劉意++蘇文瑾++雷劍++王連軍++柴沙沙++楊新筍++張文英

摘要：對湖北省2個甘薯主產(chǎn)區(qū)內3個甘薯主栽品種，共計39份樣本甘薯病毒病采用硝酸纖維膜酶聯(lián)免疫檢測法（NCM-ELISA）檢測。結果表明，39份測試甘薯樣本中，1個樣本感染了甘薯退綠病毒（SPCFV），檢出率為2.56%；18個樣本感染了甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV），檢出率為46.15%；4個樣本感染了甘薯潛隱病毒（SPLV），檢出率為10.26%；1個樣本感染了甘薯G病毒（SPVG），檢出率為2.56%。3個主栽甘薯品種中，鄂薯6號病毒檢出率最高，為66.67%；其次為徐薯22，病毒檢出率為45.45%；福薯18的病毒檢出率為43.75%。不同產(chǎn)地甘薯主栽品種帶毒狀況調查表明，鄂州主產(chǎn)區(qū)病毒病種類最多，病毒檢出率最高。在5種受測目標病毒中，SPFMV的發(fā)生和危害最為嚴重，其單個采樣點的樣本感染率最高為52.12%；其次為SPLV，單個采樣點的樣本感染率為20.00%。2個主產(chǎn)區(qū)檢測樣品均未檢測到甘薯退綠矮化病毒（SPCSV），但并不意味SPCSV在2個主產(chǎn)區(qū)沒有發(fā)生，因此有待進一步大范圍調查驗證。

關鍵詞：甘薯；病毒病；硝酸纖維膜酶聯(lián)免疫檢測法（NCM-ELISA）

中圖分類號：S435.313 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）22-5821-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.023

Identification of Virus Diseases in Main Sweetpotato Cultivars in Hubei Province

LIU Yi1，SU Wen-jin2，LEI Jian2，WANG Lian-jun2，CHAI Sha-sha2，YANG Xin-sun2，ZHANG Wen-ying1

（1.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China；2.Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crops Germplasm and Genetic Improvement/Hubei Sweetpotato Engineering and Technology Research Centre，Wuhan 430064，China）

Abstract： Thirty-nine samples of three sweetpotato cultivars collected from two major producing areas in Hubei province were tested by NCM-ELISA method. The results showed that among all the samples， one sample infected SPCFV and the other one infected SPVG， disease detection rate of them was 2.56%， respectively； Eighteen samples infected SPFMV， detection rate was 46.15%； Four samples infected SPLV， detection rate was 10.26%. Eshu No.6 got the highest detection rate， which was 66.67%； The detection rate of Xushu No.22 and Fushu No.18 was 45.45% and 43.75%， respectively. The sanitary state investigation showed the cultivars in Ezhou infected more kinds of virus diseases than in Wuhan. Among all the tested virus diseases， SPFMV was the most popular kind of disease，sample infection rate in one collection area was 52.12%； The following virus disease was SPLV，sample infection rate in one collection area was 20.00%. Neither of the two areas detected sample had found SPCSV，but it wasnt meaned that SPCSV didnt happen in two areas， so we need further large-scale survey.

