肖文丹,葉雪珠,孫彩霞,張 棋,徐 萍 (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,浙江 杭州 310021)

鉻耐性菌對(duì)土壤中六價(jià)鉻的還原作用

肖文丹,葉雪珠*,孫彩霞,張 棋,徐 萍 (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,浙江 杭州 310021)

選擇7種全國(guó)性典型土壤(黃壤、紅壤、石灰性紫色土、青紫泥、黑土、磚紅壤和潮土),研究微生物群落對(duì)鉻脅迫的響應(yīng)以及土著鉻耐性菌對(duì)土壤中六價(jià)鉻的還原作用.結(jié)果表明,在重金屬鉻的脅迫作用下,鉻耐性菌成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群,在黃壤、紅壤、石灰性紫色土、青紫泥、黑土、磚紅壤和潮土中豐度依次為 75.2%、89.9%、77.3%、65.3%、72.8%、65.4%、92.8%,并在六價(jià)鉻還原過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用,7種土壤中微生物對(duì)六價(jià)鉻還原的貢獻(xiàn)率分別為 14.4%、44.0%、20.6%、34.9%、21.9%、21.7%、22.0%.微生物對(duì)六價(jià)鉻還原的貢獻(xiàn)率主要受土壤中亞鐵含量和顆粒組成影響.采用 PCR-DGGE-克隆測(cè)序技術(shù)鑒定了這 7種土壤中鉻耐性菌的種類,主要為芽孢桿菌(Bacillus sp.)、埃希氏菌(Escherichia sp.)、異常球菌(Deinococcus sp.)、小單胞菌(Micromonospora sp.)、甲基桿菌(Methylobacterium sp.)、馬賽菌(Massilia sp.)、酸桿菌(Acidobacterium sp.)、叢毛單胞菌(Comamonas sp.)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)和節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.).關(guān)鍵詞：六價(jià)鉻；鉻耐性菌；優(yōu)勢(shì)菌群；克隆測(cè)序；相關(guān)分析

隨著工業(yè)的發(fā)展,鉻及其化合物應(yīng)用越來(lái)越多,如電鍍、皮革、印染、化工等行業(yè)[1].大量含鉻的廢水、廢渣隨意排放,導(dǎo)致土壤、水體和生物遭到不同程度的污染[2].土壤中的鉻通常以三價(jià)和六價(jià)2種穩(wěn)定價(jià)態(tài)存在,三價(jià)鉻在土壤中具有移動(dòng)性弱和生物有效性低的特點(diǎn),而六價(jià)鉻具有移動(dòng)性強(qiáng)和生物有效性高的特點(diǎn),并且六價(jià)鉻對(duì)人體的毒性比三價(jià)鉻高約100倍[3-4].根據(jù)脅迫機(jī)制,長(zhǎng)期生活在鉻污染土壤中的微生物,會(huì)對(duì)惡劣環(huán)境產(chǎn)生抗逆性,生成一些對(duì)抗不利因素的自我保護(hù)措施.因此,鉻污染土壤中生存著一些耐受高濃度六價(jià)鉻的微生物,即鉻耐性菌,

其中有些耐性菌還能將高毒的六價(jià)鉻還原成低毒的三價(jià)鉻,間接地提高對(duì)鉻的抗逆性[5-6].

目前已經(jīng)報(bào)道的鉻還原菌主要為Pseudomonas[7-8]、Microbacterium[9]、Desulfovibrio[10]、Enterobacter[1]、Escherichia coli[11]、Bacillus[12].

