陳佳妮

清華大學(xué)附屬中學(xué)，北京 100084

水資源已經(jīng)變得越來越稀有，而人類大量地使用水資源又產(chǎn)生了大量的廢水。比如 2013年某市廢水排放量為15.5317億m3，日廢水排放量為426萬t[1]，每天需要對大量的廢水進行處理。

污泥是污水處理的產(chǎn)物。我國污水處理廠在逐年增加，相應(yīng)的污泥產(chǎn)量也越來越多。一般來說，如果一座污水處理廠日污水處理量為10萬t，則會產(chǎn)生 100 t的濕污泥[1]。北京市日廢水排放量為426萬t[1]，則日產(chǎn)生污泥4260 t。國外研究經(jīng)驗顯示，活性污泥處理常占污水處理總成本的一半以上，目前國內(nèi)外主要通過焚燒、填埋、厭氧消化處理，在需高投入處理的同時還不可避免地對環(huán)境產(chǎn)生危害。如何把污泥變廢為寶是保護環(huán)境和可持續(xù)發(fā)展的重要課題。

污泥主要由微生物組成，可以通過高溫加熱裂解微生物細(xì)胞釋放出許多營養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、核苷酸、單糖和維生素等以及它們的聚合物，比如蛋白質(zhì)、DNA、RNA及其多糖等。這些營養(yǎng)物可以被微生物 (細(xì)菌) 再利用用于生長。微生物如果能用這些污泥熱裂解營養(yǎng)物來發(fā)酵生長，實現(xiàn)微生物制造，將為日益增加的污泥提供一個資源化的解決方案[2-3]。

目前，已有的處理污泥的研究主要是利用這些污泥熱裂解營養(yǎng)物來發(fā)酵生產(chǎn)沼氣[4]。但是由于經(jīng)濟性不好，并沒有得到很好的普及。是否還有其他的微生物發(fā)酵產(chǎn)品可以利用這些污泥熱裂解的營養(yǎng)物來制造？

圖 1 細(xì)菌大量積累 PHA生物塑料成為細(xì)胞內(nèi)含體(左圖)，其分子結(jié)構(gòu) (右圖)[5]Fig.1 Bacterial cells accumulated a large number of PHA particles as inclusion body (left) and its molecular structure (right)[5]. The PHA structure is diverse due to the change of R group. Poly-3-hydroxybutyrate (PHB) is the most representative PHA.

很早以前，微生物就被發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生一些類似塑料、結(jié)構(gòu)多樣的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，稱為“聚羥基脂肪酸酯” (Polyhydroxyalkanoates，簡稱 PHA)(圖 1)[5]。PHA又被稱為生物塑料，它來源于生物，可以被無處不在的微生物作為食物吃掉而消失 (稱為生物可降解性)。人們一直在努力嘗試用環(huán)境友好的生物塑料 PHA來取代不可降解的石油基塑料，如聚乙烯PE和聚丙烯PP等，以減少白色污染。但是，由于 PHA的生產(chǎn)需要細(xì)菌生長在昂貴的培養(yǎng)基 (如淀粉、氨基酸和維生素等營養(yǎng)源) 中，導(dǎo)致 PHA生產(chǎn)成本很高，至今尚未能大規(guī)模地生產(chǎn)和應(yīng)用，無法完成替代石油塑料的使命，也無法實現(xiàn)環(huán)保的理想[6]。

是否能夠在廉價的活性污泥與昂貴的 PHA之間建立起橋梁，變廢為寶呢？污泥熱裂解營養(yǎng)物可能含有微生物生長所需要的營養(yǎng)元素。如果能作為營養(yǎng)源來培養(yǎng)微生物使之生產(chǎn)PHA，則在很大程度上解決了利用昂貴的培養(yǎng)基來制造生物塑料的問題，有可能降低 PHA的制造成本，從而提高其經(jīng)濟性。

首先，要研究如何將活性污泥轉(zhuǎn)化成微生物容易利用的成分，排水公司常用的辦法之一是污泥熱裂解技術(shù)。但是，污泥熱裂解營養(yǎng)物成分復(fù)雜，可能含有不利于微生物生長的有毒物質(zhì)。實際中，還需要不同的微生物協(xié)同作用，才能實現(xiàn)活性污泥營養(yǎng)成分的充分消化。早期的研究工作發(fā)現(xiàn)，厭氧條件下混合微生物菌群在活性污泥中會積累占細(xì)胞干重20%左右的PHB，而在微氧/好氧工藝條件下PHB含量可以達到62%[7]，但這結(jié)果遠(yuǎn)低于使用單一組分培養(yǎng)單一菌種的80%以上的PHB含量[4]，而且混合菌群細(xì)胞密度(細(xì)胞干重CDW) 都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單一菌株，所以利用活性污泥進行生物塑料 PHB的生產(chǎn)研究停滯不前[8]。

