吳殿磊,徐光華,劉娜(1西藏民族大學附屬醫(yī)院,陜西咸陽7108；延安大學附屬醫(yī)院)

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HBV DNA整合與乙型肝炎、PHC關(guān)系的研究進展

吳殿磊1,2,徐光華2,劉娜2
(1西藏民族大學附屬醫(yī)院,陜西咸陽712082；2延安大學附屬醫(yī)院)

乙型肝炎病毒(HBV)是導致慢性肝炎的主要病因,同時亦是原發(fā)性肝細胞癌(PHC)的主要危險因素之一，研究證實HBV可通過整合自身基因進入到宿主基因組中或通過其結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白,或通過表觀遺傳導致宿主基因突變,突變主要包括肝細胞部分DNA缺失和染色體重排等。HBV DNA整合對病毒本身和宿主肝細胞可產(chǎn)生影響，系列研究表明,乙型肝炎慢性化和PHC的發(fā)生發(fā)展與HBV DNA選擇性整合可能存在關(guān)聯(lián),與乙型肝炎慢性化和PHC相關(guān)聯(lián)整合位點的鑒定,將為乙型肝炎慢性化機制研究提供新的思路和線索,對未來臨床基因診斷和治療CHB及PHC有指導意義。

乙型肝炎；原發(fā)性肝細胞癌；乙型肝炎病毒DNA;整合位點鑒定

HBV是迄今發(fā)現(xiàn)最小的不完全環(huán)狀嗜肝DNA病毒，HBV感染可致急慢性乙肝，亦是誘發(fā)原發(fā)性肝細胞癌(PHC)的重要危險因素之一。HBV DNA可通過整合進入到宿主基因組中或通過其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白,或通過表觀遺傳導致宿主基因突變和染色體重排[1],突變主要包括病毒基因、宿主基因和染色體的變化，HBV DNA整合對病毒本身和宿主肝細胞可產(chǎn)生影響，部分突變與乙肝慢性化和終末期肝病(肝硬化、PHC)有關(guān)?，F(xiàn)就HBV DNA整合與慢性乙肝、隱匿性HBV感染(OHBI)、PHC的關(guān)系綜述如下，以期為乙肝慢性化機制研究及PHC基因診斷和治療提供新的思路和線索。

1 HBV DNA整合概述

雖然HBV是DNA病毒，但因其在復制過程中存在獨特的前基因組反轉(zhuǎn)錄過程，所以其基因組有機會整合至人基因組中。與逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染不同,HBV DNA整合不是病毒復制所必須,所以HBV基因整合在其自然史中并非常規(guī)事件[2,3]。1980年首次在乙肝相關(guān)性肝細胞癌中檢測到HBV DNA整合[4]，以后相繼在急、慢性乙肝、肝癌組織中檢測到多種不同形式的HBV DNA整合[3,5～8]。HBV基因整合至宿主基因組中有利于其持久感染,長期的慢性炎癥可致肝細胞生命周期改變和增殖,這就增加了宿主基因組DNA終端的數(shù)量,從而有利于HBV DNA整合到宿主基因組中,這一過程拓撲異構(gòu)酶I是關(guān)鍵性因子[9，10]。宿主基因組最常見的改變是倒立重復和缺失[4]。研究表明,HBV基因整合方式分為起始于順向重復序列(DR)1，DR1向負鏈3'端延伸；起始于DR1向負鏈5'端延伸；起始于DR2向負鏈3'端延伸；起始于DR2向負鏈5'端延伸[2,11]。

慢性炎癥或病毒重疊感染可使肝細胞暴露于氧化應激或誘變環(huán)境,喪失DNA修復能力,這可能是HBV DNA能整合至宿主基因組的重要原因[9]。HBV整合可誘導宿主基因組相應位置重排或部分缺失[12]。近期研究表明HBV DNA整合并非完全隨機,存在優(yōu)先選擇性。基因轉(zhuǎn)位、融合、缺失和廣泛的基因組不穩(wěn)定性可能是HBV DNA整合的原因,整合后宿主基因組的改變有機會產(chǎn)生選擇性肝細胞克隆,HBV從而獲益[4]。HBV基因整合一方面有利于其生存,另一方面可致宿主基因組某些位點突變,部分突變與乙肝慢性化有關(guān),亦與PHC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

