張成玲,趙永強,謝逸萍,孫厚俊,楊冬靜,徐 振

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部 甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131)

甘薯苗床鐮刀菌病害分子檢測及分析

張成玲,趙永強,謝逸萍*,孫厚俊,楊冬靜,徐 振

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部 甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131)

從江蘇、河南、河北等地育苗床上采集發(fā)病薯苗,利用組織分離法分離病原菌,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定致病鐮刀菌種類。共分離獲得21株病原菌株，它們均產(chǎn)生兩種孢子,大型孢子鐮刀型,具3～5個分隔,小型孢子橢圓形或卵形,單胞或雙胞。這些病原菌株的rDNA-ITS片段大小為544～568 bp,核苷酸一致率為46.56%～100%。系統(tǒng)進化樹將供試病原菌分為3個組：組1為茄病鐮刀菌組,包括本研究的9個分離物;組2為尖孢鐮刀菌組,包括本研究的11個分離物;組3只包括2個分離物，即LN828191和本研究的分離物HNTY4。

甘薯;苗床;鐮刀菌;分子檢測

甘薯是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料和能源作物,也是國際上認可的美容、防癌首選作物[1-3]。甘薯育苗是甘薯生產(chǎn)上的關(guān)鍵環(huán)節(jié),培育無病健康苗是提高甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵。但是甘薯苗床病害的發(fā)生阻礙了甘薯育苗工作的開展,目前甘薯苗床期真菌類病害主要有黑斑病、軟腐病、鐮刀菌病害(根腐病、蔓割病等)[4-5]。

鐮刀菌病害是植物上一類重要的病害,寄主范圍廣,可侵染瓜類、豆類、棉花、馬鈴薯、柑橘等植物[6-8],造成植物莖部、根部和果實腐爛,嚴重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。該類病原菌在甘薯苗床上為害甘薯幼苗后,造成薯苗維管束變色、腐爛,薯苗生長緩慢、死亡等。本研究通過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)手段,明確了甘薯育苗床上病原鐮刀菌種類,可為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年從江蘇、河南、河北等地甘薯育苗床上采集薯苗末端呈現(xiàn)黑色或褐色腐爛病斑、根部維管束變黑或呈現(xiàn)纖維狀、地上植株比正常植株矮小等癥狀的甘薯苗樣品(圖1)。

1.2 病菌分離及純化

按常規(guī)組織分離法[9],采用PDA培養(yǎng)基平板在25 ℃條件下進行病原菌的分離和培養(yǎng),挑取單孢進行純化。將純化的病菌編號后,根據(jù)柯赫氏法則,利用孢子懸浮液接種甘薯品種勝利百號的幼苗，進行驗證。

1.3 病原菌形態(tài)特征的觀察及rDNA-ITS的擴增

將純化的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基平板上,在25 ℃下進行黑暗培養(yǎng),觀察菌落及孢子形態(tài)[10]；培養(yǎng)5 d后利用十字交叉法測量菌落的直徑。

將病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中,在25 ℃、125 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3～4 d,過濾收集菌絲體用于DNA的提取。利用DNA提取試劑盒[Takara,寶生物生工(大連)有限公司]提取菌絲總DNA。利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對病原菌的rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增[11]。 擴增條件為:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s,56 ℃退火50 s,72 ℃延伸50 s,共30個循環(huán);最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,由生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.4 序列分析

利用SDT(http://web.cbio.uct.ac.za/～brejnev/)及DNAMAN軟件進行序列比對,獲得序列一致率。對測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(www. ncbi.nlm. nih. gov)中進行BLAST比對分析。并下載相關(guān)序列,利用MEGA 6.0軟件(http://www.megasoftware.net)中的最大簡約法(Maximum likelihood, ML)和鄰接法(Neighbour-joining, NJ)對所獲得的序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[12],并進行分組分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鐮刀菌株的形態(tài)特征

