張 麗，劉麗霞，陳 紅，李強(qiáng)子，劉吳鑫

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030)

中國荷斯坦奶牛Nramp1基因多態(tài)性與泌乳性狀及產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)性分析

張 麗，劉麗霞，陳 紅，李強(qiáng)子，劉吳鑫

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030)

為尋找與乳房炎相關(guān)的分子標(biāo)記，為荷斯坦牛的抗病育種提供理論基礎(chǔ)，試驗(yàn)采用PCR-SSCP技術(shù)和測(cè)序的方法對(duì)寧夏農(nóng)墾303頭中國荷斯坦奶牛的Nramp1基因進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，利用一般線性模型分析Nramp1基因c.200C>G突變對(duì)泌乳性狀及產(chǎn)奶量影響。結(jié)果顯示，Nramp1基因c.200C>G突變與乳脂率、日產(chǎn)奶量和體細(xì)胞評(píng)分值存在顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)關(guān)聯(lián)。因此，可以把該位點(diǎn)作為中國荷斯坦奶牛體細(xì)胞評(píng)分、測(cè)定日產(chǎn)奶量和日乳脂率的遺傳標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)一步研究。

荷斯坦牛；Nramp1基因；遺傳多態(tài)性；泌乳性狀；產(chǎn)奶量

奶牛乳腺炎在泌乳期牛群體中發(fā)病率極高，其發(fā)病率與抗病候選基因的多態(tài)性相關(guān)。因此，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)選育乳腺炎抗性的奶牛，有望成為控制和降低乳腺炎發(fā)生的有效途徑。天然抗性相關(guān)巨噬蛋白基因(natural resistance associated macrophage protein，Nramp1)首次在小鼠中被發(fā)現(xiàn)并克隆[1]，其主要在巨噬細(xì)胞和多核型白細(xì)胞中特異表達(dá)，通過轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)菌自身合成防御酶系所必需的Mn2+或Fe2+等金屬離子使細(xì)菌無法合成防御酶系，從而使動(dòng)物抵抗病原菌的侵染[2-3]。Nramp1在家畜機(jī)體中具有重要的抵抗胞內(nèi)寄生菌活性，已經(jīng)成為家畜抗病育種的研究熱點(diǎn)之一。研究表明，Nramp1基因與牛布氏桿菌病、結(jié)核病等傳染病的抗性相關(guān)。Nramp1基因3’UTR區(qū)遺傳變異對(duì)荷斯坦奶牛布氏桿菌、分枝桿菌的抗性差異顯著[4-8]。吳宏梅等[9]研究表明，豬Nramp1基因內(nèi)含子6多態(tài)性與中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞吞噬功能顯著相關(guān)。Hebert等[10]報(bào)道，Nramp1基因可抵抗細(xì)胞內(nèi)乳腺炎病原金黃色葡萄球菌的感染。Joo等[11]報(bào)道，乳腺炎抗性奶牛Nramp1基因mRNA表達(dá)量高于易感牛群，可根據(jù)Nramp1基因表達(dá)量的差異選育乳腺炎抗性奶牛群，從而揭示Nramp1基因多態(tài)性與乳腺炎抗性相關(guān)。胡海川[12]研究表明，荷斯坦奶牛Nramp1基因多態(tài)性與體細(xì)胞評(píng)分(somatic cell score，SCS)、305 d產(chǎn)奶量存在顯著或極顯著相關(guān)性，且SCS數(shù)值越高，產(chǎn)奶量下降越明顯，牛場(chǎng)效應(yīng)和胎次效應(yīng)對(duì)乳腺炎的影響也很大。因此，可將Nramp1基因作為奶牛乳腺炎候選基因應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。但是，牛Nramp1基因的研究多局限于3’UTR區(qū)與布氏桿菌病、結(jié)核桿菌病的相關(guān)性研究，對(duì)其他位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)及其與泌乳性狀及產(chǎn)奶量的研究未見報(bào)道。本研究采用PCR-SSCP和測(cè)序技術(shù)對(duì)Nramp1基因的SNP進(jìn)行了篩選，并結(jié)合乳脂率、乳蛋白率、體細(xì)胞評(píng)分及產(chǎn)奶量數(shù)據(jù)，分析其多態(tài)性與中國荷斯坦奶牛泌乳性狀和乳腺炎間的相關(guān)性，找到對(duì)泌乳性狀和乳腺炎間有顯著影響的SNP位點(diǎn)，為奶?？共∮N提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)牛血樣采集、產(chǎn)奶量和乳成分測(cè)定