對(duì)六價(jià)鉻具有抗逆性并且能將六價(jià)鉻還原為三價(jià)鉻的微生物能夠被用來(lái)修復(fù)鉻污染土壤

[6].相比于傳統(tǒng)方法,微生物修復(fù)具有環(huán)境友好、可原地處理、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì),為鉻污染土壤的治理開辟了一個(gè)極具潛力的新領(lǐng)域.目前,采用鉻還原菌處理鉻污染土壤已有報(bào)道,如常文越等[13]將鉻污染土壤中篩選出的鉻還原菌修復(fù)污染土壤,1個(gè)月內(nèi)土壤中六價(jià)鉻的修復(fù)效果可達(dá)到 90%以上.Achal等[14]將真菌 Gloeophyllum sepiarium用于修復(fù)六價(jià)鉻污染土壤,6個(gè)月后,六價(jià)鉻還原率達(dá)到 90%.但是目前對(duì)微生物修復(fù)鉻污染土壤的研究往往都是通過(guò)人為投加外源鉻還原菌,缺乏對(duì)土壤中土著微生物的探索,并且對(duì)主要農(nóng)田土壤中土著鉻耐性菌的組成,以及它們對(duì)六價(jià)鉻還原的作用還缺乏研究.應(yīng)用土著微生物進(jìn)行鉻污染土壤的修復(fù)在環(huán)境安全性、環(huán)境適應(yīng)性、種群協(xié)調(diào)性以及應(yīng)用成本方面具有其他外源菌種不可比擬的優(yōu)越性.因此,探究典型農(nóng)田土壤中土著鉻耐性菌的組成以及它們對(duì)土壤中六價(jià)鉻的還原作用,可為鉻污染土壤的原位微生物修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)和菌種資源.本研究選擇7種全國(guó)性的典型土壤(黃壤、紅壤、石灰性紫色土、青紫泥、黑土、磚紅壤和潮土),研究微生物群落對(duì)鉻脅迫的響應(yīng)以及土著鉻耐性菌在六價(jià)鉻還原過(guò)程中的作用,并通過(guò) PCR-DGGE-克隆測(cè)序鑒定土壤中鉻耐性菌的種類.

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

本試驗(yàn)選用7種典型土壤類型:紅壤(黏化濕潤(rùn)富鐵土,中國(guó)系統(tǒng)分類)、磚紅壤(簡(jiǎn)育濕潤(rùn)鐵鋁土,中國(guó)系統(tǒng)分類)、黃壤(鋁質(zhì)常濕淋溶土,中國(guó)系統(tǒng)分類)、石灰性紫色土(石灰紫色正常新成土,中國(guó)系統(tǒng)分類)、青紫泥(潛育水耕人為土,中國(guó)系統(tǒng)分類)、黑土(黏化濕潤(rùn)均腐土,中國(guó)系統(tǒng)分類)和潮土(底銹干潤(rùn)雛形土,中國(guó)系統(tǒng)分類),分別采集(0～20cm)于廣西桂林、廣東湛江、浙江湖州、四川雅安、浙江嘉興、黑龍江哈爾濱和山東曲阜.土壤理化性質(zhì)和污染物背景值見表1.

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)和污染物背景濃度(干重計(jì))Table 1 Selected physicochemical properties of the soil (dry weight basis)

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

每種土壤類型設(shè)2個(gè)處理:滅菌和非滅菌.滅菌處理采用劑量10kGy的60Co γ射線對(duì)土壤進(jìn)行輻照來(lái)達(dá)到滅菌目的[15].稱取相當(dāng)于 100g 干土重的新鮮土樣于塑料盆,以 K2Cr2O7水溶液的形式在土壤中加入六價(jià)鉻,并充分?jǐn)嚢枋广t均勻地分布在土壤中,六價(jià)鉻的目標(biāo)濃度為100mg/kg,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù).所有裝載土壤的塑料盆均已滅菌,并用滅菌錫箔紙覆蓋,于人工氣候箱25oC黑暗培養(yǎng),培養(yǎng)期間每天通過(guò)添加無(wú)菌水使土壤含水量保持在田間持水量的 60%.六價(jià)鉻添加后1,3,7,14,21,28d取樣測(cè)定土壤中殘留六價(jià)鉻含量.同時(shí)取第 28d非滅菌處理土樣采用PCR-DGGE方法測(cè)定土壤中微生物群落結(jié)構(gòu).所有取樣操作均在厭氧手套箱中進(jìn)行(Coy Scientific Products)[16].

