徐瑞，胡白石，田艷麗，黃艷寧，謝進，曹亮，彭斯文，朱校奇

（1湖南省農業(yè)生物資源利用研究所，長沙 410125；2南京農業(yè)大學植物保護學院，南京 210095）

應用鎖式探針結合斑點雜交技術檢測甜瓜細菌性葉斑病

徐瑞1，胡白石2，田艷麗2，黃艷寧1，謝進1，曹亮1，彭斯文1，朱校奇1

（1湖南省農業(yè)生物資源利用研究所，長沙 410125；2南京農業(yè)大學植物保護學院，南京 210095）

【目的】甜瓜細菌性葉斑病是危害甜瓜的重要種傳細菌病害，是由丁香假單胞桿菌流淚病致病變種甜瓜菌株（Pseudomonas syringaepv.lachrymans）引起的。論文旨在建立高效、快捷、操作簡單的檢測技術以防止此病原菌傳播?！痉椒ā恳訥enBank公布的甜瓜細菌性葉斑病菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因序列為靶標，設計甜瓜細菌性葉斑病菌特異性鎖式探針，建立鎖式探針與斑點雜交技術結合的檢測體系。以保存的目的菌株為材料，提取DNA作為模板進行鎖式探針連接反應、酶切反應和擴增反應，并將鎖式探針連接反應、酶切反應和擴增反應的反應溫度和反應時間分別進行優(yōu)化。利用優(yōu)化的鎖式探針連接反應、酶切反應和擴增反應分別對健康的甜瓜種子、帶有甜瓜細菌性葉斑病的甜瓜種子、無菌水及25株其他參試菌株進行檢測，測定該體系的特異性。將甜瓜細菌性葉斑病菌的DNA按10倍梯度稀釋，依次稀釋為1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1和1 fg·μL-1作為模板，利用優(yōu)化的鎖式探針連接反應、酶切反應和擴增反應，測定靈敏度。將探針與斑點雜交技術結合建立高通量檢測體系，將上述反應過程中的擴增產物固定于尼龍膜上，將鎖式探針上Zipcode序列的反向互補序列合成cZipcode（檢測探針），檢測探針（cZipcode）用地高辛標記后與產物進行雜交。鎖式探針結合斑點雜交技術分別進行特異性檢測和靈敏度測定。探針與斑點雜交技術結合建立的高通量檢測體系進行人工模擬種子帶菌檢測，進一步驗證該體系的可靠性。利用建立的高通量檢測方法對205份市售疑似帶病的甜瓜種子進行檢測。【結果】鎖式探針特異性測定結果表明，26株甜瓜細菌性葉斑病菌均能得到一條105 bp的特異性條帶，而剩余25株參試菌株及無菌水均無擴增產物產生。靈敏度測定結果表明，當目的菌株的濃度稀釋為1 pg·μL-1時均能檢測到一條105 bp的特異性條帶，所以探針的檢測靈敏度為1 pg·μL-1。探針與斑點雜交技術結合建立的檢測甜瓜細菌性葉斑病菌高通量體系能將甜瓜細菌性葉斑病與所有的參試菌種區(qū)分開，26株甜瓜細菌性葉斑病菌雜交后出現了顯色反應，而25株參試菌株及無菌水均沒有發(fā)生顯色。鎖式探針結合斑點雜交的靈敏度檢測同樣達到1 pg·μL-1。將鎖式探針結合斑點雜交進行人工模擬種子帶菌檢測，能將1粒帶菌種子從1 000粒健康的種子檢測出來，模擬種子帶菌檢測率都能達到0.1%(1/1 000)。從205份市售甜瓜種子中成功檢測到7份市售種子帶菌。將帶菌種子分別加入一定量的無菌水浸泡4 h，提取懸液DNA，將懸液DNA進行PCR擴增后測序，NCBI比對后確定為甜瓜細菌性葉斑病菌?！窘Y論】基于鎖式探針結合斑點雜交技術的檢測體系能夠快速、準確地識別甜瓜細菌性葉斑病。

