馬宏境，曾妮，黃少祥(天津市第五中心醫(yī)院，天津300450)

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青蒿琥酯對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的抑制作用及機(jī)制

馬宏境，曾妮，黃少祥
(天津市第五中心醫(yī)院，天津300450)

目的 觀察青蒿琥酯對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。方法 常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞后，不同濃度(0、25、50、75、100 μmol/L)的青蒿琥酯作用A549細(xì)胞，采用CCK-8法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制率，Western blotting法檢測(cè)mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子和自噬相關(guān)蛋白p62、LC3B表達(dá)變化。結(jié)果 25 μmol/L及以上濃度的青蒿琥酯可抑制A549細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間和濃度依賴性(P均<0.05)。不同濃度(0、25、50、75、100 μmol/L)的青蒿琥酯作用A549細(xì)胞48 h可降低p62表達(dá)，增加LC3B表達(dá)，并降低mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，并呈劑量依賴性。青蒿琥酯聯(lián)合自噬抑制劑3-MA可增加A549細(xì)胞的生存率(P<0.05)。結(jié)論 青蒿琥酯可能通過(guò)下調(diào)mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)、誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬從而抑制A549細(xì)胞增殖。

肺腫瘤；青蒿琥酯；細(xì)胞自噬；細(xì)胞增殖；雷帕霉素靶蛋白

青蒿琥酯是從黃花蒿葉中提取的單體成分[1]，能治療瘧疾，具有抗腫瘤的功效。研究表明，青蒿琥酯主要通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少局部腫瘤組織的血管形成、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[2～5]。多項(xiàng)研究表明，不同的試驗(yàn)條件下，自噬能促進(jìn)細(xì)胞存活或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[6～9]，因此，可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生及程度來(lái)促進(jìn)人體正常細(xì)胞的存活，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是細(xì)胞能量代謝研究領(lǐng)域一個(gè)重要調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，位于PI3K/Akt信號(hào)通路的下游，在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[10]。mTOR能感知細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)狀況，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)氨基酸和ATP含量的變化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞本身的自噬水平[11]。核糖體蛋白S6是mTOR復(fù)合物1(mTORC1)下游的主要效應(yīng)分子，通過(guò)其表達(dá)變化能說(shuō)明mTOR活性表達(dá)水平[12]。目前國(guó)內(nèi)外研究多采用p62及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)作為自噬發(fā)生的分子標(biāo)記物[13，14]。2015年6月～2016年6月，本研究觀察了青蒿琥酯對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 青蒿琥酯由廣東新南方青蒿科技有限公司提供，用倍比稀釋法調(diào)整藥物濃度。人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于北京協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Hyclone 公司；自噬抑制劑3-MA購(gòu)于Sigma公司；β-actin抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；S6、phospho-S6、LC3B、P62抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology公司，HRP-標(biāo)記的羊抗鼠/兔購(gòu)于Santa Cruz公司，Cell counting kit-8(CCK-8試劑盒)購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，飽和濕度。間隔48～72 h傳代。

1.3 A549細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 采用CCK-8法。制備A549細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞為3×107/L，置于96孔板，每孔100 μL。于培養(yǎng)24 h細(xì)胞完全貼壁后隨機(jī)分為兩部分。一部分隨機(jī)分為5組，分別加入0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯100 μL；另一部分隨機(jī)分為5組，分別加入0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯，同時(shí)加入3 mmol/L 3-MA，各組均設(shè)置10個(gè)復(fù)孔。分別作用24、48、72 h，用CCK-8試劑盒檢測(cè)A549細(xì)胞存活情況。用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450 nm的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(AX-A)/(A0-A)]×100%。AX為加藥孔OD值，A為未加細(xì)胞，單純藥物的OD值；A0為未加藥物的OD值。青蒿琥酯IC50使用SPSS17.0軟件進(jìn)行計(jì)算。

1.4 細(xì)胞內(nèi)mTOR信號(hào)蛋白S6、自噬特異性蛋白p62、LC3B蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液后接種于6孔板，培養(yǎng)24 h，饑餓處理12 h后分別加入0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯各100 μL，作用48 h提取總蛋白，用BCA法定量，檢測(cè)樣品加入5×上樣緩沖液后煮沸10 min，根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整每份樣品蛋白上樣量，進(jìn)行上樣。以β-actin為內(nèi)參，SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。室溫條件下常規(guī)封閉1 h，加入一抗，于4 ℃條件下孵育過(guò)夜。用HRP標(biāo)記二抗，室溫條件下繼續(xù)孵育1 h，經(jīng)TBST洗滌后，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)。用Imagine J軟件進(jìn)行檢測(cè)。蛋白相對(duì)表達(dá)量(校正后)=蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯單獨(dú)作用24 h，A549細(xì)胞增殖抑制率分別為7.1%、15.0%、35.7%、46.3%、60.2%；作用48 h，A549細(xì)胞增殖抑制率分別為7.7%、20%、46%、53%、70%；作用72 h，A549細(xì)胞增殖抑制率分別為8.3%、25.0%、53.0%、55.7%、73.4%。A549細(xì)胞增殖抑制率隨藥物濃度的增加而增加、隨作用時(shí)間的增加而增加。24、48、72 h青蒿琥酯的IC50分別為(46.2±5.4)、(75.0±6.7)、(124.4±5.6)μmol/L。經(jīng)0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯與3-MA共同作用24 h，A549細(xì)胞增殖抑制率分別為7%、14.2%、34.9%、49.3%、62.2%；作用48 h，A549細(xì)胞增殖抑制率分別為7.5%、16.1%、40.7%、43.1%、62.0%；作用72 h，A549細(xì)胞增殖抑制率分別為8.0%、20.0%、48.9%、50.1%、65.7%。同時(shí)點(diǎn)同濃度的青蒿琥酯加入3-MA后，A549細(xì)胞增殖抑制率降低(P均<0.05)。