為了實現(xiàn)單一菌株的高效轉(zhuǎn)化，就需要尋找生命力強大的單一菌株“微生物工廠”。在自然界中，極端環(huán)境下生長的微生物有可能肩負(fù)起這個重任，消化這些復(fù)雜的污泥熱裂解營養(yǎng)物[9]。于是，我們利用從具有極端環(huán)境的新疆艾丁湖的鹽湖 (日夜溫差50 ℃, 鹽濃度200 g/L，pH>9) 采集的土樣，分離得到能生產(chǎn) PHA的一些細(xì)菌。通過進一步的培養(yǎng)和篩選，找到了嗜鹽單胞菌CJN (HalomonasCJN)，希望這個“微生物工廠”能夠?qū)崿F(xiàn)利用污泥熱裂解營養(yǎng)物制造生物可降解塑料PHA的使命。

本研究致力于尋找可以利用活性污泥進行發(fā)酵生產(chǎn)的“微生物工廠” (菌株)，通過篩選找到了嗜鹽單胞菌，將其命名為HalomonasCJN。進一步探究其利用污泥熱裂解營養(yǎng)物生產(chǎn)生物可降解塑料 PHA的模式材料——PHB (Poly-3-hydroxybutyrate) 的可能性 (圖 2)，為解決污泥處理成本高的問題開創(chuàng)出一條可行有利的新出路，也為生產(chǎn)生物可降解塑料尋找到更經(jīng)濟實用的原料。這將為今后生物塑料大規(guī)模地替代不可降解的石油塑料提供一個環(huán)境友好的方案，也為污泥的資源化利用提供新的出路。

1　材料與方法

1.1　菌株篩選

稱取1 g從新疆艾丁湖采回來的土樣，懸浮于20 mL含有9%的 NaCl生理鹽水中。然后激烈振蕩試管中的懸浮液6 min。取1 mL上清液，均勻涂布于固體培養(yǎng)基 (污泥熱裂解液離心上清＋20 g/L葡萄糖＋15 g/L瓊脂) 中。37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察和挑取最大的白色不透明菌落。

圖2　利用活性污泥生產(chǎn)生物塑料的過程Fig. 2 The PHB production process using activated sludge.

本實驗分離得到了一株嗜鹽嗜堿的鹽單胞菌，命名為HalomonasCJN，該菌株可以在30?45 ℃的溫度下，在污泥熱裂解液添加葡萄糖，或者廉價的化肥和淀粉水解物葡萄糖中快速生長，最適溫度為 37 ℃，pH耐受范圍為5.0?11.0，最適pH為9.0，可耐受的NaCl濃度為10?250 g/L，最適為60 g/L。當(dāng)把生長條件固定在 37 ℃、pH 8.6?9.0、NaCl濃度為 40?60 g/L時，HalomonasCJN可以在上述低成本培養(yǎng)基中進行無滅菌連續(xù)發(fā)酵，節(jié)省了高溫高壓的蒸汽制造成本，減少了無菌操作的復(fù)雜過程，從而降低了PHA (本研究用PHA的模式材料PHB作為對象來研究) 的生產(chǎn)成本。

1.2　讓活性污泥能夠被“微生物工廠”利用——污泥熱裂解

污泥取自北京排水集團 (簡稱北排) 污水處理池，污泥中含有豐富的有機營養(yǎng)成分，體現(xiàn)為很高的 Biological oxygen demand (BOD)和 Chemical oxygen demand (COD)，極有可能成為優(yōu)質(zhì)的碳、氮、磷元素的來源。但由于大分子的有機物不能為“微生物工廠”直接利用，所以首先要想辦法變成小分子。由于熱裂解技術(shù)比較成熟而且簡單易行，所以首選這種成熟工藝來處理活性污泥。采用熱裂解技術(shù) (Thermal hydrolysis pre-treatment，THP) 在 155?170 ℃高溫的高壓蒸汽下對污泥進行數(shù)分鐘的熱裂解，使污泥中的微生物細(xì)胞溶解，胞外產(chǎn)物釋放，細(xì)胞聚合物 (包括蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA和脂肪等) 分解為氨基酸、單糖、核苷酸和脂肪酸酯等，這樣產(chǎn)生污染的污泥變成了營養(yǎng)豐富的小分子混合物。同時，高溫處理也去除了污泥中其他的微生物，使污泥成為適合培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)源。