甜瓜細菌性葉斑?。绘i式探針；斑點雜交；種子

0 引言

【研究意義】 中國是甜瓜生產大國，近年來種植面積的不斷擴大，甜瓜細菌性葉斑病有發(fā)展蔓延的趨勢[1-3]。有研究報道，在某些特定產區(qū)，甜瓜細菌性葉斑病的發(fā)病率在30%以上，嚴重時達到100%，致使甜瓜大幅減產[4-5]。建立快速、靈敏、便捷的甜瓜細菌性葉斑病菌檢測體系用以檢測甜瓜種子，能夠有效防止甜瓜細菌性葉斑病的發(fā)生和傳播?！厩叭搜芯窟M展】SZEMES等[6]運用Padlock探針結合Microarray技術對10種重要的植物病原菌進行了檢測并對這種技術成功地進行了優(yōu)化，結果表明這是一種靈敏度、特異性很好，效率很高的高通量檢測技術；田艷麗等對水稻白葉枯病菌（Xanthomomas oryzaepv.oryzae）、瓜類細菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）等病原菌設計了Padlock探針，并且成功地將其運用于實際樣品檢測，其中在瓜類細菌性果斑病菌上設計Padlock探針能將其成功與燕麥褐條病菌（Acidovorax avenae）區(qū)分開，并且這兩種病原菌所選的特異性序列只有一個堿基的差異[7-8]；王輝等[9]運用斑點雜交技術鑒定了4種支原體即人型支原體（MH）、生殖支原體（MG）、解脲脲原體（UU）和微小脲原體（UP），能夠同時進行多種病原菌的檢測，提高了臨床檢測的效率；黃冠軍[10]建立了柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodispv.citri）鎖式探針檢測技術，此方法特異性很強、靈敏度很高、重復性高；王念武等[11]建立了番茄潰瘍病菌（Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis）基于鎖式探針技術的實時熒光PCR快速檢測方法，并用該方法對來自日本、韓國等的45份樣本進行了分析檢測。此檢測方法高于常規(guī)PCR兩個數量級，成功地從45份樣品中檢測到5份樣品帶有番茄潰瘍病菌；陳艷鴻等[12]建立了鎖式探針結合正向斑點雜交技術對地毯草黃單胞菌大豆致病變種（Xanthomonas axonopodispv.glycines）檢測體系，建立的體系能夠對大豆細菌性斑疹病菌特異性識別，檢測靈敏度達到100 fg·μL-1；李志鋒等[13]對菜豆暈疫病菌（Pseudomonas savastanoipv.phaseolicola）建立了鎖式探針體系，與傳統PCR相比靈敏度高出了10倍；王婷[14]以番茄上危害較大的番茄細菌性潰瘍病菌（Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis）、番茄細菌性斑點病菌（Pseudomonas syringaepv.tomato）和番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）為研究對象，分別建立了基于鎖式探針的反向斑點雜交技術體系，檢測體系能夠特異性的識別目標菌株，實現對靶標序列的特異性檢測；蔡俊等[15]建立的基于小麥矮腥黑穗病菌（Tilletia controversa）超分支滾環(huán)擴增檢測體系，能夠專一地檢測出小麥矮腥黑穗病菌，完全將其與近緣種分開，同樣靈敏度高于常規(guī)PCR 10倍。【本研究切入點】目前主要用普通PCR對甜瓜細菌性葉斑病進行檢測，而普通PCR容易出現假陽性等問題，鎖式探針能夠避免常規(guī)的PCR等檢測方法易受檢測樣品中雜質干擾以及假陽性的現象。迄今為止，尚未見鎖式探針技術檢測甜瓜細菌性葉斑病的相關報道。【擬解決的關鍵問題】以甜瓜細菌性葉斑病菌為研究對象，尋找特異性核苷酸片段，設計Padlock探針。建立甜瓜細菌性葉斑病菌Padlock探針結合斑點雜交的高通量檢測體系，為甜瓜細菌性葉斑病快速檢測提供技術支持。