1.3 鉻耐性菌計(jì)數(shù)

六價(jià)鉻加入28d后,取非滅菌處理的土樣測(cè)定土壤中鉻耐性菌的數(shù)量和豐度,具體方法如下:稱取相當(dāng)于1g烘干土重的新鮮土樣,迅速倒入盛有10ml 0.9% NaCl溶液的試管中,渦旋1min.將制好的土壤溶液進(jìn)行 10倍梯度稀釋,然后選擇10-3到10-74個(gè)稀釋梯度,取100μL土壤溶液均勻涂布于添加5mmol/L K2Cr2O7的NA固體培養(yǎng)基中,同時(shí)取 100μL土壤溶液均勻涂布于未添加K2Cr2O7的NA固體培養(yǎng)基中.每個(gè)稀釋梯度設(shè)3個(gè)平行,30℃培養(yǎng) 4d后,統(tǒng)計(jì)平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù),選取菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度計(jì)數(shù),取3個(gè)平行的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)來(lái)表示菌的數(shù)目

[17].鉻耐性菌的豐度用添加 5mmol/L K2Cr2O7的NA固體培養(yǎng)基中的菌落數(shù)與未添加K2Cr2O7的NA固體培養(yǎng)基中菌落數(shù)的比值表示.

1.4 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

使用美國(guó)MoBio公司的土壤DNA試劑盒(Ultra High Purity DNA Isolation Kit for Soil)提取土壤總DNA.土壤16S rRNA的V3區(qū)段采用通用引物357F-GC和518R進(jìn)行PCR擴(kuò)增[18-19]. 357F-GC和 518R序列分別為:357F-GC (5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 518R(5’-ATTACCGCGGCT GCTGG-3’). PCR擴(kuò)增采用50μL反應(yīng)體系:10×PCR反應(yīng)緩沖液 5μL;MgCl2(20mmol/L) 5μL;357F-GC (10μmol/L) 1μL;518R (10μmol/L) 1μL;dNTPs (2.5mmol/L) 4μL;Taq酶 (5U, Takara) 0.5μL; DNA模板 1μL;滅菌超純水 32.5μL.反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,割膠,并用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化.

取大約400ng純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(DCodeTM,Bio-rad),變性梯度為20%～50% (100%變性梯度包括7mol L?1尿素和40%甲酰胺).在電壓200V和60oC條件下,電泳5h.電泳完畢后將凝膠進(jìn)行SYBR GREEN I染色,并利用 ChemiDoc? XRS+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)進(jìn)行凝膠成像.之后采用 Quantity One分析軟件對(duì)DGGE凝膠圖像進(jìn)行數(shù)字化分析.根據(jù)DGGE圖譜中各泳道的條帶位置、亮度以及數(shù)目,采用鄰接法做聚類分析.利用Shannon指數(shù)表示微生物群落多樣性.

在紫外燈下挑取DGGE圖譜中的目標(biāo)條帶,割膠后,用TaKaRa DNA purification kit膠回收試劑盒(寶生物,大連)回收條帶中DNA,并將其作為模板,采用引物對(duì) 357F和 518R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后,使用試劑盒pEASY-T1cloning Kit進(jìn)行克隆.將經(jīng)檢測(cè)含有目的插入片斷的克隆送交華大基因科技股份有限公司,用ABI PRISM 3100Genetic Analyzer進(jìn)行測(cè)序.

1.5 數(shù)據(jù)分析

六價(jià)鉻在土壤中的還原動(dòng)態(tài)趨勢(shì)采用指數(shù)模型擬合:

式中:C是t時(shí)的鉻(VI)濃度;C0是鉻(VI)初始濃度; k是速率常數(shù).土壤中鉻耐性菌的數(shù)量與鉻(VI)還原速率(k)之間的相關(guān)關(guān)系通過(guò)Pearson相關(guān)分析(P＜0.05)探討.試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行處理和分析.