Key words： sweetpotato； virus disease； NCM-ELISA

甘薯是中國重要的糧食與經(jīng)濟作物，其產(chǎn)品已經(jīng)延伸到食品、能源等各個領域[1]。甘薯作為湖北省主要的雜糧作物，種植面積占全省耕地總面積的5%～6%，同時由于湖北省位于國內南北兩大甘薯種植優(yōu)勢區(qū)的交叉地帶，常年種植面積位居全國前十，產(chǎn)業(yè)發(fā)展快速。近年來，各個甘薯種植新區(qū)相繼建立，甘薯栽培面積不斷擴大，各地區(qū)間引種日益頻繁，導致了甘薯病毒病危害更為嚴重，已成為制約甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。甘薯病毒病往往采取復合侵染的方式進行危害，繁多的病毒種類給病毒病防治帶來了很大的困難，通常根據(jù)種植季節(jié)的不同，甘薯病毒病侵染可以造成30%～50%不等的損失[2]，甘薯病毒病造成的甘薯品質下降和種性退化給農業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[3，4]。為了減少甘薯病毒病的傳播與蔓延，特別是一些危險性病毒病的傳播與侵染，對一些主栽甘薯品種進行病毒檢測顯得十分重要。目前，甘薯病毒病檢測的方法有多種，包括癥狀學檢測、指示植物檢測、電子顯微鏡檢測、雙鏈RNA分析、核酸斑點雜交以及血清學檢測等[5]。其中血清學檢測是目前國內外最常用的甘薯病毒病檢測方法之一[6，7]。血清學檢測法包括免疫電鏡法（ISEM）、雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測法（DAS-ELISA）、硝酸纖維膜酶聯(lián)免疫檢測法（NCM-ELISA）等，其中NCM-ELISA法以靈敏度高、重復性好逐步取代了DAS-ELISA法被應用于甘薯病毒病檢測[8]。

從世界各地的統(tǒng)計結果看，甘薯病毒病的種類有10種之多[9]。本試驗采用NCM-ELISA法對湖北省內甘薯主栽品種病毒種類進行檢測，旨在弄清楚相關病毒在湖北省甘薯主產(chǎn)區(qū)的流行趨勢，為建立湖北省甘薯脫毒苗繁育技術體系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試材料來自武漢和鄂州兩個甘薯主產(chǎn)區(qū)。2014年8月上旬，在湖北省農業(yè)科學院糧食作物研究所試驗基地（武漢）、江夏試驗基地（武漢）以及鄂州農戶自留田中隨機摘取福薯18、徐薯22、鄂薯6號3個品種具有一定癥狀的植株上、中、下3部分的新鮮葉片，將樣品密封于樣品袋中，注明采集日期、地點、品種，于4 ℃冰箱中備用。參試材料中包含11份徐薯22樣品，均采自農戶自留田；12份鄂薯6號樣品，均采自農戶自留田；16份福薯18樣品，其中6份采自湖北省農業(yè)科學院糧食作物研究所試驗基地，10份采自江夏試驗基地。

1.2 測試病毒種類及病毒檢測方法

甘薯病毒病抗血清由河南省農業(yè)科學院提供，本研究采用邢繼英等[2]的甘薯病毒病檢測方法分別對甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）、甘薯潛隱病毒（SPLV）、甘薯退綠病毒（SPCFV）、甘薯退綠矮化病毒（SPCSV）、甘薯G病毒（SPVG）進行檢測，以下簡稱SPFMV、SPLV、SPCFV、SPCSV、SPVG。

2 結果與分析

2.1 主栽甘薯品種田間癥狀調查及血清學檢測

對來自武漢和鄂州的39份甘薯主栽品種樣品進行了病毒病檢測，5種病毒病檢測統(tǒng)計結果見表1、圖1～圖5。結果表明，在檢測的39份甘薯樣品中，SPFMV、SPLV、SPCFV、SPVG、SPCSV 5種甘薯病毒，SPCSV的檢出率為0，SPCFV、SPFMV、SPLV、SPVG的檢出率分別為2.56%、46.15%、10.26%、2.56%，即4種病毒均有發(fā)生，其中，SPFMV的檢出率最高。

2.2 不同主栽甘薯品種病毒感染狀況

3個甘薯主栽品種徐薯22、鄂薯6號、福薯18檢測出至少攜帶2種目標病毒（表2），在檢測的目標病毒中，SPFMV發(fā)生最為普遍，3個測試甘薯品種中均攜帶該病毒，沒有品種感染SPCSV，SPCFV只在徐薯22中被檢測到，SPLV在鄂薯6號和福薯18中均被檢測到，SPVG在鄂薯6號中被檢測到。在被測的3個甘薯品種中，徐薯22的病毒檢出率為45.45%，鄂薯6號的病毒檢出率為66.67%，福薯18的病毒檢出率為43.75%。

