方榮鋒，李浩浩，張培及，曹讓，楊淑慎

西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

紫杉醇 (Paclitaxel，商品名 Taxol) 是一種具有天然抗腫瘤活性的二萜類物質(zhì)。1971年美國化學(xué)家 Wani等[1]首先從短葉紅豆杉Taxus breuifolia樹皮中分離得到，并命名為紫杉醇，即 Paclitaxel。隨后 Schiff等[2]發(fā)現(xiàn)了紫杉醇獨(dú)特的抗癌機(jī)理，它能抑制微管的解聚，影響紡錘絲的形成，從而阻斷癌細(xì)胞的有絲分裂而達(dá)到治療腫瘤的目的。自從紫杉醇問世以來，由于其良好、廣譜的抗癌效果，被譽(yù)為是近半個(gè)世紀(jì)以來最好的抗癌藥物之一[3]。《世界癌癥報(bào)告》指出在今后的近20年，全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長的態(tài)勢(shì)[4]，由此對(duì)紫杉醇的需求也會(huì)陡然增長。然而，目前紫杉醇主要從紅豆杉的樹皮中提取，其含量僅為0.01%?0.05%[5]，造成了紫杉醇來源的嚴(yán)重匱乏，導(dǎo)致其市場(chǎng)價(jià)格居高不下，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此探索其他方法生產(chǎn)紫杉醇十分迫切。

1993年Stierle等[6]首次從短葉紅豆杉Taxus brevifolia中分離出 1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae，這一發(fā)現(xiàn)為紫杉醇生產(chǎn)開辟了新的途徑。因此從紅豆杉屬等植物中分離內(nèi)生真菌，無疑能緩解紫杉醇生產(chǎn)原料危機(jī)[7]。到目前為止，已報(bào)道有40多個(gè)屬的200多種菌株可以產(chǎn)生紫杉醇[8]，表現(xiàn)出豐富的物種多樣性。但由于大部分菌株發(fā)酵性能較低，初始產(chǎn)量尚未達(dá)到1 mg/L的工業(yè)化生產(chǎn)的盈虧平衡點(diǎn)[9]。

本研究以生長在陜西關(guān)中地區(qū)的 9年生曼地亞紅豆杉Taxus media為材料，從中分離出1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌TMS-26，通過高效液相色譜法 (High performance liquid chromatography，HPLC) 和質(zhì)譜法 (Mass spectrum，MS) 對(duì)其所提取得到的疑似紫杉醇物質(zhì)進(jìn)行了分析，同時(shí)通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類鑒定方法和 18S rDNA序列分析、Internal-transcribed spacer (ITS) 序列分析，對(duì)內(nèi)生真菌TMS-26進(jìn)行了鑒定。

1　材料與方法

1.1　材料

菌株：分離自曼地亞紅豆杉外植體，已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC No：M 2014258)。

紅豆杉：9年生曼地亞紅豆杉Taxus media栽培于西北農(nóng)林科技大學(xué)博覽園。根據(jù)植物內(nèi)生真菌在植物組織和器官中的分布特點(diǎn)及其在植物中的生活習(xí)性，選用曼地亞紅豆杉的根、莖、葉以及樹皮作為內(nèi)生真菌分離的主要部位。

研究材料采集方法如下：

根：使用園藝鏟沿所選曼地亞紅豆杉植株根部向下挖，取地表以下15 cm處的曼地亞紅豆杉多年生根，用園藝剪剪下裝入無菌袋備用。

莖：取所選曼地亞紅豆杉植株多年生、健康且粗壯的莖，使用園藝剪剪下裝入無菌袋備用。

葉：取所選曼地亞紅豆杉多年生、健康且較大的葉片，連同枝條用園藝剪剪下裝入無菌袋備用。

樹皮：取所選曼地亞紅豆杉多年生的莖，用園藝剪剪下，在超凈工作臺(tái)上用無菌手術(shù)刀和鑷子將皮剝下備用。

主要儀器和試劑：Waters 1525-2424型高效液相色譜儀 (美國Waters)；AB Sciex API 2000型三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀 (美國 AB Sciex)；JSM-6360LV型掃描電子顯微鏡 (日本電子儀器公司)。工具酶、IPTG購自TaKaRa公司；DNA片段凝膠回收試劑盒購于 TIANGEN BIOTECH(北京) 公司；紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純。

