戴錫玲　曹建國　王全喜

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院　上?！?00234）

涂片法是一種將游離的細(xì)胞和動(dòng)、植物中比較疏松的組織均勻地涂在載玻片上的制作方法，是常見的臨時(shí)玻片標(biāo)本制作方法之一［1］，適用于微小的（微生物、細(xì)胞）或呈液體狀態(tài)（血液）的實(shí)驗(yàn)材料［2］，在觀察動(dòng)、植物染色體時(shí)通常采用該方法［3-5］；在研究高等植物的孢粉發(fā)育時(shí)也經(jīng)常用到此方法，還有切片法［6-7］。本文將涂片法應(yīng)用于蕨類植物瓶爾小草（Ophioglossum vulgatum）孢子發(fā)生發(fā)育的觀察，取得了良好的效果。

瓶爾小草是多年生的小型草本蕨類植物，葉通常單生，有營養(yǎng)葉和孢子葉之分，孢子囊穗長2.5～3.5 cm，遠(yuǎn)超出于營養(yǎng)葉之上［8］（圖 1，本文附圖見封四）。制作涂片時(shí)，先將載玻片和蓋玻片清洗干凈，于載玻片的中間滴一滴蒸餾水，取不同發(fā)育時(shí)期的瓶爾小草孢子囊穗（圖2），因其孢子囊由孢子囊穗基部到頂端漸次成熟［7］，因此，將孢子囊穗的上、中、下部分別折斷，在斷面顯露2個(gè)超半圓形的孢子囊（圖3），將孢子囊的斷面在水滴中點(diǎn)蘸，使孢子囊中的大量不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞（如孢子母細(xì)胞或孢子）落入水中，這些細(xì)胞群肉眼可見，然后左手持平載玻片（或放在平臺上），右手用鑷子夾住蓋玻片，先使蓋玻片的一邊接觸到水，且蓋玻片和載玻片成45°角，在向左推的同時(shí)向下均速降蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，使細(xì)胞成一薄層分布，去掉多余的水分后利用光學(xué)顯微鏡鏡檢。

在瓶爾小草孢子囊的發(fā)育早期，孢子囊內(nèi)數(shù)量眾多的孢原細(xì)胞為不規(guī)則多邊形，排列緊密［7］，因此很難被蘸取到水滴中。當(dāng)孢原細(xì)胞分裂形成孢子母細(xì)胞時(shí)，因絨氈層原生質(zhì)團(tuán)侵入孢子母細(xì)胞間，使之相互之間分離，且部分細(xì)胞壁變圓（圖4），最終孢子母細(xì)胞呈球形，徹底彼此分離，周圍絨氈層原生質(zhì)團(tuán)中含大量淀粉粒（圖5）。隨后，孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四分孢子，表面膜將四分孢子緊密包圍在一起，外周的淀粉粒仍然較多（圖6）。瓶爾小草四分孢子呈四面體型排列，孢子為橢球形，表面光滑，此時(shí)裂縫尚未形成（圖7）。隨后，在孢子近極面的質(zhì)膜收縮，出現(xiàn)三裂縫最初的褶皺，并在孢子表面形成外壁，最初外壁很薄，較平滑；此時(shí)，絨氈層原生質(zhì)團(tuán)更加濃厚，其中淀粉粒的數(shù)量較孢子母細(xì)胞階段進(jìn)一步增加（圖8）。隨著外壁的增厚，孢子的透明度下降，裂縫加粗，長度幾達(dá)孢子赤道線，孢子近極面出現(xiàn)少量大的疣塊狀突起（圖9）。隨著成壁物質(zhì)在孢子表面的沉積，裂縫明顯變短變矮，孢子表面具密集均勻的孔穴（圖10）。孢子外壁厚度繼續(xù)增加，表面發(fā)育出不規(guī)則低矮的脊?fàn)钔黄?，部分脊?fàn)钔黄鹣嗷ト诤希藭r(shí)，絨氈層殘余物中的淀粉粒基本消失（圖11）。最后，孢子發(fā)育為球形，脊?fàn)钔黄鹣嗷ト诤铣删W(wǎng)狀；在孢子外壁表面形成周壁，周壁與外壁性質(zhì)不同，呈褐色；此時(shí)，裂縫最短最細(xì)，長約為孢子半徑的1/3（圖12）。

