何露霞， 李夢婷， 袁 曄， 王利琳， 陳哲皓

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

擬南芥器官大小調(diào)控基因AtKIX8啟動子的克隆和表達(dá)分析

何露霞， 李夢婷， 袁 曄， 王利琳， 陳哲皓

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

為研究擬南芥器官大小調(diào)控基因AtKIX8的表達(dá)模式，以期進(jìn)一步研究其功能機(jī)制，克隆了該基因啟動子序列，獲取了啟動子-GUS轉(zhuǎn)基因報告植株.利用GUS組織化學(xué)染色檢測了該啟動子作用位置，利用熒光定量PCR分析了啟動子對外源激素及冷脅迫的響應(yīng).結(jié)果表明該啟動子誘導(dǎo)GUS基因在幼苗莖尖分生區(qū)，成株莖、葉主脈中特異性表達(dá)，生長素和低溫處理顯著提高GUS基因的表達(dá)量.說明擬南芥AtKIX8基因啟動子具備組織特異性表達(dá)模式，且能受到外源生長素和低溫的誘導(dǎo).

擬南芥；器官大??；AtKIX8基因；啟動子；克隆；表達(dá)分析

擬南芥AtKIX8(At3g24150)基因編碼產(chǎn)物屬于KIX蛋白家族成員，該家族11個成員的N-末端均含有保守KIX結(jié)構(gòu)域[1].研究認(rèn)為KIX結(jié)構(gòu)域可能介導(dǎo)了與轉(zhuǎn)錄因子活化域的互作[2]，有報道稱含有KIX蛋白結(jié)構(gòu)域的CBP/p300和MED15蛋白分別參與了開花時間調(diào)控[3]和水楊酸信號響應(yīng)[4]，而最新的研究推測該基因參與了植物器官大小及形態(tài)的調(diào)控[5].植物器官大小調(diào)控在生產(chǎn)實(shí)踐中有廣泛的應(yīng)用前景，對研究植物形態(tài)外觀、生存繁殖、脅迫抗性等品質(zhì)的遺傳有重要指導(dǎo)意義，但目前對KIX蛋白在擬南芥器官大小調(diào)控中的功能作用還知之甚少，也未見對其啟動子以及基因調(diào)控、表達(dá)模式的研究報道.為進(jìn)一步揭示該基因的功能，有必要對AtKIX8啟動子及其表達(dá)模式進(jìn)行研究.利用在線軟件PlantCARE可對基因啟動子區(qū)所含結(jié)構(gòu)元件作出預(yù)測[6]，預(yù)測的調(diào)控元件多能響應(yīng)外界信號，如TGA-1和AuxRE受到外源生長素的誘導(dǎo)作用[7-8]；DRE/CRT是擬南芥干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)元件[9]；ABRE元件能響應(yīng)干旱脅迫中ABA的應(yīng)答等等[10]，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以進(jìn)一步了解其表達(dá)和調(diào)控模式.

本研究以擬南芥AtKIX8基因啟動子為研究對象，克隆得到該基因啟動子長、短片段各一個，分析了其所包含的潛在調(diào)控元件；構(gòu)建啟動子-GUS報告基因表達(dá)載體，獲取轉(zhuǎn)基因純合啟動子報告株系；利用轉(zhuǎn)基因報告系研究擬南芥AtKIX8基因的組織表達(dá)模式和潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制.為進(jìn)一步揭示擬南芥AtKIX8基因的功能機(jī)理和調(diào)控機(jī)制提供線索.

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)使用野生型擬南芥Columbia-0，農(nóng)桿菌菌株GV3101，使用含GUS報告基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301.克隆試劑盒、限制性內(nèi)切酶購于Takara寶生物工程(大連)有限公司；T4DNA連接酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript First-Strand cDNA Synthesis)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；所有引物訂購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他材料均購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 擬南芥AtKIX8基因啟動子序列預(yù)測分析

根據(jù)擬南芥信息網(wǎng)(http://www.arabidopsis.org/)中的AtKIX8(At3g24150)基因序列及其所在染色體的位置信息，將基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前3 000 bp的DNA序列作為預(yù)測的啟動子序列，利用在線軟件PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對這一序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分析.

1.2.2 擬南芥AtKIX8基因啟動子克隆及植物表達(dá)載體構(gòu)建

以AtKIX8基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前3 000bp的DNA序列設(shè)計長、短2個片段的克隆引物，含KpnI酶切位點(diǎn)的長片段上游引物為：5′-GGTACCGCAAGAGTCAGCCTAACAAGTA-3′；短片段的上游引物為：5′-GGTACCGCTGTCAAAGTTGCTGAAGGT-3′；設(shè)計含NcoI酶切位點(diǎn)的長、短片段下游通用引物為：5′-CCATGGGGAAATGGAAATGGTGTGATTC-3′.