1.2　方法

1.2.1　內(nèi)生真菌的分離與純化

將采集的曼地亞紅豆杉的外植體放入自來水中沖洗30 min，再用無菌水沖洗3次。轉(zhuǎn)移至潔凈工作臺(tái)內(nèi)，先用75%的乙醇浸泡30 s，然后用無菌水沖洗 3?5次，接著用 0.1%的升汞溶液浸泡10 min，完成后用無菌水沖洗3?5次，將最后一次的洗液涂布于 PDA固體培養(yǎng)基上，作為對(duì)照組以檢驗(yàn)是否消毒徹底。然后將外植體用無菌的解剖剪和解剖刀剪切成0.5 cm×0.5 cm左右的小塊，按外植體部位分別接種于已經(jīng)準(zhǔn)備好的PDA固體培養(yǎng)基上。倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3?7 d，觀察記錄菌絲生長情況。

當(dāng)觀察對(duì)照組的平板無菌落長出，而實(shí)驗(yàn)組平板上長出菌絲后，根據(jù)所長出的菌落顏色、形態(tài)以及分泌物的不同，挑取不同菌落菌絲的尖端接種于新的PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置于培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3?7 d，每天觀察記錄菌絲生長情況。當(dāng)有不同顏色或形態(tài)的菌落生長出來以后，繼續(xù)以菌絲頂端純化法進(jìn)行純化操作直至各個(gè)菌落為單一純培養(yǎng)為止，然后將純化后的單一菌株分別編號(hào)記錄并保存到4 ℃冰箱備用[10]。

1.2.2　發(fā)酵液中紫杉醇的提取與分析

將保藏于4 ℃冰箱中的26株菌種取出，以劃線接種法接種于PDA平板上，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3?4 d，待菌絲均勻長出后，在潔凈工作臺(tái)中用無菌手術(shù)刀片切取 0.5 cm×0.5 cm大小生長均勻的帶培養(yǎng)基菌塊兒，然后分別接入裝有50 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min暗培養(yǎng) 12?15 d。

將發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，濾液用等體積的二氯甲烷120 r/min振蕩萃取3次，分液，合并收集二氯甲烷相。將二氯甲烷相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40 ℃減壓蒸干，用色譜級(jí)甲醇溶解蒸干后所得的固體殘留物，定容至4 mL，然后再用0.22 μm的微孔過濾器進(jìn)行過濾后于 4 ℃冰箱中黑暗保存?zhèn)溆谩?/p>