本試驗(yàn)樣本采集于2013年3月—2014年5月在寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司完成。選擇體況相近、無臨床乳腺炎、胎次在 3～4 胎具有完整系譜資料的中國荷斯坦奶牛303頭，經(jīng)尾靜脈采血10 mL·頭-1，醫(yī)用采血管低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍備用。試驗(yàn)牛每日采集一次奶樣，記錄日產(chǎn)奶量，全天按照早∶中∶晚=4∶3∶3的比例混合奶樣100 mL送寧夏 DHI 測(cè)定中心進(jìn)行個(gè)體牛乳蛋白率、乳脂率及乳中體細(xì)胞數(shù)測(cè)定。對(duì)泌乳天數(shù)多于305 d的個(gè)體只取其305 d的產(chǎn)奶量，對(duì)泌乳天數(shù)少于305 d的個(gè)體根據(jù)校正系數(shù)校正成305 d產(chǎn)奶量。

1.2 血樣DNA提取和引物設(shè)計(jì)

采用常規(guī)苯酚-氯仿抽提法從備用凍存血樣中提取荷斯坦奶?；蚪MDNA，超純水溶解，保存母液，取部分DNA母液樣品稀釋至100 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)GenBank公布的荷斯坦奶牛Nramp1基因DNA序列(登錄號(hào)：DQ493965)，應(yīng)用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物用于擴(kuò)增荷斯坦奶牛Nramp1基因第10外顯子和第11外顯子序列，其引物序列見表1，該引物由大連寶生物公司合成，雙蒸水溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR-SSCP檢測(cè)與等位基因序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增體系總體積為20 μL：基因組DNA模板2.0 μL，0.25 μmol·L-1上下游引物各1.0 μL，2×TaqPCR MasterMix 10.0 μL，雙蒸水6.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，降溫至4 ℃保存，1%瓊脂糖凝膠對(duì)其擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

取3 μL無非特異性條帶的PCR產(chǎn)物，加入7 μL變性上樣緩沖液(0.025%溴酚藍(lán)、98%去離子甲酰胺、10 mmol·L-1EDTA、0.025%二甲苯氰)，98 ℃變性10 min后再立即冰浴10 min。將變性后的PCR產(chǎn)物依次上樣到10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠孔中(Acr∶Scr=39∶1)，室溫160 V電壓下分別電泳4 h(exon10)和6 h(exon11)。電泳結(jié)束后用硝酸銀染色法染色確定PCR產(chǎn)物的基因型。

表1 引物信息

Table 1 The information of primers

引物名稱Primername引物序列Primersequence(5’-3’)退火溫度Annealingtemperature/℃擴(kuò)增區(qū)域Amplifiedregion目的片段長度Productsize/bpP1F:5’-TGTCGGGCTGGATTCAGACT-3’R:5’-CCTGCCGTTGGCTTGCTTAC-3’60exon10231P2F:5’-GACCGTGGCAGTGGACATT-3’R:5’-CTGCCTTGTGCTCAGACACC-3’60exon11327

PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP電泳判型后，如果新發(fā)現(xiàn)的等位基因是純合型個(gè)體，其PCR產(chǎn)物直接送北京華大公司測(cè)序。如果新發(fā)現(xiàn)的等位基因是雜合型個(gè)體，可從聚丙烯酰胺凝膠中切下等位基因中的一條帶，放于1.5 mL離心管中，用200 μL 1×TE(10 mmol·L-1Tris-HCl，0.1 mmol·L-1EDTA)緩沖液洗滌兩次，并用槍頭壓碎后加入50 μL 1×TE，置于50～60 ℃水浴中孵化1～2 h左右，該溶液可作為DNA模板并使用原有的PCR擴(kuò)增體系和條件進(jìn)行再擴(kuò)增，第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，與原PCR產(chǎn)物或其他含有該等位基因的樣品同時(shí)進(jìn)行SSCP電泳，以確保第二次擴(kuò)增產(chǎn)物為新發(fā)現(xiàn)的等位基因。然后用PCR純化試劑盒對(duì)第二次擴(kuò)增產(chǎn)物純化并測(cè)序[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用GenePop和PIC生物軟件計(jì)算突變位點(diǎn)的遺傳參數(shù)。因體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count，SCC)呈非正態(tài)分布，可將體細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)換為體細(xì)胞評(píng)分，公式為：SCS=[log2(SCC/100)]+3[14]。