2 結(jié)果

2.1 滅菌和非滅菌土壤中六價(jià)鉻還原動(dòng)態(tài)

如圖1所示,在培養(yǎng)1～7d的時(shí)間內(nèi)土壤中六價(jià)鉻還原速率最快,隨后還原速率減慢.培養(yǎng) 7d,非滅菌土壤中六價(jià)鉻的還原率分別為82.51%(紅壤)、49.14%(青紫泥)、41.41%(石灰性紫色土)、27.93%(黑土)、21.11%(磚紅壤)、17.38%(黃壤)、12.37%(潮土);滅菌土壤中六價(jià)鉻還原率分別為76.89%(紅壤)、36.37%(青紫泥)、30.58%(石灰性紫色土)、20.27%(黑土)、14.58%(磚紅壤)、13.86%(黃壤)、8.58%(潮土)(表2).

六價(jià)鉻在土壤中還原動(dòng)態(tài)趨勢(shì)通過(guò)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合:

式中:[Cr(VI)]是時(shí)間 t時(shí)的 Cr(VI)濃度,[Cr(VI)]0是Cr(VI)初始濃度,k是速率常數(shù).

一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)如表3所示,六價(jià)鉻在土壤中的還原動(dòng)態(tài)趨勢(shì)能用此一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型很好的擬合,相關(guān)系數(shù)高達(dá) 0.80～0.98(P＜0.01).六價(jià)鉻還原速率依次為紅壤＞青紫泥＞石灰性紫色土＞黑土＞磚紅壤＞黃壤＞潮土. 非滅菌土壤六價(jià)鉻還原速率是滅菌土壤的1.17～2.75倍.微生物在六價(jià)鉻還原過(guò)程中的貢獻(xiàn)率通過(guò)滅菌和非滅菌處理的六價(jià)鉻還原速率之差與非滅菌處理的六價(jià)鉻還原速率的比值計(jì)算,分別為 14.4%(黃壤)、44.0%(紅壤)、20.6%(石灰性紫色土)、34.9%(青紫泥)、21.9%(黑土)、21.7%(磚紅壤)和22.0%(潮土).

圖1 土壤中鉻(VI)的還原動(dòng)態(tài)趨勢(shì)Fig.1 Dynamic changes of Cr(VI)

表2 不同時(shí)間段六價(jià)鉻的還原率(%)Table 2 Cr (VI) reduction at different time periods (%)

表3 鉻(VI)還原一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果Table 3 Fitted regressions of dynamic changes of Cr(VI)

2.2 微生物群落對(duì)鉻處理的響應(yīng)

采用PCR-DGGE方法分析不同土壤中微生物群落對(duì)鉻處理的響應(yīng),土壤微生物群落 DGGE圖譜如圖2所示.亮度高的條帶所代表的微生物為逆境環(huán)境選擇出來(lái)的最具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的種群.通過(guò)與對(duì)照土壤DGGE圖譜相比,六價(jià)鉻的加入改變了微生物群落結(jié)構(gòu),出現(xiàn)了一批在六價(jià)鉻污染土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群,即為鉻耐性菌.

六價(jià)鉻加入28d后,土壤中鉻耐性菌的數(shù)量如表4所示,分別為2.5×105個(gè)(黃壤),8.5×106個(gè)(紅壤),3.0×106個(gè)(石灰性紫色土),3.9×106個(gè)(青紫泥),2.2×106個(gè)(黑土),9.0×104個(gè)(磚紅壤)和1.5×104個(gè)(潮土).通過(guò) Pearson相關(guān)分析,土壤中鉻耐性菌的數(shù)量與六價(jià)鉻還原速率之間的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.896,達(dá)到了P＜0.01顯著水平,說(shuō)明鉻耐性菌在六價(jià)鉻還原過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用.并且在六價(jià)鉻加入28d后,鉻耐性菌已經(jīng)成為土壤中優(yōu)勢(shì)菌群,豐度高達(dá)65.3%～92.8%.

