譚永貴，劉 騰，朱 杰，郭慧敏，吳巧梅，李 琦，繆秋紅，陳宗艷，李傳峰，劉光清

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

·研究論文·

SYBR Green II熒光定量PCR結(jié)合熔解曲線鑒別不同亞型兔病毒性出血癥病毒方法的建立

譚永貴，劉 騰，朱 杰，郭慧敏，吳巧梅，李 琦，繆秋紅，陳宗艷，李傳峰，劉光清

本研究建立了一種熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR）結(jié)合熔解曲線區(qū)分不同亞型兔病毒性出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）方法。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的不同亞型RHDV（經(jīng)典RHDV和RHDV2）的衣殼蛋白VP60序列保守區(qū)設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，利用SYBR Green II熒光染料，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的基礎(chǔ)上結(jié)合熔解曲線進(jìn)行分析，經(jīng)典RHDV和RHDV2熔解溫度（Tm）分別為（86.3±0.1）℃和（85.1±0.1）℃，擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析均只出現(xiàn)單特異峰。結(jié)果表明，本研究建立的方法能夠快速地鑒別經(jīng)典RHDV和RHDV2。

兔病毒性出血癥病毒；熒光定量PCR；熔解曲線；鑒別

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

兔病毒性出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）為單股正鏈RNA病毒，屬于杯狀病毒科（Caliciviridae）、兔病毒屬（Lagovirus）。RHDV可引發(fā)兔發(fā)生急性、敗血性傳染病，發(fā)病率達(dá)100%，病死率可達(dá)90%以上，是兔的一種毀滅性傳染病，俗稱“兔瘟”。1984年，兔瘟第一次在中國江蘇省大規(guī)模爆發(fā)，病兔呈現(xiàn)肝臟壞死，實(shí)質(zhì)臟器水腫，呼吸系統(tǒng)彌散性出血等典型病變[1]。2010年法國發(fā)生一起非典型的兔瘟疫情，家兔發(fā)病的潛伏期較經(jīng)典兔瘟久，死亡率低，但是死亡的家兔與經(jīng)典兔瘟相似，很難區(qū)分。該病自從第一次爆發(fā)后迅速傳播，在不到4年的時(shí)間里，已經(jīng)傳遍歐洲大陸，包括西班牙、英格蘭、德國、意大利等國家[2-8]，甚至在離歐洲1000 km以外的亞速爾群島也檢測(cè)到新型RHDV的存在[9]。

新型兔出血癥病毒（RHDV2）同經(jīng)典RHDV以及其他杯狀病毒科病毒有著相似的基因組結(jié)構(gòu)，5'-末端無帽子結(jié)構(gòu)，3'-末端為多聚腺苷酸Poly（A）尾。其VP60基因序列與RHDV VP100基因序列相同率為85%，通過普通的RT-PCR很難區(qū)分[10]。普通ELISA一般是以表達(dá)的衣殼蛋白為包被抗原來檢測(cè)疑似感染兔子血清，而RHDV和RHDV2的衣殼蛋白有交叉的抗原決定簇，能夠相互識(shí)別對(duì)方陽性血清，故不能區(qū)分兩種病原。

本研究通過對(duì)RHDV和RHDV2毒株的衣殼蛋白VP60序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了基于SYBR Green II染料的熒光定量PCR，結(jié)合熔解曲線差異，能夠快速鑒別出兩者。該方法僅需加一對(duì)引物就能夠區(qū)分兩種不同的RHDV，簡單易行，耗時(shí)少，給兔瘟的正確診斷和防治提供了極大的便利。雖然中國目前還沒有檢測(cè)到RHDV2的公開報(bào)道，但是也不能夠排除該病原有隱性感染的可能，本研究建立的方法為RHDV2的檢測(cè)提供了可靠方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與毒株 新型兔出血癥病毒（RHDV2）VP60基因序列（GenBank登錄號(hào): KM878681.1）由上海生工生物有限公司合成，然后構(gòu)建成重組質(zhì)粒（PVC-RHDV2-VP60）保存于本實(shí)驗(yàn)室；經(jīng)典兔出血癥病毒（RHDV）全長質(zhì)粒PBL-RHDV由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑和儀器 DNA Marker、Taq酶、SYBR Green II熒光染料、熒光定量PCR管購自TaKaRa公司；pMD19-T載體、Solution I購自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)購自全式金公司；膠回收試劑盒、熒光定量PCR管購自Axygen公司；Mastercycle ep realplex 4熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司；紫外超微量分光光度計(jì)購自美國熱電公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)與合成 使用DNAStar軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的病毒RHDV（GenBank登錄號(hào): DQ205345.1）和RHDV2（GenBank登錄號(hào): KM878681.1），并在數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，找出兩者的保守序列，并設(shè)計(jì)了1對(duì)與兩個(gè)模板都特異性結(jié)合的引物。引物由上海生工合成，理論可擴(kuò)增的長度為184 bp。RHDV-F:5'-TTGTTTGTGAT GGCMTCGGGT-3'；RHDV-R:5'-GCGAACAT GATGGGTGTGTTCTT-3'。

