李淑娟,于 杰,高玉生,李曉玉,李 林

(煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東煙臺(tái) 264000)

HPLC-MSMS測(cè)定果蔬中有機(jī)磷類農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)

李淑娟,于 杰,高玉生,李曉玉,李 林

(煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東煙臺(tái) 264000)

利用提取后添加法定量分析高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MSMS)檢測(cè)24種有機(jī)磷農(nóng)藥時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)。用基質(zhì)效應(yīng)因子法分析了四種果蔬中基質(zhì)濃度對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響,并采用配制不含基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和含基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的方法,通過擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,比較斜率,從而評(píng)估果蔬的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,在四種果蔬中基質(zhì)效應(yīng)均隨著基質(zhì)濃度的增加而增大;具有基質(zhì)效應(yīng)的化合物其基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線基本保持線性,只是與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線相比斜率發(fā)生變化。

基質(zhì)效應(yīng),有機(jī)磷農(nóng)藥,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

有機(jī)磷農(nóng)藥是目前我國使用最廣、用量最大的一類農(nóng)藥[1-2]。隨著該類農(nóng)藥使用范圍的日益擴(kuò)大,其在環(huán)境和農(nóng)作物中的殘留對(duì)人類健康的危害日益受到關(guān)注,世界各國均制定了食品中有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留限量法規(guī)[3]。建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的測(cè)定蔬菜、水果中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法,對(duì)監(jiān)控農(nóng)藥的合理使用、保障人們身體健康具有重要意義。目前,果蔬中農(nóng)藥的多殘留測(cè)定方法有氣相色譜法(GC)[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[8-10]等。然而,這些方法在檢測(cè)過程中均存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)的存在嚴(yán)重影響著農(nóng)藥殘留定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確度[11-14],對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估,可指導(dǎo)方法改進(jìn)并采取有效的基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償措施,減少樣品的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)獲得準(zhǔn)確的結(jié)果至關(guān)重要。目前,國內(nèi)針對(duì)果蔬中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)研究主要集中在GC、GC-MS兩種常用的分析儀器上[15-18],而對(duì)在HPLC-MS/MS上進(jìn)行殘留分析的農(nóng)藥,其基質(zhì)效應(yīng)研究則相對(duì)較少[19-20]。

本文采用乙腈高速勻漿提取,固相萃取(SEP)凈化的前處理方法獲得了蘋果、草莓、菘菜、圓蔥四種樣品的空白基質(zhì),利用提取后添加法定量分析LC-ESI-MS/MS法檢測(cè)24種有機(jī)磷農(nóng)藥時(shí)的基質(zhì)效應(yīng),為提高檢測(cè)方法的可靠性、準(zhǔn)確分析檢測(cè)結(jié)果提供了有力的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋果、草莓 萊陽恒潤食品有限公司;菘菜、圓蔥 山東龍大食品集團(tuán)有限公司;四種果蔬 均為送檢陰性樣品；24種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer公司,純度大于99%;乙腈、甲苯、甲酸 色譜純;其他試劑 分析純;水 超純水。

表1 24種有機(jī)磷農(nóng)藥的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)

注:*,定量離子。

Agilent1200高效液相色譜儀、Agilent6410B三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國安捷倫公司,配電噴霧離子源(ESI);Buchi B-400均質(zhì)器、Buchi R-250旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Retsch公司;固相萃取裝置 美國Supelco公司;PestiCarb小柱(500 mg/6 mL)、NH2小柱(500 mg/3 mL) 美國Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)品,用丙酮配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃避光保存。根據(jù)需要用乙腈/水(1∶1)配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,避光4 ℃保存,備用。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別將樣品提取液用0.1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定容,得到基質(zhì)濃度分別為2、5、10、20 g/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 提取與凈化 綜合日本LCMSMS農(nóng)藥一齊分析法(I)和GB/T 20769-2008。準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品10 g(精確到0.0l g),加入50 g無水硫酸鈉和60 mL乙腈,于勻質(zhì)器上混勻1 min,無水硫酸鈉脫水后收集提取液。再用30 mL乙腈重復(fù)提取兩次,合并提取液,于40 ℃水浴減壓濃縮提取液至約2 mL,此溶液上樣于5 mL乙腈-甲苯(3∶1,v/v)活化后的PestiCarb/NH2串聯(lián)固相萃取小柱,以25 mL乙腈-甲苯(3∶1,v/v)洗脫目標(biāo)化合物,收集洗脫液,減壓濃縮后氮?dú)獯蹈?定容。

