李 鵬,畢學(xué)軍,王 軍,汝少國(guó)*(1.山東省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究設(shè)計(jì)院,山東 濟(jì)南 5001；.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島 6600；.青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,山東 青島 660)

常規(guī)和倒置A2/O工藝活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)的比較

李 鵬1,2,畢學(xué)軍3,王 軍2,汝少國(guó)2*(1.山東省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究設(shè)計(jì)院,山東 濟(jì)南 250013；2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003；3.青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,山東 青島 266033)

為了探究倒置A2/O工藝脫氮除磷效果優(yōu)于常規(guī)A2/O工藝的機(jī)理,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變形梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)與純培養(yǎng)方法分析了2種工藝活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu).結(jié)果顯示,2種工藝活性污泥的優(yōu)勢(shì)菌群均含有β-變形菌與γ-變形菌;倒置A2/O工藝活性污泥中檢測(cè)到大量的亞硝化螺旋菌、紅環(huán)菌和4種未培養(yǎng)的擬桿菌,而這些菌類在常規(guī)A2/O工藝中含量較少;利用純培養(yǎng)方法在倒置A2/O工藝活性污泥檢測(cè)到的γ-變形菌綱希瓦氏菌屬、克雷伯氏菌屬和類球紅細(xì)菌在常規(guī)A2/O工藝樣品中未檢測(cè)到.推測(cè)以上菌種的存在可能是倒置A2/O工藝具有較高脫氮除磷效果的主要原因.此外,掃描電鏡結(jié)果顯示倒置A2/O工藝活性污泥較為疏松,絲狀細(xì)菌含量較少,且不存在念珠狀細(xì)菌.

活性污泥；微生物群落結(jié)構(gòu)；PCR-DGGE；倒置A2/O

目前,我國(guó) 80%以上的城市污水處理廠采用活性污泥法降解有機(jī)污染物,降解效率主要取決于活性污泥中微生物的結(jié)構(gòu)與功能[1–2].傳統(tǒng)污水處理廠多采用 A2/O(厭氧-缺氧-好氧)工藝,該工藝兼顧脫氮和除磷雙重功能,由于2種功能對(duì)動(dòng)力條件的要求不一致,導(dǎo)致除磷效果不盡理想

[3].為進(jìn)一步強(qiáng)化除磷效果,研究者設(shè)計(jì)了倒置A2/O(缺氧-厭氧-好氧)工藝,以期解決常規(guī) A2/O工藝存在的問題[4].研究表明,倒置 A2/O工藝對(duì)有機(jī)污染物、氨氮與磷酸鹽的去除效率明顯優(yōu)于常規(guī)A2/O工藝[5],但是2種工藝的微生物結(jié)構(gòu)和功能存在哪些差異,從而導(dǎo)致脫氮、除磷效果不一致尚不清楚.因此,本研究從常規(guī) A2/O與倒置A2/O工藝的好氧區(qū)末端采集活性污泥樣品,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCRDGGE)技術(shù)鑒定了 2種工藝活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu),同時(shí)采用顯微鏡觀察和分離培養(yǎng)技術(shù)得到單一菌株,并對(duì)可培養(yǎng)菌株進(jìn)行鑒定,以探究倒置A2/O工藝脫氮除磷效果優(yōu)于常規(guī)A2/O工藝的機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 材料

將青島市團(tuán)島污水處理廠(以處理城市生活污水為主)曝氣沉砂池出水引入 A2/O與倒置A2/O工藝的小試試驗(yàn)裝置(圖1).2種工藝的有效容積均為 289L,進(jìn)水量 400mL/min,水力停留時(shí)間為12h,溶解氧為2.0～3.0mg/L,泥齡為16d.每天下午采集進(jìn)水與出水水樣,參照《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918-2002)測(cè)定水樣中的氮、磷含量.運(yùn)行30d后,于好氧池末端采集活性污泥樣品,取樣時(shí)間為下午第2次排泥之前.

