

[16]王勇勇，蒙春蕾，蔡爽，等.抗白色念珠菌海洋真菌的篩選及抑菌活性初探[J].中國釀造，2015，34（2）：55-59.

[17]MALMSTRM J,CHRISTOPHERSEN C,BARRERO A F,et al.Bioactive metabolites from a marine-derived strain of the fungusEmericella variecolor[J].J Nat Prod,2002,65(3):364-367.

[18]CHEN Z M,SONG Y X,CHEN Y C,et al.Cyclic heptapeptides,cordyheptapeptides C-E,from the marine-derived fungusAcremonium persicinumSCSIO 115 and their cytotoxic activities[J].J Nat Prod,2012, 75(6):1215-1219.

Separation and activity determination of nematicidal components from marine-derived Acremoniumsp.BH0531 fermentation broth

LIU Xiaoxia1,LI Na1,MIAO Lihua1,SHEN Peijuan1,FENG Xin1,2,MENG Qingheng1,2*,SUN Jianhua1,2
(1.College of Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China;2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin 300387,China)

The nematicidal active components from marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth were fractionated and preliminarily identified through the methods of ultra-filtration,Sephadex gel chromatography,anion-exchange resin,thin layer chromatography(TLC),as well as specific differential staining under the guidance of bio-active assay.The results showed that the nematicidal active components were separated and purified effectively by Sephadex G-25 and Sephadex G-10 gel chromatography,the adjusted mortality of the nematodes at 3 d was up to 98.33%.The TLC results indicated that the active components can be effectively separated using 1-butanol,H2O,anhydrous ethanol(1∶1∶1)(V/V)as developing solvent,Rf=0.31.The spot of silica gel plate,which adjusted mortality of the nematodes was 94.00%.The qualitative staining results indicated that the inhydrin color reaction was positive,which proved the presence of α-amino group.The inhydrin pyridine color reaction was red,showing oligopeptide properties.The dimedone staining was bright yellow,showing the properties of ketose.These results suggested that the marine-derived fungusAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth with nematicidal activity should contain oligopeptides compounds with ketose groups.

marine-derivedAcremoniumsp.;nematicidal active components;activity tracking;separation

Q939.9

0254-5071（2017）03-0035-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.008

2017-01-01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31272019）；天津市自然基金聯(lián)合項(xiàng)目（15JCYBJC51400）

劉曉霞（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锏幕钚晕镔|(zhì)。

*通訊作者：孟慶恒（1963-），副教授，碩士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。