從顯現(xiàn)癥狀的甘薯幼苗上分離病原菌并經(jīng)過柯赫氏法則驗證后,共獲得21個菌株。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后觀察菌絲體的顏色及菌落直徑,菌絲生長正面多呈白色至淡黃色或后期變深呈粉紅色或灰色,大部分菌株的菌絲體反面為淡黃色或白色,即產(chǎn)生很少的色素,但HNTY1的顏色較深,為黑色。不同菌株的菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長速度相差較大,生長最快的為HB6-1,培養(yǎng)5 d后的菌落直徑達到70 mm；而XU4-1在培養(yǎng)5 d后的菌落直徑僅為44 mm。在培養(yǎng)7 d后觀察產(chǎn)生的孢子,發(fā)現(xiàn)21個菌株均產(chǎn)生兩種不同類型的孢子：大型分生孢子為鐮刀型,具3～5個分隔;小型分生孢子為橢圓形或圓形,有的分離物無分隔,為單胞,部分分離物為單胞或雙胞(表1)。

2.2 不同鐮刀菌株的分子鑒定

采用真菌通用引物ITS1/ITS4對病原菌株進行rDNA-ITS的PCR擴增,電泳檢測得到大小約550 bp的片段；經(jīng)連接、專化、測序分析得出,21個病原菌株ITS序列片段的長度分別為544、558、559、566及568 bp。利用SDT軟件對核苷酸一致率分析表明,21個病原菌株核苷酸的一致率在46.56%～100%之間。其中HNTY4與其他分離物間的一致率最低,在46.56%～50.81%之間；而其他病原菌株間的一致率均在82.53%以上。在NCBI上進行比對及根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定,21個病原菌株中有12株是尖孢鐮刀菌,且尖孢鐮刀菌大小均為544 bp,核苷酸一致率在49.65%～100%之間,其中HNTY4與其他分離物間的一致率最低(49.65%～50.81%),而其他分離物間的一致率在99.26%以上(圖2a)。9株是茄病鐮刀菌,盡管其核苷酸大小不一致,但其核苷酸一致率較高,為96.81%～100%(圖2b)。

將獲得的病原菌的rDNA-ITS序列與GenBank中相關(guān)真菌菌株的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示：系統(tǒng)進化樹分為3個組,組1為茄病鐮刀菌組,包含本研究的9個分離物,其中6個是河南分離物，2個是徐州分離物，1個為河北分離物;組2為尖孢鐮刀菌組,包括本研究的11個分離物,其中5個是河南分離物，6個是徐州分離物，2個是河北分離物;組3只有兩個分離物,分別是LN828191和河南分離物HNTY4(圖3)。

表1 不同鐮刀菌株的生長特性觀察結(jié)果

a：12株尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)。b：9株茄病鐮刀菌(F. solani)。

3 討論

鐮刀菌是植物上一種重要的病原菌,一般引起植物枯萎、根腐、莖腐等病害[13-15]。尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌是甘薯上兩種重要的病原菌,引起甘薯根腐、干腐、蔓割、潰瘍等病害。甘薯育苗床上該類病原菌來源一般是種薯薯塊帶菌或苗床土壤帶菌,在甘薯薯苗生長期侵染薯苗基部,造成弱苗、死苗。在發(fā)病的苗床,不及時清理的發(fā)病薯塊將成為下一年的侵染來源。盡管甘薯苗床病害發(fā)生嚴重,但未引起足夠的重視,且缺乏對該類病害的深入系統(tǒng)研究,相關(guān)的參考資料很少。

在系統(tǒng)進化樹中只列出大于60%的bootstrap值。

鐮刀菌的種類繁多,鑒定工作復(fù)雜,傳統(tǒng)的鐮刀菌分類鑒定主要以形態(tài)特征和生理生化指標作為主要依據(jù),但鐮刀菌對環(huán)境具有極強的適應(yīng)性,隨環(huán)境條件變化,其形態(tài)也會產(chǎn)生變化[16]。真菌的rDNA-ITS區(qū)具有豐富變異的特點,常常將這一可變區(qū)作為真菌菌種和分離物鑒定的可靠依據(jù)之一[17]。因此本研究結(jié)合傳統(tǒng)的植物病原形態(tài)鑒定方法和分子生物學(xué)技術(shù)對甘薯育苗床21個鐮刀病原菌株進行了鑒定,經(jīng)形態(tài)觀察,這些病原菌株均產(chǎn)生兩種類型的孢子,即大型鐮刀狀孢子及小型單胞或雙胞分生孢子。用PCR擴增其ITS序列,經(jīng)比對,這些病原菌為9株茄病鐮刀菌和12株尖孢鐮刀菌；其中尖孢鐮刀菌出現(xiàn)在2個組中,HNTY4單獨位于1組,其余11株位于另外1組。HNTY4與其他分離物間的一致率很低,今后可通過進一步鑒定其變種或小種的分類地位,及鑒定其對不同甘薯品種致病性的強弱,來明確其與其他分離物的區(qū)別。

[1] 馬代夫,劉慶昌.中國甘薯育種與產(chǎn)業(yè)化[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2005.