圖1 常規(guī)A2/O和倒置A2/O工藝試驗(yàn)裝置Fig.1 Lab-scale testing units of conventional A2/O and reversed A2/O processes

1.2 16S rDNA V3區(qū)的PCR-DGGE分析

1.2.1 DNA的提取與純化 活性污泥中微生物基因組DNA提取采用SDS細(xì)胞裂解法[6].首先,向活性污泥中加入270μL含有50μg蛋白酶K的DNA提取液,于37℃、225r/min震蕩30min;隨后,加入30μL 20%的SDS,65℃水浴2h,每隔20min輕輕搖動(dòng)1次;6000r/min離心10min,取上清液;向沉淀中加入 90μL DNA提取液,20μL 10% SDS,65℃水浴10min,6000r/min離心10min.將2次獲得的上清合并后,利用 DNA膠回收試劑盒對(duì)粗提液DNA進(jìn)行純化.

1.2.2 16S rDNA的擴(kuò)增 參照 Bosshard等[7]的方法,以純化的總 DNA為模板,利用細(xì)菌 16S rDNA的通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’),采用 PCR方法擴(kuò)增出微生物的16S rDNA.PCR反應(yīng)條件參照楊倩等[8]報(bào)道的方法,擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.2.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE) 采用Dcode通用突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離,聚丙烯酰胺凝膠濃度為 8%,變性膠梯度從 30%到60% (100%變性劑含7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺).PCR樣品上樣量為20μL,60℃、150V電泳4h,經(jīng)SYBR-Green I染色后,利用DOC1000凝膠成像系統(tǒng)拍照.

1.2.4 DGGE條帶的切割和 DNA回收 從DGGE膠上切下目標(biāo)條帶,經(jīng)無菌雙蒸水浸洗 3次后,破碎凝膠,加入30μL TE緩沖液(pH 7.6),于50℃水浴中融化,6000r/min離心5min,取上清.以回收的DNA為模板,利用大多數(shù)細(xì)菌16S rDNA基因V3區(qū)具有的特異性引物341f和518r進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

1.2.5 16S rDNA基因V3區(qū)的克隆、測(cè)序與分析 PCR產(chǎn)物切膠后,利用DNA膠回收試劑盒對(duì)16S rDNA進(jìn)行回收純化.將純化的PCR產(chǎn)物與pGM-T載體連接后,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞,涂布于加入IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基.隨機(jī)挑選白色菌落,置于5mL LB液體培養(yǎng)基(含100μL相應(yīng)抗生素)中,37℃培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒,將含有目的基因的菌株送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序.利用BLAST軟件分析16S rDNA基因序列與GenBank中收錄的16S rDNA序列的同源性,用Mega5.0軟件對(duì)擴(kuò)增的細(xì)菌進(jìn)行聚類,采用鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,并通過自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測(cè),自舉數(shù)據(jù)集為1000次[9].

1.3 微生物的形態(tài)觀察

將活性污泥菌膠團(tuán)懸液涂布于干凈的載玻片上,自然干燥后在光學(xué)顯微鏡下鏡檢,選出菌體較密且分散度較好的樣品.將樣品置于 2%戊二醛磷酸緩沖液(pH 7.2)中,4℃固定過夜;次日,用40%、70%、90%和 100%的乙醇依次脫水,并用醋酸戊脂置換乙醇;將上述制備好的樣品置于臨界點(diǎn)干燥器中,浸泡于液態(tài)二氧化碳中,加熱至臨界點(diǎn)溫度(31.4℃,7.28MPa)以上,使之氣化干燥;在真空鍍膜機(jī)內(nèi)把金噴鍍到樣品表面后,利用掃描電鏡觀察.

1.4 活性污泥微生物的純化與鑒定

1.4.1 微生物的純化 將10mL活性污泥放入含有3g玻璃珠(直徑0.11～0.12mm)的50mL離心管中,旋渦混合器擊打15min去絮凝.自然沉降1h,收集上清液,用滅菌蒸餾水將上清液稀釋102～ 107倍后,吸取0.1mL均勻涂布于普通肉湯固體培養(yǎng)基,倒置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至形成單菌落.挑取單菌落進(jìn)行劃線分離純化,將分離純化的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)至菌落形成.