采用薄層色譜法對(duì)曼地亞紅豆杉產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌進(jìn)行初步篩選，將菌株發(fā)酵提取物的甲醇溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液點(diǎn)樣于 GF254硅膠板上，以三氯甲烷∶乙腈(V∶V)=9∶1為展開劑，甲醇∶濃硫酸∶香草醛(V∶V∶M)=90 mL∶10 mL∶1 g為顯色劑，根據(jù)提取物與標(biāo)準(zhǔn)品的顯色情況，以初步判定菌株發(fā)酵液中是否含有紫杉醇[11]。對(duì)于經(jīng)薄層色譜法檢測(cè)后得出的疑似產(chǎn)紫杉醇的菌株，進(jìn)一步通過高效液相色譜法檢測(cè)，來確認(rèn)這些菌株是否能夠產(chǎn)紫杉醇。本次高效液相色譜法檢測(cè)條件為：色譜柱為C18反向柱(4.5 mm×150 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)波長為227 nm，進(jìn)樣量為5 μL，流動(dòng)相為甲醇∶水(V∶V)=68:32，流速為1 mL/min，柱溫為室溫。根據(jù)高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果得到疑似紫杉醇高產(chǎn)菌株，為了進(jìn)一步確認(rèn)菌株所產(chǎn)紫杉醇的結(jié)構(gòu)，采用液質(zhì)聯(lián)用色譜法(LC/MS/MS)對(duì)高產(chǎn)菌株發(fā)酵提取物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件如下：在紫杉醇的二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)中，紫杉醇加鈉峰所產(chǎn)生質(zhì)荷比為 308.10的碎片子離子和紫杉醇加氫峰所產(chǎn)生質(zhì)荷比為 286.30的碎片子離子的檢測(cè)靈敏度最高，故在此后的檢測(cè)中，選擇m/z=876.60/308.10和m/z=854.70/286.30的兩對(duì)子母離子對(duì)為特征檢測(cè)對(duì)象，使用電噴霧 (ESI)離子源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM) 掃描模式。氣簾氣流速 (CUR) 為 20 L/min，碰撞氣流速(CAD) 為5 L/min，離子源電壓 (IS) 為5000 V，離子源溫度 (TEM) 為 500 ℃，離子源氣流速1 (GS1) 為50 L/min，離子源氣流速2 (GS2) 為60 L/min，去簇電壓 (DP) 為37 V，調(diào)焦電壓 (FP)為400 V，入口電壓 (EP) 為10 V，碰撞電池出口電壓 (CXP) 為4 V。

1.2.3　分離菌株的形態(tài)學(xué)特征

本研究中采用單點(diǎn)法將26#菌株接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)其培養(yǎng)6 d的菌落基本特征、光學(xué)顯微鏡下菌絲形態(tài)以及掃描電子顯微鏡下菌絲孢子形態(tài)等進(jìn)行觀測(cè)和鑒定。

1.2.4　分離菌株的分子系統(tǒng)學(xué)分析

采用 CTAB法提取 26#菌株總基因組DNA[12]，用于隨后的18S rDNA和ITS序列的擴(kuò)增[13]。

菌株18S rDNA的擴(kuò)增與序列分析：

PCR 擴(kuò)增體系(50 μL)：30–150 ng 基因組DNA模板，引物 18S-NS1 (5'-GTAGTCATATG CTTGTCTC-3') 和18S-NS8 (5'-TCCGCAGGTT CACCTACGGA-3')[14]各 1 μL，2×TaqMasterMix 25 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足 50 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，57 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增完成后，DNA目的片段經(jīng)過電泳檢測(cè)，然后進(jìn)行切膠回收DNA片段。純化后的18S rDNA 目的片段送交給英濰捷基 (上海) 生物技術(shù)有限公司完成雙向測(cè)序。將所得序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，并獲得序列登錄號(hào)。而后將所得序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST檢索比對(duì)，利用MEGA5.2軟件分析，自展數(shù)據(jù)集為 1000，其他為默認(rèn)參數(shù)，采用鄰位相連(Neighbor-joining) 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15-16]。

PCR 擴(kuò)增體系 (20 μL)：10–50 ng 基因組DNA模板，引物ITS1和ITS4[14]各0.5 μL，10×Taq緩沖液 2 μL，MgCl21.5 μL，dNTPs 1 μL，TaqDNA polymerase 0.2 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足 20 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性 30 s，54 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸7 min，4 ℃保存。

序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹方法與18S rDNA構(gòu)建方法相同。

2　結(jié)果與分析

2.1　曼地亞紅豆杉內(nèi)生真菌的分離與篩選

2.1.1　薄層色譜法檢測(cè)