1.2.2 模板制備 分別以pBL-RHDV和pUC-RHDV2-VP60為模板克隆出VP60基因序列，擴(kuò)增體系（50 μL）:模板DNA 2.0 μL、Primix TaqTM（Ex TaqTMVersion）25 μL、上/下游引物（10 pmol/μL）各2 μL、加滅菌ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，56℃延伸30 s，72℃延伸1 min 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，利用切膠回收試劑盒回收目的片段，并將回收的目的片段克隆至pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽性重組質(zhì)粒送上海華津生物有限公司測(cè)序。提取鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒作為熒光定量的模板使用。將重組質(zhì)粒分別命名為pMD-19T-RHDVVP60、pMD-19T-RHDV2-VP60。按以下公式計(jì)算重組質(zhì)粒絕對(duì)拷貝數(shù):copies/μL=（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA長度×660）。

1.2.3 熒光定量PCR最佳條件選擇 最佳條件選擇主要指PCR退火溫度和PCR引物濃度。首先設(shè)置退火溫度為55～65℃梯度篩選出最佳退火溫度，然后進(jìn)行優(yōu)化引物濃度，找到最小的樣本Ct值以及最高熒光值，提高反應(yīng)的穩(wěn)定性及可信度。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 取OD280/OD260介于1.8～2.0的陽性重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定核酸含量。根據(jù)公式:copies/μL=（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/(DNA長度×660)，計(jì)算拷貝數(shù)，根據(jù)實(shí)際測(cè)得濃度將核酸進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋至102～109copies/ μL，然后進(jìn)行熒光定量PCR繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 熔解曲線建立 以上述優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系:2×SYBR GreenⅡreal-time PCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、模板1.0 μL、補(bǔ)充滅菌ddH2O至20 μL，待PCR反應(yīng)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)后建立溶解曲線。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 將分別提取的兔輪狀病毒、兔水皰性口炎病毒核酸作為模板進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。

1.2.7 敏感性試驗(yàn) 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至102～109copies/ μL，每個(gè)反應(yīng)添加模板2 μL，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，用來確定所能檢測(cè)的最小拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因片段的擴(kuò)增 成功克隆出經(jīng)典RHDV的VP60序列，對(duì)克隆產(chǎn)物連接pMD19-T載體，測(cè)序結(jié)果正確，并利用該重組載體為模板特異性擴(kuò)增出184 bp的基因片段（圖1）。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，最終確定熒光定量PCR最佳的反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增效率，確定該反應(yīng)體系的最佳退火溫度為60℃。PCR反應(yīng)體系:SYBR Green Ⅱ10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各1 μL、模板各1 μL，補(bǔ)加滅菌ddH2O至20 μL。

2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將pMD-19TRHDV-VP60和pMD-19T-RHDV2-VP60的質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)，并稀釋為同一拷貝數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1×102～1×109copies /μL，利用最佳擴(kuò)增條件進(jìn)行定量擴(kuò)增（圖2）。結(jié)果顯示（圖3），標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒在1×102～1×109copies /μL之間具有良好的線性關(guān)系。pMD-19T-RHDV-VP60的相關(guān)系數(shù): R2=0.999，線性關(guān)系式:y=-4.5648x+45.879；pMD-19T-RHDV2-VP60的相關(guān)系數(shù):R2=0.9999，線性關(guān)系式:y=-4.0313x+44.178；產(chǎn)物熔解曲線單一，表明產(chǎn)物為特異性擴(kuò)增。

2.4 熔解曲線分析 從熔解曲線所得到的的特異峰可以看出:pMD-19T-RHDV2-VP60的熔解溫度為（86.3±0.1）℃，pMD-19T-RHDV-VP60的熔解溫度為（85.1±0.1）℃；擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線只出現(xiàn)1個(gè)單特異性峰（圖4）。