1.4.2 微生物的鑒定 16S rDNA基因序列測(cè)定和分析:利用酚氯仿抽提法提取菌株的基因組DNA,利用1.3的方法擴(kuò)增16S rDNA基因.利用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,為了剔除可能相同的菌株,選用內(nèi)切酶Rsa I和Hha I對(duì)所有菌株的PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切,并利用2%瓊脂糖凝膠對(duì)酶切結(jié)果進(jìn)行檢測(cè).將酶切帶譜差異較大菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后,送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序.所得的16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank中已知的序列進(jìn)行同源性比較,確定種屬.

細(xì)菌的BIOLOG鑒定:選取酶切帶譜差異較大的菌株在 BIOLOG專用培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接2～3次,劃線接種到培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h.用無菌棉簽蘸生理鹽水濕潤(rùn)后輕輕擦下培養(yǎng)基上的菌落,轉(zhuǎn)入無菌稀釋緩沖液中,混勻得到菌懸液,測(cè)定其濁度,控制在濁度標(biāo)準(zhǔn)的±3%以內(nèi).將 150 μL菌懸液加入到鑒定板的各孔中,蓋上鑒定板蓋,置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi),4～6h時(shí)讀1次,之后16～24h再讀1次.

2 結(jié)果與討論

2.1 2種工藝氮磷去除效率的比較

NH3-N含量測(cè)定結(jié)果顯示,運(yùn)行前期2種工藝的氨氮去除率都不高,16d后倒置A2/O工藝的氨氮去除率(50%)要明顯高于常規(guī) A2/O工藝(13%)(圖 2A).PO4-P含量測(cè)定結(jié)果顯示,常規(guī)A2/O工藝對(duì)磷的去除效率波動(dòng)較大,在處理前期磷的去除率僅為50%,2周后能達(dá)到80%以上,倒置A2/O工藝對(duì)磷的去除率則一直維持在90%以上,表現(xiàn)更加穩(wěn)定(圖2B).

圖2 常規(guī)A2/O工藝與倒置A2/O工藝對(duì)NH3-N與PO4-P的去除率Fig.2 Removal efficiency of NH3-N and PO4-P of conventional A2/O and reversed A2/O processes

2.2 細(xì)菌 16S rDNA V3區(qū)的純化與特征片段DGGE指紋圖譜

從常規(guī)和倒置A2/Oc23kb的DNA片段,這與Bourrain等[11]從活性污泥中提取的DNA大小相同,表明獲得了完整的基因組 DNA.隨后利用膠回收試劑盒成功純化了基因組 DNA,以純化的DNA為模板,對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,2個(gè)樣品均得到了約為200bp的單一條帶,條帶的亮度和純度較好,且無明顯非特異性擴(kuò)增.PCR-DGGE技術(shù)是目前分析活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)常用的方法[11–12],本研究利用該技術(shù)比較了常規(guī)和倒置A2/O工藝活性污泥中的微生物組成,發(fā)現(xiàn)條帶1、2、3、4、6、9、10、11、12、13、14、16、18、19在2種樣品的DGGE圖像中均存在,且比較亮,含量較高,而條帶5、7、8、15、17、20在常規(guī)工藝活性污泥DGGE圖像相對(duì)較暗,含量較低,但是在倒置 A2/O工藝樣品中亮度較大,含量較高(圖3).

圖3 活性污泥樣品中細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)片段的DGGE圖譜Fig.3 DGGE profiles of PCR amplified 16S rDNA V3region fragments from different samples of activated sludge

2.3 細(xì)菌16S rDNA序列同源性與聚類分析

將DGGE分離后可分辨的電泳條帶進(jìn)行回收、擴(kuò)增及測(cè)序,共獲得19條170～195bp的序列(條帶7未測(cè)出),其中有11條序列是環(huán)境中未培養(yǎng)的菌株.16S rDNA序列的相似性比較和聚類分析結(jié)果表明,這些菌株主要屬于擬桿菌屬(Bacteroides,55%)、變形菌門(Proteobacteria, 25%)、Candidate division TM7類群(10%)和厚壁菌門(Firmicutes,5%),其中擬桿菌屬和變形菌(主要是 β、γ-變形菌)為優(yōu)勢(shì)菌類,這與此前研究者對(duì)活性污泥中微生物多樣性的研究結(jié)果相一致

[13–14].Buchan[15]則發(fā)現(xiàn),生物除磷曝氣池活性污泥中的優(yōu)勢(shì)菌為不動(dòng)桿菌(Acinetobacter spp.),而本研究采用 PCR-DGGE技術(shù)未檢測(cè)到不動(dòng)桿菌.