1 材料與方法

試驗于2012年7月至2014年4月在南京農業(yè)大學完成。

1.1 試驗材料與儀器

共選用51株參試菌株，包括26株丁香假單胞桿菌流淚病致病變種甜瓜菌株、12株丁香假單胞桿菌流淚病致病變種黃瓜菌株及13株其他參試菌株（表1）。

清JS-780全自動凝膠成像分析系統（上海培清科技有限公司）；Eppendorf Mastercycler pro384梯度PCR擴增儀（德國艾本德股份公司）；VP HL-2000紫外交聯儀（美國思伯明科學器材有限公司）；Y-8C雙穩(wěn)定時電泳儀（北京六一儀器廠）。10×UDG緩沖液、Taq DNA連接酶購自New England Biolabs（英國）；dNTP、MgCl2、核酸外切酶Ⅲ、核酸外切酶Ⅰ、10×Taq聚合酶Buffer、Taq聚合酶購自大連寶生物公司；細菌基因組DNA制備試劑盒購自愛思進生物技術有限公司（杭州）；Nylon-N+尼龍膜購自Amersham（英國）；地高辛標記檢測試劑盒購自羅氏公司（德國）。

表1 供試菌株Table 1 Bacterial strains used in this study

續(xù)表1 Continued table 1

1.2 靶標基因選取及鎖式探針設計

將GAPDH作為靶標基因，用Bioedit軟件將所有參試菌株的GAPDH基因序列比對，選取甜瓜細菌性葉斑病基因序列的特異部分為Padlock探針T2端，靠近T2端的作為T1端。然后將設計的Padlock探針與GenBank登錄的所有細菌序列比較以確保Padlock探針的特異性。甜瓜細菌性葉斑病菌探針由生工生物技術公司（上海）合成（表2）。

1.3 核酸提取

所有參試菌株活化后，用Axygen的細菌基因組DNA制備試劑盒（愛思進生物技術（杭州）有限公司）分別提取參試菌株的DNA，操作參照產品說明書。

1.4 鎖式探針連接、酶切和擴增反應

鎖式探針連接反應：1 μL Padlock探針（2 μmol·L-1），1 μL 10×Taq DNA連接酶Buffer，0.4 μL Taq DNA連接酶（40 U·μL-1），6.6 μL滅菌去離子水，2 μL待測模板DNA。反應程序：預變性96℃ 7 min；96℃變性30 s，68℃連接40 s，67℃退火4 min，共30個循環(huán)；最后96℃滅活5 min。

鎖式探針酶切反應：連接反應后的產物管中加入0.5 U Exonuclease I，0.5 U Exonuclease III（TaKaRa Biotechnology Dalian China），1 μL 10×Exonuclease I Buffer [500 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol·L-1MgCl2, 10 mmol·L-1DTT]和11 μL 10×Exonuclease III Buffer [670 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0），67 mmol·L-1MgCl2, 10 mmol·L-1DTT]。反應程序：37℃反應1 h，然后將反應后的產物95℃滅活30 min。

鎖式探針擴增反應：1.5 μL MgCl2（25 mmol·L-1），2.0 μL dNTP（2.5 mmol·L-1each），2.5 μL 10×Taq聚合酶Buffer，0.2 μL Taq DNA聚合酶，2.5 μL Uracil-DNA Glycosylase，1 μL 10×Uracil-DNA Glycosylase Buffer，通用引物各2 μL（2 μmol·L-1），加入2 μL酶切產物作為擴增反應模板，無菌水補足到25 μL。通用引物序列：P1-f19（5′-CGAGATGTACCGCTA TCGT-3′）、P2-r20（5′-TCATGCTGCTAACGGTCG AG-3′）。