以野生型擬南芥基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到2個目的片段，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5min，94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃長、短片段各延伸3min、1min，30個循環(huán)后72 ℃延伸10min.產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收純化.純化產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆、菌落PCR檢測和質(zhì)粒KpnI/NcoI雙酶切驗(yàn)證后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序.測序正確的克隆載體及空表達(dá)載體pCAMBIA1301進(jìn)行KpnI/NcoI雙酶切，分別回收目的片段及空表達(dá)載體大片段進(jìn)行連接，重組質(zhì)粒經(jīng)驗(yàn)證后通過凍融法分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101[11].

1.2.3 擬南芥培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)化篩選

擬南芥種子經(jīng)表面消毒后無菌水沖洗5次，點(diǎn)入B5培養(yǎng)基，4 ℃放置2～3d破除種子休眠后移入光照培養(yǎng).培養(yǎng)條件為：22 ℃恒溫，濕度60%，光照強(qiáng)度10 000lx，16h光照/8h黑暗長日照條件.7～10d幼苗移入土中培養(yǎng)，至3～4周后開花，即可用于基因轉(zhuǎn)化.擬南芥基因轉(zhuǎn)化使用花序浸潤法[12].轉(zhuǎn)基因陽性植株的篩選使用12.5mg/L潮霉素(hygromycin).抗性植株經(jīng)過3代的篩選分離，獲取純合的轉(zhuǎn)基因系.

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的GUS組織化學(xué)染色

利用X-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronicacid)對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行GUS蛋白組織化學(xué)染色.整株轉(zhuǎn)基因幼苗或部分成熟植株器官在X-gluc終溶液(1mg/mLX-gluc，0.5mM高鐵氰化鉀，0.5mM亞鐵氰化鉀，0.1%TritonX-100，50mM磷酸緩沖液，10mMEDTA，pH7.0)中37 ℃染色過夜，70%酒精脫色至葉綠素完全消失，拍照記錄植株染色情況.

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株處理實(shí)驗(yàn)及實(shí)時熒光定量PCR

選取生長狀態(tài)基本一致的10d轉(zhuǎn)基因純合幼苗，分別轉(zhuǎn)移至添加10μmol/L生長素(IAA)、50μmol/L赤霉素(GA3)和200μmol/L脫落酸(ABA)的培養(yǎng)基上，以轉(zhuǎn)移到新B5固體培養(yǎng)基上幼苗為對照，光照處理12h.低溫處理使用4 ℃冰箱，并以不透光包裹后置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h的幼苗為對照.

使用Trizol法提取實(shí)驗(yàn)組和對照組的莖尖分生組織區(qū)RNA，經(jīng)過DNA酶處理純化后電泳分析并測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA.實(shí)時定量PCR以擬南芥多聚泛素酶基因(ubiquitin5, UBQ5)作為內(nèi)參，上游引物：5′-CGTGGTGGTGCTAAGAAGAGG-3′；下游引物：5′-GAAAGTCCCAGCTCCACAGGT-3′；GUS基因(uidA)作為目的基因，上游引物：5′-TGTAATGTTCTGCGACGCTCAC-3′；下游引物：5′-TCGGTGATGATAATCGGCTGA-3′.使用CFX96(Bio-Rad，USA)定量PCR儀，10μL反應(yīng)體系包含2×UltraSYBRMixture5μL，cDNA1μL及上下游引物各0.5μL，每個反應(yīng)含3個平行重復(fù).反應(yīng)程序：95 ℃ 10min；95 ℃ 15s，60 ℃ 1min循環(huán)40次，以溶解曲線檢查產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性.每個樣品進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)，使用2-△△Ct相對定量法計算GUS基因相對表達(dá)量[13].

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥AtKIX8基因預(yù)測啟動子的序列分析

以擬南芥AtKIX8基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前3 000bp的DNA序列作為預(yù)測的啟動子序列，用PlantCARE軟件在線分析其啟動子區(qū)域的特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及其潛在功能，結(jié)果如表1所示.

表1 擬南芥AtKIX8基因啟動子區(qū)順式作用元件分析Tab. 1 Predicted cis-acting elements of the AtKIX8 gene promoter

A：AtKIX8基因長啟動子PCR擴(kuò)增； B：AtKIX8基因短啟動子PCR擴(kuò)增；M：DNA Marker.圖1 擬南芥AtKIX8基因啟動子PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of AtKIX8 gene promoters

分析發(fā)現(xiàn)擬南芥AtKIX8基因啟動子含有多種植物激素響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件和其他一些組織特異性調(diào)控序列.預(yù)示該基因的表達(dá)可能受植物激素、光和低溫這些外界因素的誘導(dǎo)，也可能與分生組織、胚乳和花粉的形成或相關(guān)功能有關(guān).