荷斯坦奶牛群均為舍飼群體，飼養(yǎng)環(huán)境基本一致，可忽略場(chǎng)效應(yīng)對(duì)性狀的影響。因此，應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件中一般線性模型分析荷斯坦奶牛Nramp1基因突變對(duì)測(cè)定日乳脂率、測(cè)定日乳蛋白率、日產(chǎn)奶量、305 d 產(chǎn)奶量和體細(xì)胞評(píng)分進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。不同基因型間的多重比較用LSD 法。模型如下：Yijkl=μ+Ci+Tj+Gk+Sl+eijkl，其中Yijkl為個(gè)體性狀表型值；μ為群體均值；Ci為環(huán)境的固定效應(yīng)；Tj為第j胎次的固定效應(yīng)；Gk為Nramp1基因第k個(gè)標(biāo)記基因型的固定效應(yīng)；Sl為產(chǎn)犢季節(jié)的固定效應(yīng)；eijkl為隨機(jī)誤差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1Nramp1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量

荷斯坦奶牛Nramp1基因第10、11外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠(160 V，30 min)電泳檢測(cè)條帶清晰且特異性較好(圖1)，大小范圍分別為200～300 bp、300～400 bp，與預(yù)期片段長度基本相符，可以用于SSCP檢測(cè)。

2.2 PCR-SSCP檢測(cè)分析和序列測(cè)定

荷斯坦奶牛Nramp1基因第10、11外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析，結(jié)果表明，荷斯坦奶牛Nramp1基因第10外顯子無多態(tài)性；第11外顯子區(qū)域檢測(cè)到2種等位基因A和B，形成AA、BB、AB共3種帶型(圖2)，其中等位基因A和B均發(fā)現(xiàn)純合型個(gè)體。第11外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果通過與普通牛Nramp1基因(GenBank No. DQ493965)第11外顯子序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增序列的200 bp處發(fā)生了G到C的錯(cuò)義突變(圖3)，從而導(dǎo)致氨基酸由原來的半胱氨酸(Cys)變?yōu)榻z氨酸(Ser)(圖4)。

M， 100 bp DNA Marker; 泳道1為Exon10 PCR產(chǎn)物；泳道2為Exon11 PCR產(chǎn)物M, 100 bp DNA marker; Lane 1, PCR product of Exon10; Lane 2, PCR product of Exon11圖1 荷斯坦奶牛Nramp1基因第10和11外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Detections of PCR products of Nramp1 gene exon 11 in Holstein cattle

圖2 荷斯坦奶牛Nramp1基因第10/11外顯子PCR產(chǎn)物SSCP檢測(cè)結(jié)果Fig.2 SSCP analvsis of PCR amplification of Nramp1 exon10/11 in Holstein cattle

圖3 荷斯坦奶牛Nramp1基因第11外顯子區(qū)域AA/BB基因型堿基突變Fig.3 Base mutations of AA/BB genotype of Nramp1 exon11 area in Holstein cattle

圖4 荷斯坦奶牛Nramp1基因第11外顯子區(qū)域AA/BB基因型編碼蛋白序列Fig.4 Encoding protein sequence of AA/BB genotype of Nramp1 exon11 area in Holstein cattle

2.3 荷斯坦奶牛Nramp1基因群體遺傳特性分析

對(duì)荷斯坦奶牛Nramp1基因第11外顯子的各遺傳參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行了分析，其中等位基因A的頻率為0.566 0，為優(yōu)勢(shì)等位基因；基因型AA的頻率為0.445 6，為優(yōu)勢(shì)基因型。等位基因B的頻率為0.434 0，基因型BB和AB的頻率分別為0.313 5和0.240 9。純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)分別為0.507 9、0.492 1和1.965 7；多態(tài)信息含量(PIC)為0.370 6，即0.250.05)。