1.5 鎖式探針與斑點雜交結合的高通量檢測技術

（1）探針制備取zipcode反向互補序列20 μL，加入Roche DIG雜交試劑盒中的1號4 μL，充分混勻，放置于37℃溫育22—24 h。70℃水浴中終止反應10 min，保存于-20℃冰箱；（2）點樣中和及紫外交聯將PCR產物于沸水浴中10 min中后迅速放置于冰盒中，取2 μL點于尼龍膜上。在干凈的玻璃上放置一張比膜稍大的濾紙并用中和液浸濕，將點樣后的尼龍膜置于上面靜置4 min。然后放于自然空氣干燥30 min，置于紫外交聯儀上交聯5 min。將固定好的雜交膜置于10×SSC溶液中浸潤平衡5 min；（3）將10 mL預雜交液倒入雜交管中，按55℃雜交溫度預熱15 min。將浸潤平衡好的尼龍膜放入預熱的雜交管中，55℃預雜交1 h；（4）取出雜交膜置于另一雜交管中，加入5 mL含有探針的新鮮雜交液，55℃雜交過夜；（5）用100 mL洗脫液A于68℃雜交爐中洗滌30 min，然后用洗脫液B于68℃雜交爐中洗膜兩次，每次15 min。然后用Washing Buffer（50 mL馬來酸加入150 μL吐溫-20）于室溫下輕搖洗脫5 min；（6）將尼龍膜轉置于1×Blocking Buffer靜置30 min，接著放于Antibody solution中靜置40 min，Washing Buffer每次洗脫15 min，洗脫2次，尼龍膜置于30 mL Detection Buffer中平衡5 min，最后置于15 mL現配的Color substrate中避光顯色1—8 h。尼龍膜出現明顯清晰的條帶后，用無菌水浸泡10 min終止反應。

1.6 鎖式探針特異性檢測

根據上述試驗過程，用鎖式探針對51株參試菌株（表1）進行檢測，探針的特異性通過PCR擴增結果（反應體系和反應程序同1.4）和斑點雜交結果（反應體系和反應程序同1.5）來判定。

1.7 鎖式探針靈敏度檢測

甜瓜細菌性葉斑病的DNA依次稀釋為1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1和1 fg·μL-17個梯度，運用鎖式探針將7個梯度分別作為模板擴增（反應體系和反應程序同1.4）及斑點雜交（反應體系和反應程序同1.5），根據擴增和斑點雜交結果判定探針的靈敏度。

1.8 人工模擬種子帶菌檢測

取約200顆健康的甜瓜種子浸泡于甜瓜細菌性葉斑病菌懸液中4 h，將種子自然風干，風干后的帶菌甜瓜種子和健康甜瓜種子按0/1 000、1/1 000、10/1 000、50/1 000和100/1 000混合。浸泡于200 mL無菌水中，振蕩4 h后抽取浸提液，提取DNA作為目標模板進行斑點雜交。

表2 試驗所用鎖式探針序列Table 2 Padlock probes sequence used in this study

1.9 市售種子檢測

對市售的205份甜瓜種子進行檢測。分別將待測種子加入一定量的無菌水浸泡4 h，將浸出液取出離心后提取DNA，然后用對應的探針對提取的DNA進行檢測。

2 結果

2.1 鎖式探針特異性測定

用設計的鎖式探針對51株參試菌株進行試驗。26株目標菌株反應結果為陽性，均擴增到一條105 bp的特異性目的條帶。而剩余25株參試菌株及空白對照均無擴增產物產生（圖1）。說明此研究設計的鎖式探針對甜瓜細菌性葉斑病有較好的特異性。

2.2 鎖式探針靈敏度測定

將DNA濃度為1 ng·μL-1左右的目的菌株按10倍梯度稀釋，依次稀釋為1 ng·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、100 fg·μL-1、10 fg·μL-1和1 fg·μL-1作為模板，共7個梯度。由圖2可以看出，連接體系中加入1 pg目的DNA基因組，都能擴增出105 bp的目的片段。探針的檢測靈敏度為1 pg·μL-1。

2.3 鎖式探針結合斑點雜交特異性檢測

取4 μL鎖式探針擴增產物（2.1部分）點在尼龍膜上進行斑點雜交測定。26株甜瓜細菌性葉斑病病菌雜交后出現了顯色反應，而非目的菌株雜交后無顏色反應（圖3）。

2.4 鎖式探針結合斑點雜交靈敏度檢測

圖1 鎖式探針特異性Fig. 1 Specifcity amplification of Padlock probe

圖2 鎖式探針靈敏度Fig. 2 Sensitivity of Padlock probe

圖3 鎖式探針結合斑點雜交特異性Fig. 3 The specificity of dot-blot hybridization combined with Padlock probe