2.2 擬南芥AtKIX8基因啟動子的克隆

為研究AtKIX8基因的啟動子區(qū)域及其表達(dá)調(diào)控模式，我們克隆了長、短2個片段的啟動子序列，其中長片段pKIX8L為2 851bp，短片段pKIX8S為954bp，如圖1A、1B所示，與預(yù)期大小一致.

此2片段經(jīng)回收及T-A克隆、菌落PCR檢測、質(zhì)粒、雙酶切驗(yàn)證和公司測序后獲取了序列完全正確的克隆質(zhì)粒，可用于后續(xù)的表達(dá)載體構(gòu)建.

2.3 植物表達(dá)載體pKIX8∷GUS構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

植物表達(dá)載體pCAMBIA1301中含pCaMV35S∷GUS結(jié)構(gòu)，其中GUS報告基因前的pCaMV35S啟動子可使用Kpn I/Nco I雙酶切去除.利用這2個限制性內(nèi)切酶以及DNA連接酶，分別將長、短克隆片段替換表達(dá)載體中的pCaMV35S啟動子，獲得了含有pKIX8L∷GUS、pKIX8S∷GUS的重組植物表達(dá)載體.重組質(zhì)粒進(jìn)行KpnI/NcoI雙酶切驗(yàn)證結(jié)果分別如圖2A、2B所示.

A：pKIX8L∷GUS表達(dá)載體雙酶切；B：pKIX8S∷GUS表達(dá)載體雙酶切；M：DNA Marker；1-3：不同克隆.圖2 pKIX8L∷GUS、pKIX8S∷GUS表達(dá)載體酶切Fig. 2 Digestion of expression vectors of pKIX8L∷GUS and pKIX8S∷GUS

選取驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒通過凍融法，被分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞.農(nóng)桿菌菌落PCR結(jié)果分別如圖3A、3B所示，陽性克隆可進(jìn)一步用于擬南芥植株的遺傳轉(zhuǎn)化.

A：含pKIX8L∷GUS表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌落PCR；B：含pKIX8S∷GUS表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌落PCR； M：DNA Marker；PC：陽性對照；NC：陰性對照；1-6：不同克隆.圖3 含pKIX8L∷GUS、pKIX8S∷GUS表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌落PCRFig. 3 Colony PCR of Agrobacteria harbouring expression vectors

2.4 擬南芥AtKIX8基因表達(dá)模式檢測

經(jīng)3代分離篩選，最終各自獲取轉(zhuǎn)基因純合T3代植株7株和6株.針對10d幼苗和4周開花植株的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果如圖4所示，在AtKIX8基因啟動子的驅(qū)動下，GUS基因主要集中在10d幼苗的莖尖分生組織區(qū)表達(dá)，另外僅在下胚軸的中柱、主根的中柱以及幼葉的主脈等維管系統(tǒng)中能觀測到其表達(dá)(圖4A)；GUS基因主要在開花植株葉片的主脈以及莖中強(qiáng)表達(dá)，其他部位均未檢出(圖4B).該染色結(jié)果在同一載體的不同轉(zhuǎn)基因株系間一致，長、短片段驅(qū)動下的基因組織特異性表達(dá)效果沒有顯著區(qū)別.

A：10 d幼苗的GUS染色結(jié)果；B：4周植株的GUS染色結(jié)果；比例尺=5 mm.圖4 pKIX8啟動子驅(qū)動下GUS基因在擬南芥中的表達(dá)Fig. 4 The expression of GUS gene driven by pKIX8 promoter in Arabidopsis

2.5 擬南芥AtKIX8基因啟動子對植物激素和低溫脅迫的響應(yīng)

為進(jìn)一步研究AtKIX8基因受到的表達(dá)調(diào)控，根據(jù)表1中的元件分析結(jié)果，選取了不同植物激素和低溫脅迫對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行處理.利用定量PCR檢測了不同激素和低溫處理下GUS基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示.在生長素IAA處理下，GUS基因的表達(dá)量在長、短片段啟動子的驅(qū)動下均有2倍以上的顯著提升(P<0.05)，但長、短啟動子的驅(qū)動效果無明顯差異(圖5A)；在赤霉素GA3和脫落酸ABA處理下，GUS基因的表達(dá)量在長短片段啟動子的驅(qū)動下均沒有顯著的變化(圖5B、C)；在低溫(4 ℃)處理下，GUS基因的表達(dá)均有顯著提高(P<0.05)，但長、短啟動子的驅(qū)動效果無明顯差異(圖5D).結(jié)果表明，AtKIX8啟動子僅能夠響應(yīng)低溫和外源IAA，對GA和ABA并不敏感.