在本研究所用檢測(cè)體系中，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過薄層層析檢測(cè)后顯靛藍(lán)色，Rf(點(diǎn)樣斑點(diǎn)中心至斑點(diǎn)中心的距離?點(diǎn)樣斑點(diǎn)中心至展開劑前沿的距離) 值為 0.56。通過對(duì)所分離出來的 26株曼地亞紅豆杉內(nèi)生真菌的發(fā)酵提取物進(jìn)行薄層色譜法點(diǎn)樣檢測(cè)，結(jié)果顯示其中的1#、3#、6#、11#、15#、17#、21#、26#這 8株內(nèi)生真菌的發(fā)酵提取物斑點(diǎn)顏色接近靛藍(lán)色，并且它們的Rf值也接近于0.56 (圖1)。

2.1.2　疑似產(chǎn)紫杉醇菌株高效液相色譜檢測(cè)

通過在相同色譜條件下對(duì) 8株疑似產(chǎn)紫杉醇菌株的發(fā)酵提取物進(jìn)行高效液相色譜法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)26#、17#以及11#菌株的發(fā)酵提取物能夠產(chǎn)生保留時(shí)間分別為4.486、4.502和4.630 min的色譜峰 (圖2B–2D)，這與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品在相同色譜條件下檢測(cè)所得特征峰的保留時(shí)間4.545 min (圖 2A) 極其接近(△≤0.2 min)，這說明26#、17#、11#菌株在發(fā)酵培養(yǎng)過程中能夠產(chǎn)生紫杉醇。

2.1.3　紫杉醇高產(chǎn)菌株液質(zhì)聯(lián)用色譜法檢測(cè)

由高效液相色譜法測(cè)得，26#菌株的紫杉醇產(chǎn)量相對(duì)較高，為了進(jìn)一步確認(rèn)26#菌株發(fā)酵提取物中紫杉醇的結(jié)構(gòu)，本研究采用三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)掃描檢測(cè)，對(duì)26#菌株發(fā)酵提取物中的紫杉醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)分析。通過對(duì)紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品和 26#菌株發(fā)酵提取物中的紫杉醇進(jìn)行正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM) 掃描檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在提取離子流圖中，樣品與標(biāo)品的加鈉峰和加氫峰保留時(shí)間極其接近 (△≤0.2 min)，且在二級(jí)質(zhì)譜圖，樣品產(chǎn)生了和標(biāo)品相同且對(duì)應(yīng)的離子對(duì)峰，從而證明樣品中的紫杉醇結(jié)構(gòu)與標(biāo)品相同 (圖3)。

圖1　疑似產(chǎn)紫杉醇菌株發(fā)酵提取物TLC圖 (其中右側(cè)R為紫杉醇標(biāo)品，左側(cè)編號(hào)為樣品)Fig. 1 TLC analysis on the fermentation extract of the suspected taxol-producing endophytic (R which on the right represents authentic taxol and samples are on the left).

2.2　菌株的菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)6 d后，26#菌株的菌落呈規(guī)則的橢圓形，直徑75 mm，厚度約為1 mm，表面呈絨毛輻射狀 (圖4A)。菌落均一平坦無隆起，不透明，正面中心為藍(lán)綠色，邊緣灰白色，背面中心為黃綠色，向外依次變淺，整體較為干燥，與培養(yǎng)基結(jié)合較為緊密，無明顯氣味，生長較快且較為旺盛。

在TFM-850型倒置熒光顯微鏡白光模式下觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，26#菌株菌絲呈樹枝狀，有明顯隔膜(圖4B)；分生孢子梗較長，無分枝，無色；分生孢子囊呈橢圓形 (圖4C)，分生孢子呈圓形，藍(lán)綠色。

在JSM-6360LV型掃描電子顯微鏡下，菌株菌絲有隔，多分枝，較粗，直徑3.0–6.0 μm，分生孢子梗是從膨大的足細(xì)胞垂直生出，無色，光滑，無分枝，頂端膨大形成近似球形的頂囊，頂囊表面形成小梗，小梗平行簇生于頂囊頂部。小梗單層，分生孢子自小梗頂端相繼形成。分生孢子為藍(lán)綠色，近圓球形，形狀均勻，表面有不規(guī)則塊狀突起，分生孢子直徑1.8–2.2 μm。