根據(jù)16S rRNA的序列,基于鄰接法,建立土壤微生物群落系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖3所示.根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果,青紫泥中鉻耐性菌主要為異常球菌Deinococcus sp.和節(jié)桿菌Arthrobacter sp.;石灰性紫色土中鉻耐性菌主要為馬賽菌 Massilia sp.和芽孢桿菌Bacillus sp.;黑土中鉻耐性菌主要為芽孢桿菌Bacillus sp.和異常球菌Deinococcus sp.;潮土中鉻耐性菌主要為小單胞菌Micromonospora sp.、甲基桿菌Methylobacterium sp.和節(jié)桿菌Arthrobacter sp.;紅壤中鉻耐性菌主要為酸桿菌 Acidobacterium sp.、芽孢桿菌Bacillus sp.、埃希氏菌Escherichia sp.和叢毛單胞菌 Comamonas sp.;磚紅壤中鉻耐性菌主要為慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.;黃壤中鉻耐性菌主要為酸桿菌 Acidobacterium sp.、埃希氏菌Escherichia sp.、叢毛單胞菌Comamonas sp.和慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp..

表4 鉻(VI)處理土壤鉻耐性菌數(shù)量及豐度Table 4 The number of Cr resistant bacteria at day 28

圖2 土壤微生物群落DGGE圖譜Fig.2 DGGE profiles of the soil bacterial 16S rRNA fragments圖中CK代表對(duì)照土壤、100代表添加100mg kg?1Cr(VI)土壤

圖3 土壤微生物群落系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic analysis showing the relationships of clones

土壤微生物優(yōu)勢(shì)菌群可以分為8大類:α-變形菌(慢生根瘤菌 Bradyrhizobium和甲基桿菌Methylobacterium);β-變形菌(纖發(fā)菌Leptothrix、沙壤土桿菌Ramlibacter、馬賽菌Massilia、嗜甲基 菌 Methylophilus 和 叢 毛 單 胞 菌Comamonas);γ-變形菌(埃希氏菌Escherichia、溶桿菌Lysobacter、甲基球菌Methylobacter和熱單胞 菌 Thermomonas);放 線 菌 (小 單 胞 菌Micromonospora和節(jié)桿菌 Arthrobacter);厚壁菌(芽胞桿菌Bacillus和微小桿菌Exiguobacterium);酸桿菌Acidobacterium;芽單胞菌Gemmatimonas;異常球菌Deinococcus.

使用STLINK 作為仿真器，當(dāng)LDC1000 檢測(cè)到存在金屬或硬幣時(shí)，它會(huì)比較檢測(cè)到的數(shù)據(jù)。然后，在軟件中設(shè)置改變閾值以區(qū)分和識(shí)別導(dǎo)線和硬幣的閾值，并且設(shè)置硬幣閾值是700。

Shannon指數(shù)用來(lái)表征土壤微生物群落多樣性[16],結(jié)果如表5所示.黃壤、石灰性紫色土、青紫泥、黑土、磚紅壤和潮土中Shannon指數(shù)在鉻處理?xiàng)l件下比對(duì)照高,而紅壤的Shannon指數(shù)在鉻處理?xiàng)l件下比對(duì)照低.結(jié)合表4鉻耐性菌百分率的數(shù)據(jù)推斷,微生物群落多樣性并沒(méi)有因?yàn)榱鶅r(jià)鉻加入而減少,而是在重金屬鉻脅迫作用下,鉻耐性菌成為土壤中優(yōu)勢(shì)菌群.

2.3 微生物還原鉻(VI)貢獻(xiàn)率與土壤性質(zhì)關(guān)系

微生物在六價(jià)鉻還原過(guò)程中貢獻(xiàn)率與土壤性質(zhì)之間的相關(guān)關(guān)系通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)表示,如表 6所示.相關(guān)系數(shù)表明微生物對(duì)鉻(VI)還原的貢獻(xiàn)率與亞鐵含量存在極顯著正相關(guān)(P ＜0.01),與黏粒含量存在顯著正相關(guān)(P ＜ 0.05),而與砂粒含量存在顯著負(fù)相關(guān)(P ＜ 0.05).其他土壤理化參數(shù)如土壤pH值、有機(jī)質(zhì)、陽(yáng)離子交換量和易還原態(tài)錳含量與微生物在鉻(VI)還原中貢獻(xiàn)率無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系.