2.4 荷斯坦奶牛Nramp1基因第11外顯子突變與泌乳性狀和產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)分析

303頭荷斯坦奶牛群體的Nramp1基因第11外顯子AA、BB、AB基因型對(duì)日產(chǎn)奶量、測(cè)定日乳脂率、測(cè)定日乳蛋白率、SCS值及305 d產(chǎn)奶量5個(gè)生產(chǎn)性狀的影響見表2。方差分析結(jié)果表明，荷斯坦奶牛的乳脂率、日產(chǎn)奶量、體細(xì)胞評(píng)分在基因型間有顯著或極顯著差異(P<0.05，P<0.01)。多重比較結(jié)果表明，BB基因型乳脂率、日產(chǎn)奶量分別為(3.83±0.08)%、(35.38±1.42)kg，顯著(P<0. 05)和極顯著(P<0.01)高于AA基因型個(gè)體相應(yīng)性狀(3.57±0.07)%、(28.73±1.16)kg，BB基因型體細(xì)胞評(píng)分(2.35±0.10)顯著低于AA基因型(P<0.05)。測(cè)定日乳蛋白率和305 d產(chǎn)奶量在不同基因型間無顯著差異，但AB型個(gè)體介于AA型和BB型兩者之間。

表2 荷斯坦奶牛Nramp1基因第11外顯子基因型對(duì)泌乳性狀及體細(xì)胞評(píng)分的關(guān)聯(lián)分析

Table 2 Influence ofNramp1 gene exon11 genotype on milk traits and SCS of Holstein cattle

基因型Genotype數(shù)量Number乳脂率Fatpercentage/%乳蛋白率Proteinpercentage/%日產(chǎn)奶量Dailymilkyield/kg305d產(chǎn)奶量305dmilkyield/kg體細(xì)胞評(píng)分SCSAA1353.57±0.07b3.17±0.0528.73±1.16B8412.66±393.052.90±0.20aAB953.83±0.09a3.27±0.0632.58±1.79AB8304.04±646.282.86±0.18abBB733.83±0.08a3.22±0.0535.38±1.42A7851.42±512.922.35±0.10b

同列數(shù)據(jù)后無相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values in each column without the same capital or lowercase letters are significantly different at the probability level of 0.01 or 0.05， respectively.

3 討論

3.1 荷斯坦奶牛Nramp1基因多態(tài)性分析

大多數(shù)高等哺乳動(dòng)物Nramp1基因外顯子和內(nèi)含子間變異很小，但是其3’和5’非編碼區(qū)存在很大變異，因此有關(guān)荷斯坦奶牛Nramp1基因多態(tài)性的研究主要集中3’UTR區(qū)[4-8]。本研究僅在荷斯坦奶牛Nramp1基因第11外顯子中發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段的第200位發(fā)生的C→G堿基突變，該突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸序列由半胱氨酸(Cys)轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸(Ser)，而在第10外顯子中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)。同胡海川[12]研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增片段相同卻出現(xiàn)了不同的結(jié)果。胡海川[12]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛Nramp1基因第10外顯子存在2個(gè)等位基因3種基因型，第11外顯子第200位、254位分別存在C→G、T→G的堿基突變，造成這種差異可能是由于所研究的荷斯坦奶牛群體的遺傳背景和基因與環(huán)境相互作用不同而造成的差異，再者我們也應(yīng)擴(kuò)大樣本容量，避免偶然情況發(fā)生；另外第10外顯子突變位點(diǎn)的PIC低于0.25，說明該位點(diǎn)低度多態(tài)，遺傳變異較小，可望獲得的遺傳進(jìn)展不大。

本研究中荷斯坦奶牛Nramp1基因第11外顯子多態(tài)信息含量(PIC)介于0.25和0.50之間，說明該群體多態(tài)信息含量已達(dá)到中度多態(tài)，且該群體未偏離Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，因此荷斯坦奶牛群體在此位點(diǎn)的多態(tài)性相對(duì)較高，遺傳變異相對(duì)較大，可望獲得更多的遺傳進(jìn)展，可以很好地利用這一位點(diǎn)在本試驗(yàn)群體中表現(xiàn)出良好的多態(tài)性選擇。馬捷瓊等[15]研究表明，奶牛Nramp1基因3′UTR區(qū)具有豐富的多態(tài)性，多態(tài)信息含量為0.950，處于高度多態(tài)，該群體未偏離Hardy-Weinberg平衡，這可能與人工選擇和飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。