進(jìn)一步分析DGGE圖譜可知,2工藝樣品中共有的菌類為鹽單胞菌屬(Halomonas sp.)、紅環(huán)菌屬(Rhodoferax sp.)、普氏菌屬(Prevotella sp.)、黃桿菌科(Niablella koreensis strain)、不可培養(yǎng)的擬桿菌(Bacteroidetes bacterium)、產(chǎn)丁酸菌(butyrate-producing bacterium)、屈撓桿菌屬(Flexibacteraceae sp.)、 鞘 氨 醇 桿 菌 屬(Sphingobacterium sp.)、不可培養(yǎng)的 candidate division TM7、不可培養(yǎng)的PHOS-HE28菌與γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria) (表1).相比之下,可培養(yǎng)的亞硝化螺菌(Nitrosospira sp.,條帶18)、紅環(huán)菌屬(Rhodocyclus sp.,條帶15)與4種不可培養(yǎng)的擬桿菌(條帶5、17、19、20)在常規(guī)工藝中含量較少,但在倒置工藝中含量較高.亞硝化螺菌對(duì)亞硝酸鹽具有很低的米氏常數(shù)(Km值),并且對(duì)有限氧表現(xiàn)出很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力[16],劉惠軍等[17]發(fā)現(xiàn),亞硝化螺菌是曝氣生物反應(yīng)器中起主要氨氧化作用的細(xì)菌,占細(xì)菌總數(shù)的 21%;紅環(huán)菌通常是磷含量高的生物除磷體系中的優(yōu)勢(shì)菌[18],例如 Bond等[19]發(fā)現(xiàn),紅環(huán)菌在高效除磷系統(tǒng)中含量較高,而在低效除磷系統(tǒng)中含量較少,推測(cè)紅環(huán)菌可能是造成兩系統(tǒng)除磷功能差異的主要原因.Zilles等[20]也報(bào)道,紅環(huán)菌是生物強(qiáng)化除磷系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)聚磷菌,發(fā)揮著主要除磷作用.因此,推測(cè)亞硝化螺菌與紅環(huán)菌屬可能是造成倒置 A2/O工藝具有較高脫氮除磷效果的主要原因之一.

為了分析鑒定菌種與已知菌種的親緣關(guān)系,進(jìn)一步構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(圖4),常規(guī)A2/O工藝活性污泥中獲得的18條序列中,有10條屬于擬桿菌門(Bacteroidetes),包括2條鞘脂桿菌綱的鞘脂桿菌屬(Sphingobacterium sp.)、1條擬桿菌綱普雷沃氏菌屬(Prevotella sp.)、1條黃桿菌綱黃桿菌科(Flavobacteriaceae)和1條噬纖維菌-屈撓桿菌-擬桿菌(Cytophaga—Flexibacter- Bacteroides,CFB);5條序列屬于變形菌門(Proteobacteria),包括β-變形細(xì)菌(3條)和γ-變形細(xì)菌(2條);1條序列屬于厚壁菌門梭菌目(Clostridiales).倒置 A2/O工藝活性污泥中鑒定的菌屬與常規(guī)A2/O工藝活性污泥相似,唯一多出的條帶 20屬于擬桿菌門(Bacteroidetes).