2.3 不同產(chǎn)地甘薯主栽品種帶毒狀況

在2個甘薯主產(chǎn)區(qū)采樣分析后發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地甘薯品種間病毒檢出率存在較大差異。表3結果顯示，SPFMV是鄂州和武漢兩地均存在的病毒。在鄂州采集的樣品中，SPFMV的檢出率達到52.17%，另外還有少量的品種帶有SPCFV、SPLV和SPVG，病毒檢出率分別為4.35%、8.70%和4.35%。在糧食作物研究所試驗基地采集的樣品中，SPFMV的檢出率達到50.00%，未見感染其他病毒。在江夏試驗基地采集的樣品中，SPFMV的檢出率達到30.00%，同時SPLV的感染率達到20.00%，尚未見感染其他病毒。

3 小結與討論

3.1 甘薯病毒病檢測研究進展

甘薯病毒病檢測可以分為癥狀學診斷、生物學檢測、血清學檢測以及各種分子檢測等。癥狀學診斷常受病毒種類、品種類型、生長階段以及環(huán)境條件等因素影響，因此癥狀學診斷只能作初步判斷。生物學檢測又叫指示植物檢測法，指示植物對某一種或某幾種病毒具有敏感反應，一旦被感染，就能表現(xiàn)出癥狀，但是往往存在一病多癥、多病一癥的現(xiàn)象，難以區(qū)分病毒種類，另外通過指示植物進行病毒病檢測周期長且占地面積大，不利于大批量檢測[10]。

血清學檢測是最常用和有效的植物病毒檢測方法之一，在甘薯病毒檢測方面，Moyer等[11]首次純化了SPFMV；張振臣等[12]、付振艷等[13]、黃玉娜等[14]、張業(yè)輝等[15]分別在大腸桿菌中高效表達了SPFMV、SPVG、SPLV、SPVMV的CP基因，通過純化蛋白、免疫家兔制備了上述病毒的抗血清。NCM-ELISA以硝酸纖維素膜（NCM）為固相載體，使得檢測更為簡便、快速、經(jīng)濟。Abad等[16]用NCM-ELISA法檢測了SPFMV及其不同株系。Karyeija等[17]用NCM-ELIS法對SPFMV進行研究；Brunt等[18]用NCM-ELISA法對SPLV進行了研究，張立明等[19]用NCM-ELISA法對黃淮薯區(qū)1 580份甘薯樣品進行測定，表明SPFMV和SPLV是普遍存在的兩種主要甘薯病毒。單林娜等[20]采用NCM-ELISA法檢測南陽市甘薯病毒病，表明南陽市甘薯病毒主要為SPFMV、SPLV、SPCFV、SPMMV等。喬奇等[21]采用NCM-ELISA法，對中國18個省市176份表現(xiàn)甘薯病毒病癥狀的樣品進行檢測，結果表明，供試樣品中SPFMV的陽性率最高，達56.30%，并發(fā)現(xiàn)中國甘薯至少存在SPFMV、SPVG、SPLV、SPCFV、SPCSV、SPCMV、SPVMV和SPLCV 8種病毒，與本試驗的研究結果趨于一致。

3.2 湖北省甘薯病毒病發(fā)生分布

本試驗初步研究了湖北省主要甘薯病毒病發(fā)生的種類和分布特點以及湖北省甘薯主栽品種的病毒病感染狀況。SPFMV是2大甘薯主產(chǎn)區(qū)鄂州和武漢發(fā)生最為普遍的病毒種類，在被測試的所有甘薯樣本中，SPFMV檢出率為46.15%。在3個不同的種植區(qū)域，SPFMV的檢出率分別達到52.17%、50.00%和30.00%。通常在一個特定的甘薯產(chǎn)區(qū)中，一個品種的單株感病，該品種其他的單株都被同一種病毒感染，本研究認為品種的頻繁引進與輸出是病毒病傳播的主要途徑，這與王明霞等[10]的研究報道一致。