1.3　培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

配置不同濃度的污泥熱裂解液，通過對照實驗來摸索最合適的實驗條件。本實驗用于活化菌種HalomonasCJN及其種子液的培養(yǎng)基為60LB培養(yǎng)基 (含60 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物，10 g/L胰蛋白胨)。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為添加 60 g/L NaCl的礦物鹽培養(yǎng)基 (簡稱 60MM)，主要由 0.1%(NH4)2SO4、0.02% MgSO4、1.0% Na2HPO4·12H2O、0.15% KH2PO4、60 g/L NaCl和30 g/L葡萄糖組成。將過夜活化培養(yǎng)的種子液以 5%接種量接種于50 mL礦物鹽培養(yǎng)基中 (500 mL搖瓶)，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)48 h。然后搖床200 r/min培養(yǎng)微生物，分析細(xì)胞的生長狀況 (細(xì)胞干重，Cell Dry Weight, 簡稱CDW) 和生物塑料PHB的細(xì)胞含量。實驗組利用污泥熱裂解液上清，設(shè)置100%、50%、10%和1%濃度梯度，不加酵母膏提取物，其余條件與對照組相同。

1.4　通過細(xì)胞干重和PHB含量分析確定實驗效果

為了驗證“微生物工廠”HalomonasCJN 將活性污泥轉(zhuǎn)化成PHB的能力，選取細(xì)胞干重和PHB含量這兩個重要指標(biāo)進行分析，從而確定實驗效果。

細(xì)胞干重分析：培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液以10000 r/min離心10 min，收集菌體。隨后，用去離子水洗滌1次，并再次離心收集細(xì)胞沉淀。將得到的細(xì)胞沉淀置于–80 ℃冰箱預(yù)冷1 h后，置于真空冷凍干燥機內(nèi)12 h完全去除水分。利用精密天平測定細(xì)胞干重 (Cell dry weight, CDW)[10]。

PHB含量分析：PHB酯化液的配制：色譜純甲醇中，含3% (V/V) 濃硫酸和0.5 g/L的苯甲酸，總體積為500 mL。稱取30?40 mg冷凍干燥后的菌體約10 mg已知PHB標(biāo)樣于耐高溫的酯化管中，加入2 mL三氯甲烷與2 mL酯化液，加蓋密封后于100 ℃條件下反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，待冷卻至室溫，加入1 mL去離子水，充分振蕩，靜置，直至有機相與水相完全分層。取下層有機相用于氣相色譜分析。用島津公司 (日本) 的GC-2014型氣相色譜儀進行分析。使用HP-5型號的色譜毛細(xì)管柱，其規(guī)格為：長 30 m，內(nèi)徑320 μm、內(nèi)含250 nm厚的5%苯基-9%二甲基聚硅氧烷作為固定相。檢測器為氫火焰離子化檢測器 (Flame ionization detector, FID)，進樣口為SPL分流進樣口。載氣為高純氮氣，燃?xì)馀c助燃?xì)夥謩e為氫氣和空氣。用注射器抽取酯化管內(nèi)的有機相于樣品瓶內(nèi)，置于樣品池，使用AOC-20S型自動進樣器進樣。以丙酮為洗滌試劑，在每次進樣前洗滌3次，再用待測樣品潤洗[11]。

2　結(jié)果與分析

2.1　污泥熱裂解后氮磷元素及有機酸含量大幅提高

對北排提供的污泥進行熱裂解前后的上清液主要營養(yǎng)元素分析 (感謝北排常菁博士提供的數(shù)據(jù))，發(fā)現(xiàn)熱裂解后的污泥上清液中氮磷元素以及揮發(fā)性有機酸 (Volatile fatty acids, VFA) 的含量都大幅度地增加 (表 1)。顯然熱裂解污泥的上清液對微生物的生長至少可以提供碳源 (來自VFAs)、氮源和磷源，這對微生物生長是有利的，它至少可以作為微生物生長的添加劑。