表1 DGGE回收DNA片段序列分析結(jié)果Table 1 Sequence identification of 16S rDNA DGGE fragments

續(xù)表1

圖4 DGGE條帶16S rDNA序列聚類分析Fig.4 Cluster analysis of DGGE patterns from 20samples

2.4 活性污泥中微生物的形態(tài)觀察

掃描電鏡結(jié)果顯示,常規(guī)A2/O與倒置A2/O工藝活性污泥中均含有大量的球狀菌和桿狀菌,這與SBR工藝活性污泥的研究結(jié)果相近[21].常規(guī)A2/O工藝活性污泥菌膠團(tuán)比較致密,含有大量的絲狀細(xì)菌和部分念珠狀細(xì)菌(圖 5),而倒置 A2/O工藝活性污泥則較為疏松,絲狀細(xì)菌含量較少,且未發(fā)現(xiàn)念珠狀細(xì)菌(圖6).絲狀細(xì)菌能顯著影響絮狀活性污泥的沉降性(污泥膨脹)或引起生物量變化和泡沫形成(污泥發(fā)泡),嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致活性污泥運(yùn)行的癱瘓[22].可見,與常規(guī) A2/O工藝相比,倒置A2/O工藝能夠避免污泥膨脹等異常問題,更有助于維持活性污泥的處理效率.

圖5 常規(guī)A2/O工藝曝氣池末端活性污泥掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrograph of activated sludge in A2/O procedureA:絲狀細(xì)菌; B:球狀菌; C:桿狀菌; D:念珠狀菌; 4:菌膠團(tuán)

圖6 倒置A2/O工藝曝氣池末端活性污泥掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrograph of activated sludge in reversed A2/O procedureA:絲狀細(xì)菌; B:球狀菌; C:桿狀菌; 4:菌膠團(tuán)

2.5 微生物的分離與鑒定

圖7 34株純化菌的ARDRA結(jié)果分析Fig.7 ARDRA analysis of 34bacterial isolatesC1～C19:常規(guī)工藝中分離的菌株;D1-D15:倒置工藝中分離的菌株

采用培養(yǎng)方法從活性污泥樣品中共分離得到34株菌,聚類進(jìn)化樹結(jié)果顯示它們屬于11種菌株(圖7).BIOLOG分析將其中3株鑒定到了屬,另外8株則準(zhǔn)確鑒定到了種.16S rDNA同源性比對(duì)結(jié)果顯示這些菌種可分為 5大類:α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形桿菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacillibacteria),其中優(yōu)勢(shì)菌為 β-變形菌綱、γ-變形菌綱和放線菌綱(表2),這與PCR-DGGE技術(shù)鑒定得到的優(yōu)勢(shì)菌種相類似.然而,PCR-DGGE檢測(cè)到的紅環(huán)菌在純培養(yǎng)研究中并未分離到,而 PCRDGGE技術(shù)未檢測(cè)到的不動(dòng)桿菌卻獲得了純培養(yǎng).對(duì)比2種工藝發(fā)現(xiàn),γ-變形菌綱中的希瓦氏菌屬(Shewanella algae sp.)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)和類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)只在倒置工藝中分離得到,而放線菌綱的滕黃微球菌(Micrococcus luteus)只在常規(guī)工藝中分離到.Fuhs等[23]發(fā)現(xiàn),高效除磷的活性污泥中可培養(yǎng)的細(xì)菌主要是 γ-亞綱變形菌的不動(dòng)桿菌;Suresh等[24]發(fā)現(xiàn),假單胞菌和克雷伯氏菌具有很強(qiáng)的除磷能力.此外, Liu等[25]與 Gieseke等[26]在具有較高除磷能力的活性污泥中都檢測(cè)到了倒置 A2/O工藝特有的這 3種微生物大量存在.因此,推測(cè)以上菌株的差異也可能是造成兩工藝脫氮除磷差異的原因.

表2 BIOLOG與16S rDNA同源性鑒定結(jié)果Table 2 Bacterial strains identification by BIOLOG technique and 16S rDNA gene analysis

3 結(jié)論

3.1 利用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)了常規(guī)A2/O和倒置 A2/O工藝活性污泥中的微生物群落結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)亞硝化螺旋菌、紅環(huán)菌和4種不可培養(yǎng)的擬桿菌在倒置A2/O工藝活性污泥中大量存在,但在常規(guī)工藝中含量較少.推測(cè)這些特殊菌種的存在可能是造成倒置A2/O工藝具有較高脫氮除磷效果的主要原因.