鄂州與武漢兩地大約在6～7月出現(xiàn)肉眼可見的染病單株癥狀，主要表現(xiàn)為明脈、退綠、生長停滯。徐薯22、鄂薯6號、福薯18均是湖北省主栽甘薯品種，在3個種植區(qū)域的樣本中均檢測到了SPFMV。根據(jù)血清學檢測結果，除了SPFMV外，其他病毒也有進一步蔓延的趨勢。如SPLV檢出率為10.26%，SPCFV和SPVG的檢出率均為2.56%，對一些品種進行田間調查時，肉眼看不出任何癥狀，但是血清學檢測結果說明該品種已帶有病毒，目前表現(xiàn)為隱性。另外，目前全國SPVD大暴發(fā)，傳染力極強，SPVD的發(fā)生依賴于SPCSV和SPFMV的協(xié)同傳播，SPFMV通常能迅速傳播到感染SPCSV的植株上，有SPCSV最初癥狀的甘薯很快能形成SPVD[22]，在本研究所調查區(qū)域的樣品中并未發(fā)現(xiàn)SPCSV，但是SPFMV檢出率高，更應警惕SPVD在湖北的暴發(fā)。湖北省2個甘薯主產(chǎn)區(qū)武漢和鄂州均檢測到甘薯病毒病的發(fā)生，其中SPFMV在兩地發(fā)生最嚴重；主栽品種中鄂薯6病毒檢出率最高；2個主產(chǎn)區(qū)中，鄂州農戶自留田病毒病種類最多，病毒檢出率最高；2個主產(chǎn)區(qū)的檢測樣品均未檢測到甘薯SPCSV，但并不意味著SPCSV在2個主產(chǎn)區(qū)沒有發(fā)生，有待進一步大范圍調查驗證。試驗結果表明，甘薯病毒病在湖北呈現(xiàn)多樣性暴發(fā)趨勢，應加強甘薯病毒病的檢測和預防工作。

由于本試驗所采集的樣品主要來自湖北重要的甘薯品種試驗基地，具有一定的代表性，因此調查結果對湖北省甘薯病毒病的防治奠定了基礎。但是，由于NCM-ELISA方法常存在假陽性反應，使得檢測結果具有一定的誤差，因此其真實性還需進一步驗證，加快RT-PCR等快速、有效的分子水平檢測方法的建立，以適應現(xiàn)代科研及生產(chǎn)的需要尤為重要[1，23]。

3.3 甘薯病毒病的防治

甘薯病毒病發(fā)生可以通過多種途徑，已知的甘薯病毒病都可以通過塊根和嫁接傳播，還可以通過菟絲子、粉虱以及牽?；蛞吧鸁煵莸姆N子進行傳播[20]，其寄主的種類也十分復雜多樣，尤其喜好寄生在牽牛屬植物上[11]。甘薯病毒病的發(fā)生和流行程度往往取決于種薯、種苗帶毒率和各種傳毒介體種群數(shù)量、活力以及品種抗性，此外還與土壤、耕作制度和栽植期有關。因此，甘薯病毒病的防治可采取農業(yè)防治的方法，如保持田間清潔、去除菟絲子或其他牽牛屬植物類田間雜草、避免與牽牛屬作物進行間作以及采用輪作的方式以阻斷病害的循環(huán)。此外，對蚜蟲、粉虱等病毒傳播媒介進行有效控制也可減輕甘薯病毒的傳播。但大量化學藥劑的使用雖然殺死了蚜蟲、粉虱等病毒傳播介體，卻污染了環(huán)境。截至目前為止，防治甘薯病毒病的最好方法是用組織培養(yǎng)的方法培育脫毒甘薯苗，配套良好的耕作栽培制度，提高病毒病檢測和預防效率[24，25]，綜合以上措施可以達到控制甘薯病毒病進一步蔓延的目的。

參考文獻：

[1] 蒲志剛，曲繼鵬，吳 潔，等.四川省甘薯病毒病調查及病原血清學鑒定[J].西華師范大學學報（自然科學版），2007，28（4）：270-273.

[2] 邢繼英，楊永嘉.甘薯病毒病檢測方法[J].植物保護，1995，21（2）：38-40.