表1　北京排水集團污水廠污泥熱裂解前后污泥上清液成分的比較Table 1 Comparison of the sludge supernatant after thermal treatments

2.2　污泥熱裂解的上清液可以作為微生物培養(yǎng)基添加成分

2.2.1　污泥熱裂解液濃度對嗜鹽單胞菌Halomonas CJN生長的影響

因為污水處理得到剩余污泥隨批次不同成分可能會有波動，因此取兩批不同時間段的污泥熱裂解液a與b，離心獲得上清液，進行HalomonasCJN的搖瓶發(fā)酵生長實驗。

設(shè)計兩組對照試驗，對照組一為正常沒有加污泥熱裂解液的礦物培養(yǎng)基 (60MM) 組，對照組二為添加了1 g/L酵母膏提取物 (Yeast extract)(以提供氨基酸和維生素等生長因子，稱為60MM1gY)。實驗組利用污泥熱裂解液上清，設(shè)置100%、50%、10%和1%濃度梯度，不加酵母膏提取物，其余條件與對照組相同。

結(jié)果表明兩批污泥熱裂解液得到的細(xì)胞干重有差距，都對嗜鹽單胞菌生長和 PHB有影響(圖 3)。對照組一 60MM 使細(xì)胞生長到約 7 g/L細(xì)胞干重并生產(chǎn)了占細(xì)胞干重65%的PHB，對照組二60MM1gY使細(xì)胞長到11 g/L并生產(chǎn)了占細(xì)胞干重 72%的 PHB。污泥熱裂解液實驗組(Sludge waste, 縮寫為SW) 方面，可以看出50%的兩種污泥熱裂解液SWa-50%和SWb-50%均使細(xì)胞長到約13 g/L，含有占細(xì)胞干重40%?60%的PHB，PHB的生產(chǎn)還有很大提高空間。100%的兩種污泥熱裂解液SWa-100%和SWb-100%使細(xì)胞分別長到約13和14 g/L，分別生產(chǎn)了20%和40%的PHB，PHB的生產(chǎn)具有更大提高空間。10%的兩種污泥熱裂解液仍然對細(xì)胞生長有影響，SWa-10%與對照組相比無論生長還是 PHB含量都處于劣勢，SWb-10%結(jié)果與對照組MM1gY相比結(jié)果相似，說明SWb-10%可以作為酵母膏使用。而 1%的兩種污泥熱裂解液對細(xì)胞生長和PHB合成沒有影響 (圖3)。

圖 3 不同濃度的兩種污泥熱裂解液對 Halomonas CJN細(xì)胞生長和PHB生產(chǎn)的影響Fig. 3 Effects of two thermally treated activated sludge on the cell growth and PHB production by Halomonas CJN grown on different concentrations. 5% (V/V)overnight cultures were inoculated in 50 mL 60MM in 500 mL flasks. 37 ℃ 200 r/min for 48 h. The thermally treated activated sludges SWa or SWb were added to 60MM medium at different concentrations. Error bars are s (n=3).

2.2.2　污泥熱裂解液作為酵母膏和氮磷礦物元素取代物培養(yǎng)Halomonas CJN

實驗結(jié)果顯示，HalomonasCJN 在 60MM培養(yǎng)基培養(yǎng)時能長到7 g/L干重，而加入污泥熱裂解液的 60MM 培養(yǎng)基在相同條件下細(xì)胞生長達到13 g/L，幾乎提高了1倍 (圖3)。因此我們設(shè)計單一變量搖瓶發(fā)酵實驗，驗證利用污泥熱裂解液培養(yǎng)HalomonasCJN是否可以替代60MM培養(yǎng)基中氮、磷、礦物元素和葡萄糖。

在60MM培養(yǎng)基添加30 g/L葡萄糖條件下，細(xì)胞干重達到 8.5 g/L。當(dāng)在上述 60MM 添加30 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中加入不同濃度污泥熱裂解液時，HalomonasCJN細(xì)胞干重可以達到12、13、14 g/L (圖4左邊淺灰色柱狀圖)，說明污泥熱裂解液可以完全取代昂貴的酵母膏。

圖 4 污泥熱裂解液取代酵母膏、糖、或氮磷和微量元素對細(xì)胞生長的影響Fig. 4 Detection of the cell growth when the thermally treated activated sludge replaced some medium components, including yeast extract, glucose, nitrogen,phosphorus and trace elements. 5% (V/V) overnight cultures were inoculated in 50 mL 60MM in 500 mL flasks. 37 ℃ 200 r/min for 48 h. The thermally treated activated sludge SW was added to 60MM medium at different concentrations. Error bars are s (n=3). 60MM(Black pillars): glucose was removed from the mineral medium. 30G: 30 g/L glucose. 60NaCl＋30G-TE: 60 g/L NaCl+30 g/L glucose without trace elements.