3.2 常規(guī) A2/O工藝活性污泥菌膠團(tuán)比較致密,含有大量的絲狀細(xì)菌、桿狀菌和球狀菌,同時(shí)還有部分念珠狀細(xì)菌,而倒置A2/O工藝活性污泥菌膠團(tuán)比較疏松,絲狀細(xì)菌相對(duì)較少,且不存在念珠狀細(xì)菌.γ-變形菌綱中的希瓦氏菌屬、克雷伯氏菌屬和類球紅細(xì)菌只在倒置工藝中分離到,這也可能是造成兩種工藝脫氮除磷效果差異的原因.

3.3 PCR-DGGE技術(shù)與純培養(yǎng)方法均發(fā)現(xiàn)兩種工藝活性污泥中的優(yōu)勢(shì)菌群均包括 β-變形菌與 γ-變形菌.此外,PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)到的紅環(huán)菌在純培養(yǎng)研究中未分離到,而 PCR-DGGE技術(shù)未檢測(cè)到的不動(dòng)桿菌卻獲得了純培養(yǎng),表明兩種方法相結(jié)合可以取得更加高效準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果.

[1] Liu C X, Zhang Y, Yang M, et al. Analysis of bacterial community structures in two sewage treatment plants with different sludge properties and treatment performance by nested PCR-DGGE method [J]. Journal of Environmental Sciences, 2007,19(1):60—66.

[2] 朱海霞,陳林海,張大偉,等.活性污泥微生物菌群研究方法進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2007,27(1):314—322.

[3] 王振江,武鵬崐,畢學(xué)軍.倒置A2/O生物脫氮除磷工藝的生產(chǎn)性試驗(yàn) [J]. 中國(guó)給水排水, 2006,22(19):36—38.

[4] 張 波,高遷耀.倒置A2/O工藝的原理與特點(diǎn)研究 [J]. 中國(guó)給水排水, 2000,16(7):11—15.

[5] 李亞靜,孫力平.常規(guī)A2/O工藝和倒置A2/O工藝處理城市污水比較研究 [J]. 環(huán)境工程, 2015,33:967—970.

[6] Zhou J, Bruns M A, Tiedje J M. DNA recovery from soils of diverse composition [J]. Applied and environmental microbiology, 1996,62(2):316—322.

[7] Bosshard P P, Santini Y, Grüter D, et al. Bacterial diversity and

community composition in the chemocline of the meromicticalpine Lake Cadagno as revealed by 16S rDNA analysis [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2000,31(2):173—182.

[8] 楊 倩,蔣陽月,王小軍,等.不同區(qū)域污水處理廠活性污泥中微生物菌落結(jié)構(gòu)分析 [J]. 化工進(jìn)展, 2014,33(12):3329—3336.

[9] 葛 峰,郭 坤,周廣燦,等.南京市 4個(gè)污水處理廠的活性污泥中細(xì)菌的分離鑒定和抗生素耐藥性分析 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2012,33(5):1646—1651.

[10] Bourrain M, Achouak W, Urbain V, et al. DNA extraction from activated sludges [J]. Current microbiology, 1999,38(6):315—319.

[11] Dar S A, Kuenen J G, Muyzer G. Nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis approach to determine the diversity of sulfate-reducing bacteria in complex microbial communities [J]. Applied and environmental microbiology, 2005,71(5):2325—2330.

[12] Chen Y, Ren C G, Yang B, et al. Priming effects of the endophytic fungus Phomopsis liquidambari on soil mineral N transformations [J]. Microbial ecology, 2013,65(1):161-170.

[13] 劉新春,吳成強(qiáng),張 昱,等. PCR-DGGE法用于活性污泥系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的解析 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2005,25(4): 842—847.

[14] 王海燕,周岳溪,蔣進(jìn)元.強(qiáng)化生物除磷系統(tǒng)的微生物種群及其表征技術(shù) [J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2005,32(1):118—122.

[15] Buchan L. Possible biological mechanism of phosphorus removal [J]. Water Science and Technology, 1983,15(3/4):87—103.

[16] Laanbroek H J, Gerards S. Competition for limiting amounts of oxygen between Nitrosomonas europaea and Nitrobacter winogradskyi grown in mixed continuous cultures [J]. Archives of Microbiology, 1993,159(5):453—459.