[3] 安 康，房伯平，張雄堅，等.甘薯種質資源病毒病調查研究初報[J].廣東農業(yè)科學，2003（4）：39-40.

[4] 李汝剛，蔡少華，SALAZAR L F.中國甘薯病毒的血清學檢測[J].植物病理學報，1990，20（3）：189-194.

[5] SALAZAR L F. Serological Methods for Virus Detection. In Potato Viruses and Their Control[M].Lima：International Potato Center，1996.

[6] WINFERIED H. Tissue-print immunoassay-a rapid and reliable method[J].Plant Research and Development，1999，49：7-9.

[7] HAWKES R，NIDAY E，GORDON J. A dot-immunobinding assay for monoclona and other antibodies[J].Analytical Biochemistry，1982，119（1）：142-147.

[8] 馬 麗，張春慶，周玉亮.甘薯病毒病檢測技術研究進展[J].中國農學通報，2005，21（2）：88-91.

[9] MOYER J W，SALAZAR L F. Virus and virus-like diseases of sweetpotato[J].Plant Disease，1989，73（6）：451-455.

[10] 王明霞，李德福.幾種引進蔬菜病毒病檢測及對引種工作的建議[J].中國蔬菜，1995（3）：35-36.

[11] MOYER J W，KENNEDY G G. Purification and properties of sweetpotato feathery mottle virus[J].Phytopathology，1978，68（7）：998-1004.

[12] 張振臣，李大偉，陳健夫，等.甘薯羽狀斑駁病毒外殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達及特異抗血清的制備[J].農業(yè)生物技術學報，2000，8（2）：177-179.

[13] 付振艷，張振臣.甘薯病毒G（SPVG）外殼蛋白基因的克隆、表達及抗血清的制備[J].中國農學通報，2007，23（1）：38-41.

[14] 黃玉娜，張振臣.甘薯潛隱病毒外殼蛋白基因的克隆、表達及其抗血清的制備[J].植物病理學報，2007，37（3）：255-259.

[15] 張業(yè)輝，秦艷紅，喬 奇，等.甘薯脈花葉病毒外殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達及其抗血清的制備[J].植物病理學報，2011，41（1）：57-63.

[16] ABAD J A，MOYER J W. Detection and distribution of sweetpotato feathery virus in sweetpotato by in vitro transcribed RNA probes， membrance immunobinding assay and direct bloting[J].Phytopathology，1992，82（3）：300-305.

[17] KARYEIJA R F，KREUZE J，GIBSON R W，et al. Two serotypes of sweetpotato feathery mottle virus in Uganda and their interaction with resistant sweetpotato cultivars[J].Phytopathology，2000，90（11）：1250-1255.

[18] BRUNT A A，CRABTREE K，DALLWITZ M J，et al. Viruses of Plants：Descriptions and Lists from the VIDE Database[M].Wallingford UK：CAB International，1996.

[19] 張立明，王慶美，馬代夫，等.甘薯主要病毒病及脫毒對塊根產(chǎn)量和品質的影響[J].西北植物學報，2005，25（2）：316-320.

[20] 單林娜，葛應蘭，李建波，等.甘薯病毒病原學研究進展[J].河南農業(yè)大學學報，2001，35（1）：92-96.

[21] 喬 奇，張振臣，張德勝，等.中國甘薯病毒種類的血清學和分子檢測[J].植物病理學報，2012，42（1）：10-16.

[22] 張 盼.甘薯病毒病害（SPVD）病原的檢測方法和分子變異研究[D].鄭州：河南農業(yè)大學，2012.

[23] 王關林，劉 娟.甘薯病毒的分子生物學研究進展[J].商丘師范學院學報，2009，25（3）：7-15.

[24] 蔣明權，王 鈺，林 毅，等.甘薯莖尖脫毒技術研究進展[J].安徽農業(yè)科學，2003，31（6）：1038-1039，1044.

[25] 康明輝，劉德暢，海 燕，等.甘薯脫毒技術的原理及方法[J].種業(yè)導刊，2010（1）：14-15.