2 HBV DNA整合與肝細胞癌變的關(guān)系

HBV感染是PHC的重要危險因素之一，文獻報道，80%以上的肝癌組織中可檢測到HBV DNA整合[13,14]。肝癌發(fā)生可能是HBV整合的結(jié)果[15],HBV整合可致肝細胞凋亡和抗癌基因信號通路異常[4]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，應用逆轉(zhuǎn)錄PCR、Alu PCR和限制性核酸酶切位點PCR技術(shù),HBV感染者甚至急性自限性乙肝患者HBV DNA能插入到機體基因組中。在85%～90%與HBV感染相關(guān)性PHC患者中能檢測到整合的HBV DNA[9]。

據(jù)報道大部分整合發(fā)生在常見的基因脆弱部位附近或其中,如易于被刪除、斷裂、重排和擴增的基因[4],控制基因增殖、細胞信號級聯(lián)轉(zhuǎn)導的序列變異或不穩(wěn)定Alu序列和微衛(wèi)星序列變化可致癌基因的發(fā)生發(fā)展。整合到基因組中編碼區(qū)或基因調(diào)節(jié)區(qū)的HBV DNA可改變宿主基因的表達或改變該基因所表達蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能,這有可能導致惡變[9]。整合的HBV DNA表達合成成熟的preS/S和X蛋白觸發(fā)級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導亦可使肝細胞發(fā)生惡變[9]。HBV基因組的增強子原件能按照一定方向或與位置無關(guān)的方式激活異源性啟動子,HBV基因增強子能反式激活距離整合處100 kb的宿主細胞基因[4]。

PHC患者HBV DNA整合靶基因區(qū)在早期研究中未明確，最近10年才有部分研究關(guān)注在PHC中HBV DNA整合位點和插入性突變。Paterlini-Bréchot等[5]采用HBV-Alu PCR技術(shù)從肝細胞癌患者標本中分離出9個HBV DNA整合區(qū),這表明病毒導致的突變與PHC有關(guān)。位于HBV DNA整合區(qū)不同的基因具有特定關(guān)鍵性功能,這些功能與細胞信號級聯(lián)轉(zhuǎn)導或許有關(guān)。另外他們發(fā)現(xiàn)HBV DNA整合的靶基因：hTERT和IP3R基因在2例患者腫瘤組織中均出現(xiàn),尤其人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因[5]。Kimbi等[16]擴增5例急性乙肝患者和1例爆發(fā)性肝炎患者血HBV DNA和宿主基因組相應染色體DNA。在1例急性乙肝患者中,HBV DNA整合到宿主染色體7q11.23的位置,這是威廉姆斯-博伊倫綜合征關(guān)鍵區(qū)域1基因所在位置,這個基因包含大量Alu重復序列、重復原件,這些位點是HBV DNA容易插入和重組的位點，且整合子在威廉姆斯-博伊倫綜合征患者通常被刪除基因序列的區(qū)域內(nèi),引起雜合性缺失。該研究組亦提到整合子克隆擴增與腫瘤形成有關(guān),而早期HBV DNA整合可能誘發(fā)肝癌發(fā)生。

3 HBV DNA整合與慢性乙肝的關(guān)系

Murakami 等[6]以Alu-PCR法分別檢測了19例急性乙肝患者、12例HBV相關(guān)慢性活動性肝炎患者、19例急性乙肝患者中3例肝臟標本中發(fā)現(xiàn)HBV DNA整合、全部12例HBV相關(guān)慢性活動性肝炎患者肝臟標本中均發(fā)現(xiàn)存在病毒整合，表明慢性乙肝HBV DNA整合率顯著高于急性乙肝，推測乙肝慢性化與HBV DNA整合有關(guān)。Shi等[17]報道HBV DNA特定位點整合可致T細胞缺陷，而乙肝慢性化與T細胞缺陷有關(guān)。