以上形態(tài)學(xué)觀測(cè)結(jié)果與《真菌鑒定手冊(cè)》[17]進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)26#菌株的形態(tài)學(xué)特征與曲霉屬真菌 (Aspergillussp.) 相似。

2.3　分子生物學(xué)方法鑒定

用CTAB法獲得菌株總基因組DNA，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，PCR擴(kuò)增，獲得26#菌株 18S rDNA序列，測(cè)序后片段大小為1687 bp，所得序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得序列登錄號(hào)KJ746594。對(duì)菌株18S rDNA序列進(jìn)行聚類分析，得到菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5A)，顯示 26#菌株與煙曲霉菌Aspergillus fumigatus的18S rDNA序列同源性極高，序列相似度達(dá)到99%，證明依據(jù)菌株18S rDNA序列分析結(jié)果可以將26#菌株分類鑒定為煙曲霉菌。

圖2　紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液及發(fā)酵提取物HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatograms of authentic taxol and the sample extracted from three strains. (A) An HPLC chromatograms of authentic taxol (Arrow indicates the taxol-specific peaks). (B) An HPLC chromatogram of the sample extracted from strain 26#. (C) An HPLC chromatogram of the sample extracted from strain 17#. (D) An HPLC chromatogram of the sample extracted from strain 11#.

圖3　紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品 (A) 和26#菌株發(fā)酵提取物 (C) 的質(zhì)譜提取粒子流圖以及紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品 (B) 和26#菌株發(fā)酵提取物 (D) 的二級(jí)質(zhì)譜離子峰圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of LC/MS/MS of the authentic taxol (A) and the fungal taxol produced by strain 26# (C), and the mass spectrum figures of the authentic taxol (B) and the fungal taxol produced by strain 26# (D).

2.4　菌株ITS序列分析

26#菌株ITS序列測(cè)序后，片段大小為555 bp，所得序列提交至 GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得序列登錄號(hào)KJ716967。對(duì)菌株ITS序列進(jìn)行聚類分析，得到菌株系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖 5B)，顯示 26#菌株與煙曲霉菌Aspergillus fumigatus的ITS序列同源性極高，序列相似度也達(dá)到了 99%，證明依據(jù)菌株ITS序列分析結(jié)果可以將26#菌株分類鑒定為煙曲霉菌，與26#菌株18S rDNA序列分析結(jié)果一致。

綜合傳統(tǒng)分類學(xué)方法鑒定結(jié)果和現(xiàn)代分子系統(tǒng)學(xué)分析的方法，26#菌株被鑒定為曲霉屬煙曲霉Aspergillus fumigatus，將其命名為：煙曲霉TMS-26。

圖4　26#菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)特征Fig. 4 Morphological structure characteristics of strain 26#. (A) Colony of strain 26# after cultured on PDA medium at 28 ℃ for 6 days. (B,C) Mycelial morphology and sporangium morphology of strain 26#. (D–G) Conidia of strain 26# under a scanning electron microscope.

3　討論

與直接從紅豆杉屬植物的樹皮中提取紫杉醇相比，內(nèi)生真菌生產(chǎn)紫杉醇具有更大的發(fā)展?jié)摿?。真菌不僅能在簡單的培養(yǎng)基上良好生長，產(chǎn)生大量的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)酵周期短，還可以在生物反應(yīng)器中人為控制各種參數(shù)，并可通過誘變育種等傳統(tǒng)育種和基因工程手段來提高菌種性能以提高紫杉醇產(chǎn)量，如趙凱等對(duì)紫杉醇產(chǎn)生菌NCEU-1的原生質(zhì)體進(jìn)行UV和LiCl復(fù)合誘變，紫杉醇產(chǎn)量提高了33.17%[18]；同時(shí)隨著對(duì)紫杉醇合成途徑中關(guān)鍵酶研究的不斷深入，使構(gòu)建紫杉醇高產(chǎn)基因工程菌株成為可能[19]。通過內(nèi)生真菌發(fā)酵法生產(chǎn)對(duì)于植物來源的天然藥物的開發(fā)及瀕危藥用植物的保護(hù)具有十分重要的經(jīng)濟(jì)及生態(tài)效益，并為生產(chǎn)紫杉醇藥物開辟了新的途徑[20]。