將4 μL鎖式探針擴增產物（上述2.2）點在尼龍膜上進行斑點雜交測定。同樣靈敏度也能達到1 pg·μL-1（圖4）。

2.5 鎖式探針結合斑點雜進行人工模擬種子帶菌檢測

模擬種子帶菌檢測率達到0.1%（1/1 000）（圖5），能將1粒帶菌種子從1 000粒健康的種子檢測出來。

圖4 鎖式探針結合斑點雜交靈敏度Fig. 4 Sensitivity of dot-blot hybridization combined with Padlock probe

圖5 鎖式探針結合斑點雜進行人工模擬種子帶菌檢測Fig. 5 Detection of artificially infested seeds by dot-blot hybridization combined with Padlock probe

2.6 鎖式探針結合斑點雜交對市售疑似帶有甜瓜細菌性葉斑病的甜瓜種子檢測

運用鎖式探針結合斑點雜交對市售疑似帶有甜瓜細菌性葉斑病的甜瓜種子檢測，從205份市售甜瓜種子中檢測到7份甜瓜種子帶菌。由圖6中可以看出1、12、55、58、104、110和111號種子帶有甜瓜細菌性葉斑病。

圖6 鎖式探針結合斑點雜交對市售甜瓜種子的檢測Fig. 6 Detection of commercially available sweet melon seeds by dot-blot hybridization combined with Padlock probe

3 討論

甜瓜細菌性葉斑病的檢測方法有多種，主要有免疫檢測技術和常規(guī)分子生物學檢測方法，但是這些檢測方法均存在不足之處。凝集試驗擁有能夠定性、操作簡便、檢測周期短等特點，但靈敏度不高。目前植物細菌性病害診斷應用較廣免疫學方法是酶標抗體技術-酶聯免疫吸附法（ELISA）。ELISA能用于定性分析檢測和定量分析檢測[16]，由于ELISA自身反應過程較為復雜，使得ELISA靈敏度和特異性較低，容易出現假陽性和假陰性[17]。流動注射免疫檢測和膠體金標記免疫層析檢測法是兩種新型的免疫檢測技術[18]，也都存在一定的缺陷，流動注射免疫檢測不能實現大批量的樣品分析[19]，膠體金標記免疫層析檢測法穩(wěn)定性和靈敏度不高[20]。基因芯片技術能夠實現一次分析檢測大量樣品和高通量的特點，但其重復性有待提高[21-22]。巢式PCR是運用兩對引物進行擴增容易引起交叉污染[23]。多重PCR具有檢測費用低和操作簡單等特點，但其要求多對引物同時加入同一PCR體系中，引物的競爭性擴增和引物間的配對影響，從而影響其擴增效果[24]。熒光定量PCR具有定量準確、安全快速和準確靈敏等優(yōu)點，但它能與非特異性的雙鏈DNA結合造成假陽性結果[25]。

鎖式探針是一條長的寡聚核苷酸鏈，長度為100 bp左右[26]，探針兩端（磷酸化的5′端和羥基化的3′端）能與目的片段進行特異性結合[27]。探針兩端稱為T1端和T2端，鎖式探針兩端有很強的特異性，能夠檢測單堿基突變[28-29]。鎖式探針設計的前期是找到一條特異性的序列，得到特異性序列后并不能簡單的得到一條特異性探針。特異性探針的設計是一個大量篩選和反復驗證的過程，T1端和T2端的位置、長度、GC含量等都要經過反復考量，多次試驗后才有可能得到一條特異性強和靈敏度高的Padlock探針。

將鎖式探針結合斑點雜交技術能夠實現甜瓜細菌性葉斑病菌高通量檢測。此方法避免了常規(guī)的PCR等檢測方法易受檢測樣品中雜質干擾、以及假陽性的現象。

4 結論

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因為靶標基因，設計了能特異性識別甜瓜細菌性葉斑病的鎖式探針，并且將鎖式探針與斑點雜交技術相結合建立了甜瓜細菌性葉斑病的高通量檢測體系，將反應過程進行了優(yōu)化，該體系靈敏度達到1 pg·μL-1。該方法適用于甜瓜細菌性葉斑病菌的檢測，對防止該病的蔓延傳播有實際應用價值。