在添加六價(jià)鉻后,黃壤、紅壤、石灰性紫色土、青紫泥、黑土、磚紅壤和潮土中六價(jià)鉻與三價(jià)鉻的含量比例分別為3.31、1.46、1.72、1.76、1.53、1.58和2.79.通過(guò)Pearson相關(guān)分析,土壤中六價(jià)鉻與三價(jià)鉻的含量比例與微生物在六價(jià)鉻還原過(guò)程中貢獻(xiàn)率之間的相關(guān)系數(shù)僅為-0.564,P＞0.05(表 6).因此六價(jià)鉻與三價(jià)鉻的含量比例對(duì)微生物在六價(jià)鉻還原中貢獻(xiàn)率無(wú)顯著影響.

表5 微生物群落多樣性Shannon指數(shù)Table 5 Shannon index of the bacterial community diversity in the tested soils

表6 土壤各性質(zhì)與微生物在鉻(VI)還原中貢獻(xiàn)率之間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 6 Coefficients of linear correlation between soil properties and contribution of microorganisms to Cr(VI) reduction

3 討論

3.1 土壤微生物群落對(duì)鉻處理的響應(yīng)

本研究證明了重金屬鉻的添加是影響土壤微生物群落組成的一個(gè)重要因素,此外,土壤類型也一定程度影響了微生物群落的組成.在本研究中,外源添加鉻比土壤性質(zhì)對(duì)微生物群落的影響更大.在鉻處理土壤中,鉻耐性菌的豐度高達(dá)65.3%～92.8%(表 4).因而推斷鉻處理對(duì)微生物群落的影響主要表現(xiàn)在鉻的脅迫作用下,出現(xiàn)了一批對(duì)鉻有高抗性的耐性菌,并且成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群,此結(jié)論與孟慶恒等[20]關(guān)于微生物群落對(duì)鉻處理響應(yīng)的報(bào)道一致.

黃壤、石灰性紫色土、青紫泥、黑土、磚紅壤和潮土的微生物群落多樣性 Shannon指數(shù)在鉻處理?xiàng)l件下比對(duì)照高,僅紅壤的Shannon指數(shù)在鉻處理下比對(duì)照低(表 5).Xiao等[18]指出,在特定的情況下,適當(dāng)?shù)拿{迫能通過(guò)抑制土壤中原有優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng)而提高土壤中微生物的多樣性.Nakatsu等[17]也發(fā)現(xiàn)鉻脅迫改變了土壤中原有微生物群落組成,提高了微生物種群多樣性.

3.2 鉻耐性菌促進(jìn)土壤中鉻(VI)的還原

自從19世紀(jì)70年代第一個(gè)鉻還原微生物的發(fā)現(xiàn)[21],目前對(duì)鉻還原菌的研究越來(lái)越多,大量的菌種被報(bào)道[5,9-11,22].本研究中,芽孢桿菌Bacillus sp.、埃希氏菌Escherichia sp.、異常球菌 Deinococcus sp.、小單胞菌 Micromonospora sp.、甲基桿菌 Methylobacterium sp.、馬賽菌Massilia sp.、酸桿菌Acidobacterium sp.、叢毛單胞 菌 Comamonas sp.、 慢 生 根 瘤 菌Bradyrhizobium sp.和節(jié)桿菌Arthrobacter sp. 被鑒定為六價(jià)鉻耐性菌 (圖2和圖3).