在不添加葡萄糖的條件下，60MM培養(yǎng)基添加污泥熱裂解液只能使細(xì)胞干重達到1?3 g/L，說明污泥熱裂解液提供的碳源不夠支持細(xì)胞生長 (圖4中間黑色柱狀圖)。當(dāng)以去除氮、磷及礦物元素的 MM 培養(yǎng)基污泥熱裂解液作為培養(yǎng)基時，可以達到與60MM培養(yǎng)基相同的細(xì)胞干重，即8.5?10 g/L (圖4右邊灰色柱狀圖)。這說明若在此基礎(chǔ)上培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)PHB，可以用污泥熱裂解液完全取代酵母，也還可以僅添加葡萄糖作為碳源來進行搖瓶發(fā)酵實驗 (圖3)。

2.2.3　污泥熱裂解液培養(yǎng)嗜鹽單胞菌 Halomonas CJN的氮磷元素消耗

由于污泥熱裂解液含大量氮磷元素 (表1)，實驗結(jié)果表明一定程度上可以減少氮磷及礦物元素的添加 (圖3和4)，因此利用其培養(yǎng)HalomonasCJN也可以實現(xiàn)生物除氮減磷。實驗將只添加葡萄糖作為碳源的污泥熱裂解液培養(yǎng)基與 60MM培養(yǎng)基作為對照，分別測量實驗前后培養(yǎng)基液體的氮磷元素等含量，結(jié)果表明用污泥熱裂解液作為培養(yǎng)基48 h培養(yǎng)HalomonasCJN消耗其中大部分氮磷元素，總氮減少一半，總磷只有發(fā)酵前的 1/4。降低培養(yǎng)基成本的同時有除磷減氮的作用 (表 2)。

2.2.4　 Halomonas CJN在污泥熱裂解液中生產(chǎn)PHB

污泥熱裂解液含有豐富的氮磷源，可以作為培養(yǎng)基成分，減少發(fā)酵添加成分的成本 (表1和 2)。搖瓶發(fā)酵實驗證明用污泥熱裂解液完全取代含氮、磷、硫和微量元素以及酵母膏是成功的，細(xì)胞干重可以長到約7 g/L，與60MM培養(yǎng)基幾乎完全一樣。然而，PHB含量只能達到28%細(xì)胞干重，低于60MM培養(yǎng)基中PHB含量的70% (圖5)。表明用污泥熱裂解液可以促進細(xì)胞的生長，同時給PHB的積累留有很大的提升空間。進一步的PHB含量提高可以通過過表達PHB合成基因來實現(xiàn)。

2.3　利用污泥熱裂解液厭氧發(fā)酵獲得的乙酸取代葡萄糖作為碳源培養(yǎng)Halomonas CJN 生產(chǎn)PHB

污泥熱裂解液中含大量碳化合物，不能被HalomonasCJN 作為碳源利用 (圖4中間黑色柱狀圖)，只能成為剩余COD作為廢水成分排出。針對這個問題，進一步探究是否能將這些碳化合物轉(zhuǎn)化成“微生物工廠”能夠利用的成分。

表 2 污泥熱裂解液作為氮磷源發(fā)酵前后濾液組分變化Table 2 Analysis of the supernatants of sludge components before and after fermentations

圖5　污泥熱裂解液培養(yǎng)Halomonas CJN生產(chǎn)PHBFig. 5 PHB production by Halomonas CJN cultured in media containing thermally treated activated sludge. 5%(V/V) overnight cultures were inoculated in 50 mL 60MM in 500 mL flasks. 37 ℃, 200 r/min for 48 h.Error bars are s (n=3). 30G: 30 g/L glucose. SW: sludge waste.