1.3 分析測(cè)定

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse C18柱(1.8 μm,3.0 mm×10 cm)。流動(dòng)相:0.1%甲酸水(A相)和乙腈(B相)。梯度洗脫程序:0～2 min,30% B～50%B;2～11 min,50% B～60%B;11～15 min,60% B～99% B;15～20 min,99% B;20.1～23 min,30% B;流速:0.4 mL/min。柱溫:50 ℃。進(jìn)樣量:5.0 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,正離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),電噴霧電壓:4000 V;干燥氣溫度:350 ℃。其它條件見表1。

2 結(jié)果與分析

圖1 24種有機(jī)磷農(nóng)藥在四種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)隨基質(zhì)濃度的變化趨Fig.1 The matrix effect factor of 24 organophosphorus pesticides with the change of sample concentration in four matrices注:24種化合物按保留時(shí)間先后順序排列。

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中被分析物以外的共流出組分對(duì)分析物的響應(yīng)值有干擾,從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。King[14]等發(fā)現(xiàn),基質(zhì)效應(yīng)由形成帶電霧滴時(shí)非揮發(fā)性的基質(zhì)組分與分析物離子競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)生,這些非揮發(fā)性基質(zhì)組分將霧滴牢牢吸在一起,阻止其分裂成更小的液滴。根據(jù)接口處離子化和離子蒸發(fā)過程中的變化情況,這種競(jìng)爭(zhēng)可能增強(qiáng)(離子增強(qiáng))或妨礙(離子抑制)所分析目標(biāo)物離子的形成效能。

2.1 基質(zhì)濃度對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

本文利用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的目標(biāo)物響應(yīng)值(Cm)和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液中的目標(biāo)物響應(yīng)值(Cs)的比值,得到基質(zhì)效應(yīng)因子(MEF),進(jìn)而考察基質(zhì)種類和濃度對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響程度,MEF大于1表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),小于1表示基質(zhì)抑制效應(yīng)。圖1為樣品基質(zhì)濃度分別為2、5、10、20 g/mL時(shí),24種有機(jī)磷農(nóng)藥在蘋果、草莓、菘菜、圓蔥4種樣品中的基質(zhì)效應(yīng)大小及其隨樣品濃度的變化趨勢(shì),24種有機(jī)磷農(nóng)藥以反相色譜出峰順序排列,極性強(qiáng)的化合物最先出峰。

從圖1可以看出在考察的基質(zhì)濃度范圍內(nèi),四種基質(zhì)對(duì)24種農(nóng)藥大部分表現(xiàn)為抑制效應(yīng),極少數(shù)表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),且每種農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)隨基質(zhì)濃度的變化趨勢(shì)基本一致,即隨著基質(zhì)濃度的增加基質(zhì)效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。在四種基質(zhì)中甲胺磷、乙酰甲胺磷和氧化樂果等極性強(qiáng)的農(nóng)藥在基質(zhì)濃度為5 g/mL時(shí)即表現(xiàn)出很強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng),且隨基質(zhì)濃度的增加,抑制效應(yīng)更加明顯,當(dāng)基質(zhì)濃度增加到20 g/mL時(shí),在蘋果和草莓這種高糖類基質(zhì)中,甲胺磷、乙酰甲胺磷的基質(zhì)抑制因子為0.3左右;在菘菜這種色素和纖維素較多的葉菜類基質(zhì)及辛辣基質(zhì)圓蔥中,甲胺磷、乙酰甲胺磷和氧化樂果的基質(zhì)抑制因子為0.4左右;均表現(xiàn)出了極強(qiáng)的抑制效應(yīng)。保留時(shí)間在2.0 min以后的化合物,除圓蔥中保棉磷和亞胺硫磷外,在基質(zhì)濃度小于10 g/mL時(shí)其基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)較小,但多數(shù)化合物隨著基質(zhì)濃度增加,抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。綜合圖1可知隨著保留時(shí)間的增加和農(nóng)藥分子量的增大,四種基質(zhì)的抑制效應(yīng)受基質(zhì)濃度的影響逐漸減小,可見基質(zhì)效應(yīng)受基質(zhì)濃度影響較強(qiáng)的有機(jī)磷農(nóng)藥主要是極性相對(duì)較大的化合物。

表2 10種化合物的溶劑線性方程及基質(zhì)線性方程斜率比值

注:R斜率=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品線性斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)品線性斜率;ΔR:各種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)線性與溶劑標(biāo)準(zhǔn)線性的斜率比值的極差。

圖2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析四種樣品基質(zhì)對(duì)農(nóng)藥線性曲線的影響Fig.2 The effect of four kinds of matrix on the linear carve of organophosphorus pesticides by HPLC-MSMS注:圖中溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