[17] 劉惠軍,楊鳳林,張捍民,等.炭膜曝氣生物膜反應(yīng)器硝化作用及其微生物群落結(jié)構(gòu)分析 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2007,28(9):2123—2128.

[18] Hesselmann R P X, Werlen C, Hahn D, et al. Enrichment, phylogenetic analysis and detection of a bacterium that performs enhanced biological phosphate removal in activated sludge [J]. Systematic and Applied Microbiology, 1999,22(3):454—465.

[19] Bond P L, Keller J, Blackall L L. Characterisation of enhanced biological phosphorus removal activated sludges with dissimilar phosphorus removal performances [J]. Water Science and Technology, 1998,37(4):567—571.

[20] Zilles J L, Hung C H, Noguera D R. Presence of Rhodocyclus in a full-scale wastewater treatment plant and their participation in enhanced biological phosphorus removal [J]. Water Science and Technology, 2002,46(1/2):123—128.

[21] Van Houten R, Evenblij H, Keijmel M. Membrane bioreactors hit the big time: ten years of research in The Netherlands [J]. H2O MBR Special, 2001:26—31.

[22] Guo F, Zhang T. Profiling bulking and foaming bacteria in activated sludge by high throughput sequencing [J]. Water research, 2012,46(8):2772—2782.

[23] Fuhs G W, Chen M. Microbiological basis of phosphate removal in the activated sludge process for the treatment of wastewater [J]. Microbial Ecology, 1975,2(2):119—138.

[24] Suresh N, Warburg R, Timmerman M, et al. New strategies for the isolation of microorganisms responsible for phosphate accumulation [J]. Water science and technology, 1985,17(11/12): 99—111.

[25] Liu P, Liu K, He J. A novel analysis to the ridged cylinder TEM transmission line [J]. International journal of infrared and millimeter waves, 1995,16(6):1083—1090.

[26] Gieseke A, Arnz P, Amann R, et al. Simultaneous P and N removal in a sequencing batch biofilm reactor: insights from reactor-and microscale investigations [J]. Water Research, 2002, 36(2):501—509.

Microbial diversity in activated sludges of conventional and reversed A2/O processes.

LI Peng1,2, BI Xue-jun3, WANG Jun2, RU Shao-guo2*(1.Shandong Academy of Environmental Science, Jinan 250013, China；2.Marine Life Science College, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；3.School of Environmental and Municipal Engineering, Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China). China Environmental Science, 2017,37(3)：1137～1145

To explore the reason why removal efficiency of nitrogen and phosphorus in reversed anoxic-anaerobic-oxic (A2/O) process is higher than that in conventional A2/O process, bacterial community compositions of activated sludges from the two procedures were investigated by PCR-DGGE (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis) technique and cultivation method. Betaproteobacteria and Gammaproteobacteria were detected as dominant bacteria in activated sludge from both processes. In the activated sludge of the reversed A2/O process, a large amount of Nitrosospira sp., Rhodocyclus sp., and four uncultured bacteroidetes bacterium were detected by PCR-DGGE technique, while less of these bacteria were found in the conventional A2/O process. Shewanella algae sp., Klebsiella sp., and Rhodobacter sphaeroides of Gammaproteobacteria were separated from the activated sludge of reversed A2/O process by cultivation method, while they were absent from the conventional A2/O process. The diversity of these above-mentioned bacteria species could account for the higher removal efficiency of nitrogen and phosphorus in the reversed A2/O process. Additionally, scanning electron microscopy showed that the activated sludge of reversed A2/O process was relatively loose, with less Filamentous bacteria and no Nostoc.

activated sludge；microbial community structure；PCR-DGGE；reversed A2/O process

X172

A

1000-6923(2017)03-1137-09

李 鵬(1981-),男,山東兗州人,高級(jí)工程師,碩士,主要從事污水處理活性污泥微生物等方面研究.發(fā)表論文10余篇.

2016–07–22

山東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(ZR2014DZ001); 高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助課題(20120132110011)

* 責(zé)任作者, 教授, rusg@ouc.edu.cn