北京排水集團提出厭氧發(fā)酵可能是最簡單易行的途徑，可以將大量污泥熱裂解液中的碳化合物轉(zhuǎn)化為乙酸為主的有機酸，濃度最高可達15 g/L，由此獲得的乙酸比葡萄糖廉價。在前人的實驗中已經(jīng)證明乙酸能夠較好地被微生物利用[12]，于是本研究嘗試以乙酸取代葡萄糖作為碳源培養(yǎng)HalomonasCJN。實驗設(shè)置在污泥熱裂解液中的乙酸濃度為 5、10、15 g/L，獲得了較好的實驗結(jié)果 (圖6)。

實驗結(jié)果表明：當(dāng)用污泥熱裂解液加乙酸作為碳源時，HalomonasCJN細(xì)胞生長干重隨著乙酸濃度的增加而增加，當(dāng)乙酸濃度達到 15 g/L時，細(xì)胞干重可以達到約9 g/L，與30 g/L葡萄糖時的細(xì)胞干重10 g/L接近。說明乙酸可以促進HalomonasCJN生長。然而乙酸對PHB的生產(chǎn)促進作用較弱，只能達到 20%，不及葡萄糖的65%?70% (圖6)。結(jié)果表明，乙酸可以促進細(xì)胞生長，但并沒有促進 PHB的生產(chǎn)，而葡萄糖對PHB生產(chǎn)更有利。

實驗結(jié)果表明，葡萄糖仍然比乙酸對細(xì)胞的生長和 PHB的生產(chǎn)更好。雖然乙酸與葡萄糖一起作為碳源有利于提高 PHB生產(chǎn)，但是乙酸與葡萄糖共培養(yǎng)只能把PHB生產(chǎn)提高到40%，遠(yuǎn)低于單獨葡萄糖時達到的70%?80% (圖7)。如果需要進一步提升 PHB的生產(chǎn)率，下一步的工作將是通過在“微生物工廠”HalomonasCJN里構(gòu)建PHB合成的附加代謝路徑，提高乙酸作為廉價碳源的轉(zhuǎn)化率，使乙酸作為單一碳源不但能促進細(xì)胞生長，而且能提高PHB的積累量。

圖6　乙酸作為碳源在污泥熱裂解液中對Halomonas CJN生長及PHB生產(chǎn)的影響Fig. 6 PHB production and growth of Halomonas CJN inoculated on acetic acid as a carbon source. 5% (V/V)overnight cultures were inoculated in 50 mL 60MM in 500 mL flasks. 37 ℃, 200 r/min for 48 h. Error bars are s(n=3). 30G: 30 g/L glucose. 1Y: 1 g/L yeast extract. 60SW:sludge waste was added to 60MM medium. 5A: 5 g/L acetic acid. 10A: 10 g/L acetic acid. 15A: 15 g/L acetic acid.

圖7　乙酸與葡萄糖混合碳源對Halomonas CJN生長及PHB生產(chǎn)的影響Fig. 7 Growth and PHB production by Halomonas CJN inoculated on acetic acid and glucose mixture as the carbon sources. 5% (V/V) overnight cultures were inoculated in 50 mL 60MM in 500 mL flasks. 37 ℃,200 r/min for 48 h. Error bars are s (n=3). 30G: 30 g/L glucose. 1Y: 1 g/L yeast extract. 60SW: sludge waste was added to 60MM medium. 30A: 30 g/L acetic acid.15A: 15 g/L acetic acid.

3　討論

本研究把廢水處理產(chǎn)生的污泥通過熱裂解轉(zhuǎn)化為培養(yǎng)細(xì)胞HalomonasCJN 的營養(yǎng)源 (表 1)來生產(chǎn)生物塑料聚-3-羥基丁酸酯PHB (圖3?7)，減少了污泥帶來的污染，實現(xiàn)了變廢為寶的目標(biāo)，而且還降低了生物塑料PHB的制造成本，做到一舉三得。

本研究首先通過測量熱裂解產(chǎn)生的水解液上清，發(fā)現(xiàn)了豐富的氮磷源 (表1)。通過菌種篩選，找到了“微生物工廠”HalomonasCJN，然后在污泥熱裂解液中進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中的氮磷源都被消耗大半 (表2)，進一步證明了污泥熱裂解液可以取代培養(yǎng)微生物所需的基本氮磷源，可以節(jié)省這一部分的成本。同時，為了促進微生物生長所加入的昂貴的酵母提取物 (酵母膏) 以及微量元素也可以被污泥熱裂解液所取代 (圖4)，進一步降低了PHB的生產(chǎn)成本。這一部分的成本，最保守的估計節(jié)省了1500元/t PHB (氮磷源＋微量元素約800元/t PHB，酵母膏約700元/t PHB)(數(shù)據(jù)來源于PHA生產(chǎn)商藍(lán)晶公司)。