基質(zhì)效應(yīng)的存在使得在實(shí)際的農(nóng)藥殘留檢測(cè)過程中,當(dāng)使用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校準(zhǔn)時(shí),常常會(huì)引起分析結(jié)果的偏差和對(duì)樣品制備過程回收率的錯(cuò)誤估算。對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)不明顯的化合物,基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)品曲線基本重合,因此本實(shí)驗(yàn)選取了10種具有代表性的化合物,采用配制不含基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和含基質(zhì)(濃度10 g/mL)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的方法,通過擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,比較斜率,從而評(píng)估不同果蔬的基質(zhì)效應(yīng)(圖2)。表2中列出了四種基質(zhì)中基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值。斜率的比值能比較直觀的反映出由于基質(zhì)參與引起的標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)值的變化,斜率極差反映了同一種化合物在不同基質(zhì)中所建立的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的離散程度(見表2)。極差大表明該化合物在定量分析時(shí)受分析樣品種類影響較大;極差小表明這些化合物基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定且受樣品種類影響較小。

由圖2可以看出,具有基質(zhì)效應(yīng)的化合物其基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線基本保持線性,只是與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線相比斜率發(fā)生變化。蘋果和草莓屬于高糖類水果,菘菜中含有較多的葉綠素,而圓蔥屬于辛辣性樣品,基質(zhì)中含有較多的硫化物[21],因此四種樣品提取液中均含有基質(zhì)干擾,從而影響目標(biāo)化合物的離子化效率,進(jìn)而影響了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。從表2中ΔR的數(shù)值可以看出,在實(shí)驗(yàn)選取的10種化合物中,甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果和久效磷這幾種化合物的基質(zhì)效應(yīng)受基質(zhì)種類的影響較大;其它幾種化合物的基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)比較穩(wěn)定即受基質(zhì)種類的影響較小。對(duì)于國標(biāo)[10]檢測(cè)方法中(基質(zhì)濃度10 g/mL)基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)的甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化樂果和久效磷等化合物,其溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)校準(zhǔn)曲線的斜率差距較大,為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,在實(shí)際操作過程中建議用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

3 結(jié)論

在LC-MS/MS定量分析過程中基質(zhì)效應(yīng)客觀存在,基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱不僅與農(nóng)藥化合物本身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān),還與其基質(zhì)本身的營養(yǎng)成分和化學(xué)結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系。由于基質(zhì)效應(yīng)的復(fù)雜性,在實(shí)際的分析檢測(cè)過程中很難找到一種統(tǒng)一的方法來抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響。本文分析了四種基質(zhì)的基質(zhì)種類和濃度對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響,通過對(duì)基質(zhì)校準(zhǔn)曲線和溶劑校準(zhǔn)曲線的比較,基質(zhì)校準(zhǔn)曲線可以在實(shí)際分析檢測(cè)中對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。在實(shí)際檢測(cè)工作中,對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)的化合物,最好對(duì)基質(zhì)進(jìn)行分類檢測(cè),即對(duì)每類基質(zhì)做一個(gè)基質(zhì)標(biāo)樣,這樣能大大減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾,更好地保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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Matrix effect of multiple organophosphorus pesticide residues detection in fruits and vegetables by HPLC-MSMS

LI Shu-juan,YU Jie,GAO Yu-sheng,LI Xiao-yu,LI Lin

(Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yantai 264000,China)

Quantitative analysis the matrix effects of 24 organophosphorus pesticides using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry by post-extraction spiking method. Effect of matrix concentration on the matrix effect in fruits and vegetables was analyzed by matrix effect factor method. A comparison was made between the standard working curves by using standard solutions of the organophosphorus pesticides with and without addition of sample matrixes,and the matrix effects were evaluated on the base of the experimental data and values of slope ratios obtained.It was suggested that standard working curves with addition of sample matrixes was used to quantitative analysis for pesticides with strong matrix effects. As a result,the matrix effects increased with the increase of the concentration of the sample matrixes in fruits and vegetables. The matrix standard curve of the compounds with matrix effect remained linear,but the slope changes compared with the standard curve of the solvent.

matrix effect;organophosphorus pesticide;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MSMS)

2016-09-19

李淑娟(1982-)，女，碩士研究生，工程師，研究方向：食品檢測(cè)與農(nóng)藥殘留分析，E-mail：lsj_1028@163.com。

山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目(SK 201353)；國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2015IK201)。

TS207.5+3

A

1002-0306(2017)06-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.001