與切片法［6-7］相比，利用涂片法觀察蕨類植物孢子發(fā)生發(fā)育具有如下特點(diǎn)：①操作簡便：涂片法觀察孢子發(fā)育只需取材、折斷（或切斷）孢子囊、涂片、蓋片、鏡檢等5步，只需用光學(xué)顯微鏡觀察即可，相比切片法操作更簡便，更適合于教學(xué)中采用。②不使用化學(xué)試劑：涂片法只需要蒸餾水，不需要任何化學(xué)試劑（如切片法中需要固定劑、染色劑等）。因此，涂片法相對來說更經(jīng)濟(jì)且環(huán)保。③觀察效果直觀：因涂片法在操作過程中不使用任何化學(xué)藥品處理孢子，最大限度保持了孢子的活體狀態(tài)，因此，孢子的形態(tài)不會發(fā)生變化（若利用切片法觀察早期的孢子會出現(xiàn)皺縮變形等現(xiàn)象），使孢子各發(fā)育階段的形狀和大小特征更真實(shí)可靠。此外，該方法對孢子的顏色及裂縫和紋飾表面形態(tài)變化的觀察也是切片法所無法直觀觀察到的。④適用于孢子囊較大的種類：蕨類植物的孢子囊大小差異較大。像瓶爾小草這樣孢子囊較大的種類，不用解剖鏡，徒手就可以折斷孢子囊，使孢子暴露并進(jìn)行涂片。而孢子囊較小的種類，例如蜈蚣草Pteris vittata，需將孢子囊在解剖鏡下刺破，使孢子散發(fā)在載玻片上［9］，利用涂片法操作有難度。

蕨類植物屬于高等的孢子植物，其孢子經(jīng)孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生，也是配子體世代的第1個(gè)細(xì)胞，在蕨類植物的世代交替中起著重要的作用。因此，利用簡便的涂片法可以加深學(xué)生對蕨類植物的生活史及孢子發(fā)生發(fā)育知識的理解，培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力和學(xué)習(xí)興趣，使理論知識變得直觀生動(dòng)。

［1］馮玉樺.玻片標(biāo)本的種類和制作.生物學(xué)教學(xué)，2004，29(5)：46.

［2］朱曉林，王靜，許香春.顯微觀察類實(shí)驗(yàn)中臨時(shí)玻片標(biāo)本的制作.實(shí)驗(yàn)教學(xué)與儀器，2015(2)：37.

［3］于天飛，呂建偉，李默.鳥類骨髓細(xì)胞染色體的制備.生物學(xué)教學(xué)，2010，35(6)：36.

［4］宋娟娟，唐源江，廖景平,等.瀕危植物矮沙冬青減數(shù)分裂期染色體行為的觀察.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2003，11(2)：166.

［5］黃遠(yuǎn).新黑麥減數(shù)分裂時(shí)期的定位觀察.生物學(xué)通報(bào)，2008，43(11)：53.

［6］戴錫玲，王賽賽，王全喜.團(tuán)扇蕨是觀察蕨類植物孢子囊發(fā)育的好材料.生物學(xué)通報(bào)，2012，47(9)：52.

［7］戴錫玲，包家茜，曹建國,等.瓶爾小草是觀察厚囊蕨類孢子囊發(fā)育的好材料.生物學(xué)通報(bào)，2015，50(2)：42.

［8］中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志：2卷.北京：科學(xué)出版社，1959.

［9］戴錫玲，張蕾，王全喜.富砷植物蜈蚣草孢子和配子體發(fā)育的顯微觀察.生物學(xué)通報(bào)，2012，47(5)：55.