另一方面，污泥熱裂解液主要是促進了微生物的生長提升細(xì)胞干重，對促進 PHB積累作用不大 (圖 3和圖 5)。但是，低積累的“微生物工廠”HalomonasCJN還是有進一步提高PHB積累的潛能。這一部分今后可以通過代謝工程和合成生物學(xué)等手段，在微生物中構(gòu)建附加的 PHB強合成代謝通路的方法，使HalomonasCJN在污泥熱裂解液不但能很好地生長，還能很好地生產(chǎn)生物塑料PHB[13]。

本研究試圖利用污泥熱裂解液本身所具有的碳源來取代葡萄糖支持微生物的生長。但發(fā)現(xiàn)污泥熱裂解液含有的碳源不能被“微生物工廠”HalomonasCJN所利用 (圖3)。于是，委托北京排水集團通過厭氧發(fā)酵把污泥熱裂解液含有的碳源轉(zhuǎn)化為“微生物工廠”HalomonasCJN能利用的乙酸 (圖6)，而相應(yīng)減少葡萄糖的用量，這樣的替代可再降低 PHB的生產(chǎn)成本。然而發(fā)現(xiàn)乙酸能支持細(xì)胞的生長，卻不支持 PHB產(chǎn)量的提升。

為此，通過把有利于生產(chǎn) PHB的較為昂貴的葡萄糖和有利于細(xì)胞生長的來源于污泥熱裂解液的乙酸混合起來，作為混合碳源進行實驗，發(fā)現(xiàn) PHB含量稍有提高，但仍然不如葡萄糖好(圖 7)。因此，需要尋找乙酸作為單一碳源的新思路。

所以，下一步關(guān)鍵在于乙酸為單一碳源的污泥熱裂解液中高效生產(chǎn)PHB，于是探索代謝路徑將成為下一步研究的重要方向[13]。

從經(jīng)濟性角度分析，這一項創(chuàng)新的工藝能減少葡萄糖作為原料的成本至少8500元，減少上面污泥熱裂解液取代酵母膏、氮磷源和微量元素的成本1500元，總共可以節(jié)省約10000元的PHB制造成本，使PHB從現(xiàn)在的30000元/t變成20000元/t (數(shù)據(jù)來源于PHA生產(chǎn)商藍(lán)晶微生物科技有限公司)，這樣使得生物塑料的競爭力進一步加強。

本研究為廢水處理產(chǎn)生的大量活性污泥提供了一條新的廢物資源化利用道路，對未來降低微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物塑料 PHA的成本提供了可能性。另一方面，嗜鹽單胞菌在剩余污泥熱裂解液中培養(yǎng)對氮磷元素的消耗為廢水處理除磷減氮減少了成本。同時，本次研究利用單一菌種在活性污泥中發(fā)酵是一種創(chuàng)新，具有可操作性強的優(yōu)勢。前人進行的混合菌群培養(yǎng)生產(chǎn) PHA由于其不可控性，細(xì)胞密度很低，沒有可開發(fā)性[14]。而HalomonasCJN為PHA積累提供了較大的可增長空間。不得不提的是，實驗培養(yǎng)嗜鹽單胞菌所需高鹽濃度在后期也需污水廠進行稀釋處理，因此下一步研究方向是通過對菌體進行誘變篩選，改造降低正常生長所需的高鹽濃度，同時通過構(gòu)建附加PHB代謝通路嘗試增加PHB積累量。

生命力強大的“微生物工廠”HalomonasCJN除了可以在高鹽高堿等條件下利用成分復(fù)雜的污泥熱裂解營養(yǎng)物生產(chǎn) PHA外，還具有以下好處：1) 單一菌種培養(yǎng)更容易調(diào)控整個發(fā)酵過程(混合菌群難以達到高密度)；2) 不需對培養(yǎng)基進行滅菌處理，節(jié)約能量；3) 采用簡單設(shè)備減少發(fā)酵設(shè)備上的投資；4) 不需對發(fā)酵過程進行嚴(yán)格控制。這些特點，大幅度減少了培養(yǎng)微生物的復(fù)雜性[15-17]。