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（責任編輯 岳梅）

Development of Padlock Probe Combined with Dot-Blot Hybridization Based Methods for Detection of Bacterial Spot of Melon Leaves

XU Rui1, HU BaiShi2, TIAN YanLi2, HUANG YanNing1, XIE Jin1, CAO Liang1, PENG SiWen1, ZHU XiaoQi1
(1Institute of Agricultural and Biological Resources Utilization, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125;2College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)

bacterial spot of melon leaves; Padlock probe; dot-blot hybridization; seed

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.04.008

2016-10-14；接受日期：2016-11-23

國家“863”計劃（2012AA101501）、國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303117）

聯系方式：徐瑞，E-mail：real88xu@163.com。通信作者朱校奇，E-mail：zhuxiaoqi222@163.com

Abstract：【Objective】 Bacterial spot of melon leaves caused byPseudomonas syringaepv.lachrymansis distributed widely in the world and inflicts different degrees of damage.P. syringaepv.lachrymansis a typical seed-borne pathogen. The objective of this study is to build effective, commercially viable and convenient detecting technologies and to prevent the spread of this pathogen.【Method】The house-keeping gene of DNA glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was selected as the target gene, the specific Padlock probe was designed for bacterial leaf spot of melon, and a bacterial detection system based on Padlock probe combined with dot-blot hybridization was developed. The target strain was selected as experimental materials, and DNA was extracted as a template for ligation reaction, enzyme-cleavage reaction and amplification reaction. The reaction temperature and reaction time of the ligation reaction, enzyme-cleavage reaction and amplification reaction were optimized. The optimized reactions were tested for healthy melon seeds, melon seeds with bacterial spot of melon leaves, sterile water and 25 experimental strains. In order to determine the sensitivity of Padlock probe, DNA of the target strain was diluted to 1 ng·μL-1, 100 pg·μL-1, 10 pg·μL-1,1 pg·μL-1, 100 fg·μL-1, 10 fg·μL-1and 1 fg·μL-1as the templates. Sensitivity was determined by optimized ligation reaction, enzyme-cleavage reaction and amplification reaction. Padlock probe combined with dot-blot hybridization was developed, the amplification product in the course of the reaction was fixed on the nylon membrane, the reverse complementary sequence of the Zipcode sequence was synthesized into cZipcode (detection probe), the detection probe (cZipcode) was labeled with digoxigenin and hybridized with the amplified product. Padlock probe combined with dot-blot hybridization techniques were used for specific detection and sensitivity. Artificial infestation seeds were detected to further verify the reliability of the system. A total of 205 commercially melon seeds with suspected disease were detected by high throughput detection method.【Result】The specificity of the Padlock probe showed that a specific band of 105 bp was got from 26 strains of bacterial spot of melon leaves, while the remaining 25 strains and sterile water were not amplified products. The results of sensitivity showed that the target strain was diluted to 1 pg·μL-1and got a specific band of 105 bp, so the detection sensitivity of the Padlock probe was 1 pg·μL-1. Padlock probe could distinguish bacterial spot of melon leaves from all other experimental strains and its sensitivity could be up to 1 pg·μL-1. Twenty-six strains of bacterial spot of melon leaves had color reaction, the remaining 25 strains and sterile water did not have color reaction. The sensitivity of Padlock probe combined with dot-blot hybridization also could be up to 1 pg·μL-1. Padlock probe combined with dot-blot hybridization could detect one bacterial seed from 1 000 healthy seeds, and the detection rate reached 0.1% (1/1 000). Seven commercially seed-borne bacteria were successfully detected from 205 commercially melon seeds. The seven seed-borne bacteria, respectively, were soaked in sterile water for 4 h, DNA was extracted for PCR amplification and sequencing, the results of DNA sequencing were compared with NCBI and verified the bacterial spot of melon leaves. 【Conclusion】Detecting system based on Padlock probe combined with dot-blot hybridization could detectP. syringaepv.lachrymansfrom sweet melon fast and accurately.