[2] Loebenstein G, Thottappilly G. The sweet potato [M]. New York: Springer Science Business Media B V, 2009: 9-103.

[3] 孫健,周波,鈕福祥,等.甘薯多糖國內(nèi)外研究進展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報,2016(8):90-93.

[4] 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所.中國農(nóng)作物病蟲害(第三版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2015:846-862.

[5] 李鵬,馬代夫,李強,等.甘薯根腐病的研究現(xiàn)狀和展望[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(1):114-116.

[6] Leslie J F, Summerell B A． TheFusariumlaboratory manual [M]． Iowa: Blackwell Publishing Professional, 2006: 121-278.

[7] Cianchetta A N, Davis R M.Fusariumwilt of cotton: management strategies [J]. Crop Protection, 2015, 73: 40-44.

[8] 李金花,王蒂,柴兆祥,等.甘肅省馬鈴薯鐮刀菌干腐病優(yōu)勢病原的分離鑒定[J].植物病理學(xué)報,2011,41(5):456-463.

[9] 方中達.植病研究方法[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1998.

[10] Lee S B, Taylor J W. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores [M]// Innis M A, Gelfand D H, Sninsky J J, et al. The PCR protocols: a guide to methods and applications. New York: New York Academic Press, 1990: 282-314.

[11] White T J, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [C]//Innis M A, Gelfand D H, Sninsky J J, et al. A guide to methods and application [M]. New York: Academic Press, 1990: 315-322.

[12] Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8): 1596-1599.

[13] Sanogo S, Zhang J. Resistance sources, resistance screening techniques and disease management forFusariumwilt in cotton [J]. Euphytica, 2016, 207(2): 255-271.

[14] 高曉敏,王琚鋼,馬立國,等.尖孢鐮刀菌致病機理和化感作用研究進展[J].微生物學(xué)通報,2014,41(10):2143-2148.

[15] Martyn R D.Fusariumwilt of watermelon: 120 years of research [J]. Horticultural Reviews, 2014, 42: 349-442.

[16] 張向民.鐮刀菌屬分類學(xué)研究歷史與現(xiàn)狀[J].菌物研究,2005,3(2):59-62.

[17] 劉春來,文景芝,楊明秀,等.rDNA-ITS在植物病原真菌分子檢測中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,38(1):101-106.

(責(zé)任編輯:黃榮華)

Molecular Detection and Analysis ofFusariumDiseases of Sweet Potato Seedlings in Seedbed

ZHANG Cheng-ling, ZHAO Yong-qiang, XIE Yi-ping*, SUN Hou-jun, YANG Dong-jing, XU Zhen

(Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area of Jiangsu / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Sweet Potato, Ministry of Agriculture, Xuzhou 221131, China)

The diseased sweet potato seedlings in seedbed were collected from Jiangsu, Henan and Hebei provinces, the pathogens were isolated by using tissue separation method, and the pathogenicFusariumspecies were identified through using morphological and molecular biological methods. A total of 21 pathogenic strains were separated and identified, and they all produced two types of conidium: the macroconidium was falcate with 3～5 septa; the microconidium was oval with 0～1 septum. The fragment size of rDNA internal transcribed space (rDNA-ITS) in these pathogenic strains was 544～568 bp, and the nucleotide concordance rate among them was 46.56%～100%. These pathogenic strains were divided into 3 groups in phylogenetic trees: group 1 included 9 isolates in this study, which were identified asF.solani; group 2 included 11 isolates in this study, which were identified asF.oxysporum; group 3 included only 2 isolates, namely HNTY4 (F.oxysporum) in this study and LN828191.

Sweet potato; Seedbed;Fusarium; Molecular detection

2016-11-24

江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK20140230);國家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系甘薯病蟲害崗位專家項目(CARS-11-B-09);江蘇省農(nóng) 業(yè)科技自主創(chuàng)新探索性項目[CX(13)5080]。

張成玲(1983─),女,山東沂源人,副研究員,博士,主要從事甘薯病蟲害研究。*通訊作者:謝逸萍。

S435.313

A

1001-8581(2017)04-0058-05