A：10 μM IAA處理12 h下GUS基因表達(dá)變化；B：50 μM GA3處理12 h下GUS基因表達(dá)變化； C：200 μM ABA處理12 h下GUS基因表達(dá)變化；D：4 ℃冷處理12 h下GUS基因表達(dá)變化； *：差異顯著，P<0.05.圖5 不同處理下GUS基因表達(dá)量變化Fig. 5 Relative expression levels of GUS under different treatment

3 討 論

擬南芥AtKIX8基因?qū)儆贙IX蛋白家族成員，研究表明該基因表達(dá)產(chǎn)物可能通過抑制其他基因的表達(dá)[14]，調(diào)控植物器官的大小[6].為闡明AtKIX8基因的功能機(jī)理及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究預(yù)測分析了其啟動子序列，并進(jìn)行了克隆研究.

報告基因GUS常被用于植物中啟動子表達(dá)模式的分析，在各個物種中均有報道，例如擬南芥蔗糖載體蛋白基因SUC2啟動子驅(qū)動GUS基因在擬南芥蓮座葉、莖和萼片的韌皮部高度特異性表達(dá)[15]；大豆硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GmSULTR1;2b啟動子驅(qū)動GUS基因在根毛、根表皮和中柱內(nèi)特異性表達(dá)[16]等等.預(yù)測中AtKIX8基因啟動子區(qū)存在多個組織特異性表達(dá)元件(表1)，通過本研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtKIX8基因啟動子確實(shí)具備組織特異性，主要限制于幼苗期莖尖分生組織區(qū)及維管組織中，以及開花植株的莖和主葉脈中(圖4).植物頂端分生組織區(qū)決定了葉、側(cè)枝、花原基的形成，進(jìn)而調(diào)控了植物各器官的生長發(fā)育及其大小[17-18]，預(yù)示AtKIX8基因可能通過參與調(diào)控分生組織區(qū)功能進(jìn)而影響植物器官大小.

預(yù)測發(fā)現(xiàn)該基因啟動子區(qū)存在包括低溫誘導(dǎo)元件以及多種植物激素特異誘導(dǎo)元件(表1).對上述轉(zhuǎn)基因報告株系進(jìn)行的各類植物激素和低溫處理表明，AtKIX8基因啟動子在本實(shí)驗(yàn)中僅受到生長素和低溫的誘導(dǎo)(圖5).生長素在植物生長發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用，尤其能通過影響細(xì)胞分裂、伸長和分化來決定器官的最終大小和形狀[19-20]，預(yù)示AtKIX8基因有可能通過調(diào)節(jié)生長素反應(yīng)來調(diào)控器官的大小.干旱和低溫誘導(dǎo)元件DRE/CRT在擬南芥中特異性結(jié)合DREB2s轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)下游基因表達(dá)提高植物脅迫抗性[21-22]，而器官大小的調(diào)節(jié)則是提高脅迫抗性的其中一種有效方式[23]，預(yù)示AtKIX8基因也有可能通過參與脅迫應(yīng)答來調(diào)控器官大小.雖然啟動子序列分析顯示其具備脫落酸及赤霉素響應(yīng)元件，但本實(shí)驗(yàn)中該啟動子對兩者均不敏感，可能與該基因的組織特異性及時序性表達(dá)模式有關(guān)，也可能受到處理濃度及時間的影響，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí).

另外本實(shí)驗(yàn)中克隆的啟動子長、短片段表達(dá)模式基本一致，且均能響應(yīng)外源生長素和冷脅迫，驅(qū)動效果無明顯差異，說明954bp的短片段已經(jīng)包含了該基因的主要啟動子功能區(qū)段.

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Promoter Cloning and Expression Pattern Analysis of an Organ-size-control GeneAtKIX8 inArabidopsis

HE Luxia, LI Mengting, YUAN Ye, WANG Lilin, CHEN Zhehao

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

To understand the expression pattern of an organ-size-control geneAtKIX8 and further elucidate its function mechanism inArabidopsis, promoter ofAtKIX8 was cloned and promoter-GUS transgenic lines were obtained. The location of GUS protein was detected by staining, and the response ofAtKIX8 gene promoter to phytohormone and cold stress was analyzed by real-time RT-PCR. The results showed that the expression of GUS gene was restricted in shoot apical meristems in seedlings, and in stems and primary veins of leaves in flowering plants. Real-time PCR results displayed that the expression of GUS gene was up-regulated obviously with auxin and cold treatments. It showed that this promoter had a tissue-specific expression pattern, and could be induced by exogenous auxin and cold treatments.

Arabidopsisthaliana; organ size;AtKIX8 gene; promoter; clone; expression analysis

2016-06-03

浙江省自然科學(xué)基金項目(LY14C020004).

陳哲皓(1982—)，男，講師，博士，主要從事植物生理與發(fā)育研究.E-mail：zhchen@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.02.008

Q

A

1674-232X(2017)02-0158-06