研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)主要集中在太平洋短葉紅豆杉、歐洲紅豆杉、東北紅豆杉、西藏紅豆杉以及云南紅豆杉等品種紅豆杉中產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離和篩選[21]，對(duì)于雜交種曼地亞紅豆杉中產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離和篩選研究報(bào)道較少。本研究從生長在關(guān)中地區(qū)的曼地亞紅豆杉中分離出26株內(nèi)生真菌，篩選獲得3株產(chǎn)紫杉醇菌株，通過HPLC對(duì)其發(fā)酵提取物進(jìn)行分析(圖 2B–2D) 并對(duì) 26#菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了 MS分析 (圖3)。并對(duì)26#菌株菌落、菌絲體和孢子形態(tài)特征分析 (圖4A–4G) 和18S rDNA和ITS序列分析 (圖 5A、5B) 將其鑒定為曲霉屬煙曲霉真菌，并命名為“煙曲霉TMS-26”。

煙曲霉是自然界普遍存在的絲狀腐生真菌，也是條件致病菌和重要的變應(yīng)原[22]。TMS-26菌株分類為曲霉屬煙曲霉，目前產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌已有 20多個(gè)屬，如擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis microspora、樹狀多節(jié)孢Noduzisporium sylviforme、鏈格孢菌Alternaria、莖點(diǎn)霉屬Phomopsis、曲霉屬Aspergillus nigervar等，但關(guān)于產(chǎn)紫杉醇的曲霉屬煙曲霉菌株只有一例，編號(hào) EPTP-1[23]。與本研究分離得到的煙曲霉TMS-26菌株相比，菌株EPTP-1在形態(tài)特征和ITS序列上存在一定差異：在形態(tài)特征上，PDA培養(yǎng)基28 ℃暗培養(yǎng)5 d后，菌株EPTP-1產(chǎn)生黑灰色分生孢子，且菌落有黃色滲出液產(chǎn)生；在菌株 ITS序列比較上，經(jīng)過DNAMAN V6.0軟件比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，菌株EPTP-1的ITS序列 (GenBank序列登錄號(hào)為EU256469) 與煙曲霉 TMS-26菌株的 ITS序列擁有 91%的序列同源性。綜合兩個(gè)菌株形態(tài)特征和 ITS序列比較結(jié)果可知，本研究分離得到的煙曲霉TMS-26菌株和菌株EPTP-1屬于兩個(gè)不同的菌株。本研究首次報(bào)道了從曼地亞紅豆杉中分離出產(chǎn)紫杉醇的曲霉屬煙曲霉菌株，這豐富了產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的種群資源，為尋找適合人工修飾的產(chǎn)紫杉醇原始出發(fā)菌株奠定了基礎(chǔ)[24-25]。但Aspergillus fumigatusTMS-26的發(fā)酵潛能以及發(fā)酵產(chǎn)物的生物學(xué)活性尚未明確，有待進(jìn)一步研究。

圖5　26#菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of strain 26#. (A) Phylogenetic trees showing relationship of strain 26# with other related fungal species retrieved from GenBank based on their sequence homologies of 18S rDNA sequence. (B) Phylogenetic trees showing relationship of strain 26# with other related fungal species retrieved from GenBank based on their sequence homologies of ITS sequence.

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