其中部分鉻耐性菌已被報(bào)道具有還原六價(jià)鉻能力,如芽孢桿菌 Bacillus sp.[12,22]、埃希氏菌Escherichia sp.[11,23]、異常球菌 Deinococcus sp.[24]、叢毛單胞菌 Comamonas sp.[25]和節(jié)桿菌Arthrobacter sp.[5,26].關(guān)于這些鉻還原菌還原六價(jià)鉻的機(jī)理已有一定的研究,Das等[22]指出Bacillus sp.具有分泌鉻還原酶的能力,并且能將該酶排出體外還原土壤中六價(jià)鉻,修復(fù)鉻污染土壤.Ackerley等[23]報(bào)道Escherichia coli 能分泌一種氧不敏感的硝基還原酶NfsA,此種黃素蛋白能將六價(jià)鉻還原為三價(jià)鉻.Lin[11]研究得出, Escherichia coli ATCC 33456 能通過(guò)共代謝作用 還 原 六 價(jià) 鉻 .Fredrickson 等[24]指 出 , Deinococcus radiodurans 能參與六價(jià)鉻、氧化鐵與乳酸以及其他有機(jī)物之間的氧化還原反應(yīng),在氧化乳酸的同時(shí)還原六價(jià)鉻和氧化鐵.Bestawy等[25]報(bào)道 Comamonas sp.體內(nèi)的鉻還原酶能通過(guò)硫酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑還原六價(jià)鉻.Megharaj等[26]報(bào)道,Arthrobacter sp.所具有的六價(jià)鉻還原能力主要與細(xì)胞體內(nèi)的可溶蛋白組分有關(guān).

微生物還原六價(jià)鉻的機(jī)制除了鉻還原菌直接參與的酶促還原[6,19],還有鐵還原菌參與的間接還原[15,27]:鐵還原菌將三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵,然后二價(jià)鐵將六價(jià)鉻還原為三價(jià)鉻,自身氧化為三價(jià)鐵,如此循環(huán),土壤中六價(jià)鉻不斷得到還原. Wang等[28]研究證明,慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.具有還原鐵離子的能力,是檸檬酸鐵培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌,而 Bradyrhizobium也是本研究鑒定到的鉻耐性菌之一.因此,推斷Bradyrhizobium促進(jìn)六價(jià)鉻還原的機(jī)制可能是與其參與 Cr(VI)與Fe(II)之間的氧化還原反應(yīng)有關(guān).并且通過(guò)表6的相關(guān)分析結(jié)果,Fe(II)含量與微生物對(duì)六價(jià)鉻還原的貢獻(xiàn)率呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01),也從側(cè)面證明了這個(gè)推斷.

盡管目前還沒(méi)有報(bào)道指出, Micromonospora、Methylobacterium、Massilia和 Acidobacterium在六價(jià)鉻還原過(guò)程中的作用,通過(guò)本研究 PCR-DGGE-克隆測(cè)序分析結(jié)果,推斷這些微生物種群在六價(jià)鉻還原過(guò)程中也發(fā)揮了一定的作用.下一步的研究需要對(duì)這些微生物進(jìn)行分離篩選,深入探討其在六價(jià)鉻還原過(guò)程中的作用.

3.3 土壤性質(zhì)對(duì)微生物還原鉻(VI)的影響

土壤理化性質(zhì)會(huì)影響土壤微生物群落組成

[29],因而推斷,土壤性質(zhì)同樣也會(huì)影響土壤中鉻耐性菌的組成,進(jìn)而影響六價(jià)鉻的還原,但是土壤性質(zhì)如何影響微生物還原六價(jià)鉻尚不清楚.因此,本研究通過(guò)相關(guān)分析研究土壤理化性質(zhì)與微生物還原六價(jià)鉻貢獻(xiàn)率之間的相關(guān)關(guān)系.微生物對(duì)六價(jià)鉻還原的貢獻(xiàn)率與亞鐵含量存在(P ＜0.01)極顯著正相關(guān)(表 6),表明土壤微生物促進(jìn)了Cr(VI)與Fe(II)之間的氧化還原反應(yīng).Tokunaga等[30]指出鐵還原菌參與的 Cr(VI)-Fe(II)之間的氧化還原反應(yīng)是六價(jià)鉻還原的重要途徑之一.Ding等[15]也報(bào)道了微生物通過(guò)還原鐵的水和氧化物來(lái)促進(jìn)土壤中六價(jià)鉻的還原.