本研究發(fā)現(xiàn)可以利用“微生物工廠”HalomonasCJN變廢為寶，使活性污泥成為資源來生產(chǎn)生物可降解塑料PHB。

致謝：感謝清華大學(xué)生物材料實驗室的姚志昊老師提供的具體實驗技術(shù)指導(dǎo)、吳瓊老師的微生物知識指導(dǎo)、清華附中本部颋邱楠、梁姝和王旭老師的數(shù)理化生物知識指導(dǎo)以及實驗空間、論文寫作的指導(dǎo)。同時感謝北京排水集團的常菁博士提供的污泥及其熱裂解液分析數(shù)據(jù)。

[1] Beijing Municipal Bureau of Statistics, Beijing Investigation Corps of National Bureau of Statistics.2013 Beijing Statistical Yearbook. Beijing: China Statistics Press, 2013 (in Chinese).北京市統(tǒng)計局, 國家統(tǒng)計局北京調(diào)查總隊. 2013北京市統(tǒng)計年鑒. 北京: 中國統(tǒng)計出版社, 2013.

[2] Nghiem LD, Koch K, Bolzonella D, et al. Full scale co-digestion of wastewater sludge and food waste:bottlenecks and possibilities. Renew Sustain Energy Rev, 2017, 72: 354–362.

[3] Tyagi VK, Lo SL. Sludge: a waste or renewable source for energy and resources recovery? Renew Sustain Energy Rev, 2013, 25: 708–728.

[4] Feng YH, Zhang YB, Chen S, et al. Enhanced production of methane from waste activated sludge by the combination of high-solid anaerobic digestion and microbial electrolysis cell with iron-graphite electrode. Chem Eng J, 2015, 259:787–794.

[5] Chen GQ. A microbial polyhydroxyalkanoates(PHA) based bio- and materials industry. Chem Soc Rev, 2009, 38(8): 2434–2446.

[6] Wang Y, Yin J, Chen GQ. Polyhydroxyalkanoates,challenges and opportunities. Curr Opin Biotechnol,2014, 30: 59–65.

[7] Satoh H, Iwamoto Y, Mino T, et al. Activated sludge as a possible source of biodegradable plastic.Water Sci Technol, 1998, 38(2): 103–109.

[8] Chen GQ, Wei DX. Microbial Poly-hydroxy Fatty Acid Ester. Beijing: Chemical Industry Press, 2014(in Chinese).陳國強, 魏岱旭. 微生物聚羥基脂肪酸酯. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2014.

[9] Yin J, Chen JC, Wu Q, et al. Halophiles, coming stars for industrial biotechnology. Biotechnol Adv,2015, 33(7): 1433–1442.

[10] Li ZJ, Shi ZY, Jian J, et al. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources by metabolically engineeredEscherichia coli. Metab Eng, 2010,12(4): 352–359.

[11] Braunegg G, Sonnleitner B, Lafferty RM. A rapid gas chromatographic method for the determination of poly-β-hydroxybutyric acid in microbial biomass.Eur J Appl Microbiol Biotechnol, 1978, 6(1):29–37.

[12] Yang M, Sun YL, Zheng XC, et al. Denitrification efficiency and techno-economic analysis of different exotic additional carbon source. Water Wastewater Eng, 2010, 36(11): 125–128 (in Chinese).楊敏, 孫永利, 鄭興燦, 等. 不同外加碳源的反硝化效能與技術(shù)經(jīng)濟性分析. 城鎮(zhèn)給排水, 2010,36(11): 125–128.

[13] Zhao H, Zhang HM, Chen XB, et al. Novel T7-like expression systems used forHalomonas. Metab Eng, 2017, 39: 128–140.

[14] Lam W, Wang YJ, Chan PL, et al. Production of polyhydroxyalkanoates (PHA) using sludge from different wastewater treatment processes and the potential for medical and pharmaceutical applications. Environ Technol, 2017, 38(13/14):1779–1791.

[15] Tan D, Wu Q, Chen JC, et al. EngineeringHalomonasTD01 for the low-cost production of polyhydroxyalkanoates. Metab Eng, 2014, 26: 34–47.

[16] Fu XZ, Tan D, Aibaidula G, et al. Development ofHalomonasTD01 as a host for open production of chemicals. Metab Eng, 2014, 23: 78–91.

[17] Zheng YG, Xue YP, Jin LQ. Biological Process and Equipment. Beijing: Chemical Industry Press, 2004(in Chinese).鄭裕國, 薛亞平, 金利群. 生物加工過程與設(shè)備.北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2004.