2.2 青蒿琥酯對(duì)mTOR信號(hào)蛋白S6活性的影響 經(jīng)0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯單獨(dú)作用48 h，結(jié)果顯示，當(dāng)藥物作用濃度為25 μmol/L以上時(shí)，隨著藥物濃度的增加，p-S6蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，S6蛋白表達(dá)水平不變，p-S6蛋白相對(duì)于S6蛋白表達(dá)量分別為1.41±0.12、1.40±0.09、1.25±0.11、1.02±0.07、0.70±0.06；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3 青蒿琥酯對(duì)自噬特異性蛋白p62、LC3B表達(dá)的影響 經(jīng)0、25、50、75、100 μmol/L青蒿琥酯單獨(dú)作用48 h，p62蛋白相對(duì)于內(nèi)參β-actin的相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.10、0.81±0.08、0.70±0.06、0.64±0.04、0.57±0.04，LC3BⅡ/Ⅰ分別為0.43±0.05、0.78±0.09、1.22±0.11、1.59±0.14、1.98±0.17。與未加藥物相比，p62表達(dá)隨青蒿琥酯濃度增強(qiáng)而降低(P均<0.05)。LC3B表達(dá)增強(qiáng)，LC3BⅡ/Ⅰ值增加，LC3BⅠ向LCBⅡ轉(zhuǎn)化增多，細(xì)胞自噬增強(qiáng)(P<0.01)。

3 討論

研究表明，青蒿琥酯能在體外培養(yǎng)環(huán)境下抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[15～17]。其機(jī)制可能為通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5]。自噬這種可導(dǎo)致細(xì)胞死亡的反應(yīng)方式，在肺部腫瘤的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域逐漸受到重視。

本研究選取A549細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用。自噬主要參與細(xì)胞的能量代謝，依賴于生存環(huán)境的不同來(lái)發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)功能[7,18]，即促進(jìn)細(xì)胞生存或死亡。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路已經(jīng)被證實(shí)在細(xì)胞內(nèi)對(duì)自噬發(fā)揮最直接的調(diào)控作用[10]，S6是mTOR下游的靶分子，通常通過(guò)其磷酸化水平來(lái)反映該信號(hào)通路的活性。mTOR信號(hào)減弱可以導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生自噬。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的青蒿琥酯作用后，p-S6蛋白表達(dá)減低，這提示青蒿琥酯可能通過(guò)下調(diào)mTOR信號(hào)通路活性促進(jìn)細(xì)胞自噬體形成。

p62在自噬發(fā)生早期可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬體的構(gòu)成，在末期其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)逐漸減少。通常可通過(guò)檢測(cè)p62在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平來(lái)表示自噬發(fā)生的程度。在自噬反應(yīng)發(fā)生的初期，LC3參與了自噬反應(yīng)的主要效應(yīng)器即自噬溶酶體的構(gòu)成，LC3(微管相關(guān)蛋白1輕鏈3)的表達(dá)水平可表示自噬的發(fā)生程度，通過(guò)測(cè)算LC3BⅡ與LC3BⅠ的比值可表示自噬體的數(shù)量和自噬發(fā)生的程度。即LC3BⅡ/Ⅰ越高，自噬的程度越高。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的青蒿琥酯作用后，p62蛋白表達(dá)減低，LC3B蛋白表達(dá)升高，LC3BⅡ/Ⅰ值增加，提示青蒿琥酯誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生自噬，而且自噬反應(yīng)的程度隨藥物作用濃度、作用時(shí)間的增加而逐漸加強(qiáng)。本研究加入細(xì)胞自噬抑制劑3-MA后細(xì)胞增殖抑制率降低，進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞自噬能抑制細(xì)胞生存。

綜上所述，青蒿琥酯能抑制A549細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是下調(diào)mTOR信號(hào)通路的活性，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬。

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黃少祥(E-mail:13820759588@163.com)

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2017-04-02)