此外,相關(guān)系數(shù)也表明微生物對(duì)六價(jià)鉻還原的貢獻(xiàn)率與土壤黏粒含量存在顯著正相關(guān)(P ＜0.05),而與砂粒含量存在顯著負(fù)相關(guān)(P ＜0.05)(表 6).土壤中的微小顆粒,特別是黏土顆粒,能為微生物活動(dòng)提供較大的比表面積[31-32].黏土顆粒表面的功能基團(tuán)能豐富土壤微生物多樣性,進(jìn)而促進(jìn)六價(jià)鉻的還原.根據(jù)以上討論,我們推斷不同土壤中微生物對(duì)六價(jià)鉻還原的貢獻(xiàn)率差異主要?dú)w因于鉻耐性菌組成和土壤性質(zhì)(亞鐵和顆粒組成)的差異.

4 結(jié)論

4.1 六價(jià)鉻處理對(duì)微生物群落的影響主要表現(xiàn)為在六價(jià)鉻的選擇作用下,鉻耐性菌成為土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群.紅壤、磚紅壤、黃壤、石灰性紫色土、青紫泥、黑土和潮土中鉻耐性菌主要為芽孢桿菌Bacillus sp.、埃希氏菌Escherichia sp.、異常 球 菌 Deinococcus sp.、 小 單 胞 菌Micromonospora sp.、甲基桿菌Methylobacterium sp.、馬賽菌Massilia sp.、酸桿菌Acidobacterium sp.、叢毛單胞菌 Comamonas sp.、慢生根瘤菌Bradyrhizobium sp.和節(jié)桿菌Arthrobacter sp.,它們能顯著促進(jìn)土壤中六價(jià)鉻的還原.

4.2 土壤性質(zhì),特別是亞鐵和土壤顆粒組成,影響了微生物對(duì)六價(jià)鉻還原的貢獻(xiàn)率.鉻耐性菌促進(jìn)六價(jià)鉻還原的機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討研究.

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致謝：感謝浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地和浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項(xiàng)目對(duì)本研究的支持. bacteria [J]. Applied Water Science, 2013,3(1):181-192.

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The effect of chromium-resistant bacteria on reduction of hexavalent chromium in soils.

XIAO Wen-dan, YE Xue-zhu*, SUN Cai-xia, ZHANG Qi, XU Ping (Institute of Quality and Standard for Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China). China Environmental Science, 2017,37(3)：1120～1129

In this study, seven representative agricultural soils with different physicochemical properties were used to investigate the response of soil microbial community to Cr contamination and the effect of indigenous chromium-resistant bacteria on reduction of hexavalent chromium in soils. Our results demonstrated that soil bacterial community was responded to Cr contamination through changes in bacterial community structure, with Cr-resistant bacteria became dominant species, and the percentage of Cr-resistant bacteria of total cultivable bacteria was 89.9%, 75.2%, 92.8%, 65.3%, 72.8%, 77.3%, and 65.4%, respectively for Periudic Argosols, Udic Ferrisols, Calcaric Regosols, Stagnic Anthrosols, Mollisols, Typic Haplustalfs, and Ustic Cambosols. Microbial reduction was an important Cr(VI) reduction pathway, and the relative contribution of microorganisms to Cr(VI) reduction was 14.4%, 44.0%, 20.6%, 34.9%, 21.9%, 21.7%, and 22.0%, respectively. Soil properties, Fe(II) and soil particle distribution, affected the microbially mediated Cr(VI) reduction. Moreover, Bacillus, Escherichia, Deinococcus, Micromonospora, Methylobacterium, Massilia, Acidobacterium, Comamonas, Bradyrhizobium, and Arthrobacter were identified as the Cr-resistant bacteria.

hexavalent chromium；chromium resistant bacteria；dominant bacteria；cloning-sequencing；correlation analysis

X172

A

1000-6923(2017)03-1120-10

肖文丹(1987-),女,湖南永州人,助理研究員,博士,主要從事土壤重金屬污染生物修復(fù)研究.發(fā)表論文10余篇.

2016-07-18

浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助

* 責(zé)任作者, 副研究員, xuezhuye@aliyun.com