3.2 荷斯坦奶牛Nramp1基因多態(tài)性與泌乳性狀及產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)性

Nramp1基因是動(dòng)物體內(nèi)殘余固有免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。候選基因作為尋找篩選畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳連鎖標(biāo)記有效方法，可以直接研究該基因的多態(tài)性與個(gè)體經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系。由于牛乳中SCC能準(zhǔn)確反映奶牛乳腺炎的發(fā)病程度，同時(shí)SCS與乳腺炎的遺傳相關(guān)為0.6～0.8，并且SCS的增加可降低產(chǎn)奶量，因此本試驗(yàn)以SCS為乳腺炎的參數(shù)，研究各基因型與SCS、產(chǎn)奶量之間的相關(guān)性。馬捷瓊等[16]研究表明，Nramp1基因3′UTR區(qū)多態(tài)性與奶牛305 d產(chǎn)奶量和乳房炎檢出率均達(dá)到顯著相關(guān)(P<0.05)。郭洋等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳中SCC越低，305 d產(chǎn)奶量較高。

本研究發(fā)現(xiàn)，Nramp1基因第11外顯子G→C的突變位點(diǎn)對(duì)荷斯坦奶牛體細(xì)胞評(píng)分的影響顯著(P<0.05)，對(duì)測(cè)定日產(chǎn)奶量影響極顯著(P<0.01)，對(duì)測(cè)定日乳脂率影響顯著(P<0.05)，但對(duì)305d產(chǎn)奶量影響不顯著(P>0.05)，因此可以把該位點(diǎn)作為中國荷斯坦奶牛體細(xì)胞評(píng)分、測(cè)定日產(chǎn)奶量和測(cè)定日乳脂率遺傳標(biāo)記進(jìn)行研究。中國荷斯坦奶牛Nramp1基因第11外顯子的突變與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，AA基因型個(gè)體305 d產(chǎn)奶量最高，為8 412.66 kg，但其乳脂率(3.57±0.07)%、乳蛋白率(3.17±0.05)%和日產(chǎn)奶量(28.73±1.16)kg卻是各種基因型中最低的。中國荷斯坦奶牛不同基因型個(gè)體泌乳性狀的分析結(jié)果和突變檢測(cè)情況提示，Nramp1基因第11外顯子的G→C突變對(duì)奶牛的泌乳性狀可能存在重要影響。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Genetic polymorphismNramp1 gene and its associations with milk traits and milk yield in Chinese Holstein cattle

ZHANG Li， LIU Lixia， CHEN Hong， LI Qiangzi， LIU Wuxin

(CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestMinzuUniversity，Lanzhou730030，China)

To search the molecular markers that are associated with mastitis and to provide a theoretical basis for the Holstein cattle breeding and disease resistance， the polymoprhisms ofNramp1 gene in 303 Holstein cattle in Ningxia were detected by the PCR-SSCP technique and the effect ofNramp1 gene c.200C>G locus mutation on milk traits and milk yield was analyzed using a general linear model. The results showed that there was a significant relationship betweenNramp1 gene c.200C>G locus mutation and milk fat， milk yield and somatic cell score at the probability level of 0.05 or 0.01. Therefore we can put the site as cattle somatic cell score， daily milk yield measurement and daily milk fat genetic markers in Chinese Holstein.

Holstein cattle;Nramp1 gene; genetic polymorphism; milk traits; milk yield

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.06

2016-09-16

西北民族大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目(xbmuyjrc201316)；西北民族大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(31920140077)

張麗(1980—)，女，寧夏石嘴山人，博士，副教授，主要從事奶牛分子育種研究。E-mail: zhangli2008@aliyun.com

S823.2

A

1004-1524(2017)03-0389-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 389-394

http://www.zjnyxb.cn

張麗，劉麗霞，陳紅，等. 中國荷斯坦奶牛Nramp1基因多態(tài)性與泌乳性狀及產(chǎn)奶量的關(guān)聯(lián)性分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(3)： 389-394.