Minami等[18]研究慢性HBV感染HBV DNA在肝細胞的整合,在6例患者肝臟組織中他們檢測到42個獨立的HBV DNA和肝細胞基因的結(jié)合部位,其中20個完成染色體定位。表明HBV DNA與宿主基因的每個整合,受到宿主6個基因克隆體中1個的影響。在這6個基因中,AXIN 1 (Axis)是抑制肝癌的基因;EYA3 、bobby sox和odd Oz 2基因?qū)τ谄鞴俚纳L發(fā)育有重要作用,但他們的功能尚未明確。該研究提示HBV DNA優(yōu)先整合到3號染色體?；旌舷蛋籽?MLL)2和4基因亦被認為是HBV DNA優(yōu)先整合的靶基因[19,20]。MLL4基因位于19號染色體19q13.1,該處基因在實體瘤中研究顯示存在擴增和重排。整合后特定位點表達的HBV X (HBx)或MLL4轉(zhuǎn)錄初級產(chǎn)物和蛋白與肝癌的發(fā)生有關(guān)[20]。乙肝慢性化與HBV DNA整合及優(yōu)先的選擇性整合可能存在關(guān)聯(lián)。

早期，人們主要應用印記雜交、克隆測序和各種PCR的方法[20]來確定HBV整合。如今已開發(fā)應用新一代高通量測序(NGS)技術(shù)來鑒定HBV DNA特定的整合位點[21]。NGS亦稱深度測序,與第一代Sanger測序法相比，NGS 技術(shù)具有通量大、時間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點。NGS技術(shù)已大規(guī)模用于轉(zhuǎn)錄組測序、染色體免疫共沉淀測序、基因組甲基化測序、宏基因組測序、基因組從頭測序和全基因組的重新測序等方面。目前，主要的高通量測序平臺較多，以Hiseq和Miseq應用最為廣泛。

考慮到全基因組測序費用過高,Ding等[22]開發(fā)了另外一種可選的方法,用于鑒定HBV DNA整合位點,這一價廉而有效的方法稱為MAPS法[22]。通過這種方法,除了兩個熟悉的FN1和TERT1靶基因,他們還鑒定出2個新的HBV DNA整合位點基因,即肌動蛋白調(diào)節(jié)4和SMAD5基因。他們發(fā)現(xiàn)HBV DNA優(yōu)先選擇17號染色體,且更多地整合到人基因轉(zhuǎn)錄位點。

4 HBV DNA整合與OHBI的關(guān)系

OHBI可檢測到HBV DNA,但血清中HBsAg等檢測不到。HBV DNA整合與OHBI關(guān)系尚不清楚，Bhargava等[23]研究發(fā)現(xiàn)，OHBI可致外周血淋巴細胞損害,OHBI與氧化應激有關(guān)。Pollicino等[24]報道了1例43歲PLC患者血清HBV和HCV檢測陰性,但HBV-Alu PCR顯示存在HBV DNA整合體,這個整合體位于PARD6G 基因上游,該基因在肝腫瘤組織中過表達。這兩項研究表明OHBI導致基因表達異常可能與癌基因致癌途徑有關(guān)。

HBV DNA有效整合到宿主基因組可增加OHBI幾率，同時亦增加了癌變機會。最常見的HBV整合位點發(fā)生在MLL和hTERT基因,另外,60S核糖體蛋白基因、血小板衍生的生長因子受體基因和鈣信號相關(guān)基因突變亦可能與癌變有關(guān)[3]。

綜上所述，我們可通過PCR、基因測序、基因克隆、芯片和免疫組化等方法來研究HBV DNA對宿主基因組的影響,主要包括與乙肝慢性化和PHC發(fā)生發(fā)展有關(guān)的研究。初步的研究表明乙肝慢性化與HBV DNA整合及優(yōu)先的選擇性整合可能有關(guān)，但有待進一步研究證實。由HBV DNA整合引起的宿主基因突變鑒定及如何致PHC成為最近該領(lǐng)域的研究熱點。機體癌基因產(chǎn)生和激活是多因素共同作用的結(jié)果，其中HBV DNA整合到宿主基因組是直接機制之一,其他還可通過其結(jié)構(gòu)蛋白、分泌蛋白,或通過表觀遺傳致宿主基因突變,部分突變與PHC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但這些因素致癌機制及各因素之間的關(guān)系有待進一步研究。

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國家自然科學基金資助項目(81560102)。

徐光華(E-mail:wdianlei@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.25.037

R512.6；R735.7

A

1002-266X(2017)25-0107-03

2017-02-15)