2.5 特異性 本研究建立的方法只能特異檢測(cè)到RHDV，而對(duì)兔的其他病毒類疾病的檢測(cè)結(jié)果均為陰性（圖5），說明該對(duì)引物能夠很好的檢測(cè)RHDV，并對(duì)其進(jìn)行分型。

圖1 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of target gene1～3∶ pMD19T-RHDV-VP60, 濃度依次為103、105、107copies/ μL; 4～6∶ pMD19T-RHDV2-VP60, 濃度依次為103、105、107copies/μL; M∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)1-3∶ The concentration of pMD19T-RHDV-VP60 were 103, 105, 107copies/μL in turn; 4-6∶ The concentration of pMD19TRHDV2-VP60 were 103, 105, 107copies/μL in turn; M∶ DNA Marker(DL2000)

圖2 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.2 Kinetic curve of real-time PCR

圖3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of real-time PCR

圖4 熒光定量PCR熔解曲線的建立Fig.4 Melting curve of real-time PCR

圖5 PCR特異性結(jié)果分析Fig.5 Specifi city test of real-time PCR for RHDV1∶ RHDV/ RHDV2; 2∶ 兔輪狀病毒; 3∶ 兔水泡性口炎病毒; 4∶ 陰性對(duì)照; M∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(2k plus II)1∶ RHDV/ RHDV2; 2∶ Lapine rotavirus(LaRV); 3∶ Rabbit Vesicular stomatitis(RVSV); 4∶ Negative control; M∶ DNA Marker (2k plus II)

3 討論

目前，在RHDV的鑒別方面已有ELISA方法鑒別兩株不同的RHDV，該方法原理是利用篩選的特異性單克隆抗體能夠識(shí)別不同亞型RHDV，從而能夠鑒別出不同亞型的兔出血癥病毒[11]。也有學(xué)者利用TaqMan熒光探針的方法檢測(cè)RHDV2[12]，該方法僅能夠檢測(cè)已發(fā)生疫情是否含有新型兔病毒性出血癥病毒。

本研究建立的基于SYBR Green II的熒光定量PCR結(jié)合熔解曲線法能夠同時(shí)鑒別出兩種不同亞型的RHDV，對(duì)RHDV流行病學(xué)調(diào)查以及防控具有重要意義。目前雖然RHDV2已經(jīng)在歐洲廣泛流行，并有取代經(jīng)典RHDV的趨勢(shì)，但我國還沒有公開報(bào)道有RHDV2感染爆發(fā)，我們實(shí)驗(yàn)室也沒有收集到RHDV2的病料，所以建立的該方法在應(yīng)用方面還未得到檢驗(yàn)，這是本實(shí)驗(yàn)的不足之處。

[1] 劉勝江, 薛華平, 浦伯清, 等. 兔的一種新病毒病—兔病毒性出血癥[J]. 畜牧與獸醫(yī), 1984(6)∶ 253-255.

[2] Le Gall-Recule, Zwingelstein G F, Boucher S, et al. Detection of a new variant of rabbit haemorrhagic disease virus in France[J]. Vet Rec, 2011, 168(5)∶ 137-138.

[3] Abrantes J, Lopes A M, Dalton K P, et al. New variant of rabbit hemorrhagic disease virus, Portugal, 2012-2013[J]. Emerg Infect Dis, 2013, 19(11)∶ 1900-1902.

[4] Le Gall-Recule G, Lavazza A, Marchandeau S, et al. Emergence of a new lagovirus related to Rabbit Haemorrhagic Disease Virus[J]. Vet Res, 2013, 44∶ 81.

[5] Puggioni G, Cavadini P, Maestrale C, et al. The new French 2010 Rabbit Hemorrhagic Disease Virus causes an RHD-like disease in the Sardinian Cape hare (Lepus capensis mediterraneus) [J]. Vet Res, 2013, 44∶ 96.

[6] Baily J L, Dagleish M P, Graham M, et al. RHDV variant 2 presence detected in Scotland[J]. Vet Rec, 2014, 174(16)∶ 411.

[7] Lopes A M, Marques S, Silva E, et al. Detection of RHDV strains in the Iberian hare (Lepus granatensis)∶ earliest evidence of rabbit lagovirus cross-species infection[J]. Vet Res, 2014, 45∶ 94.

[8] Westcott D G, Frossard J P, Everest D, et al. Incursion of RHDV2-like variant in Great Britain[J]. Vet Rec, 2014, 174(13)∶ 333.

[9] Duarte M, Henriques M, Barros S C, et al. Detection of RHDV variant 2 in the Azores[J]. Vet Rec, 2015, 176(5)∶130.

[10] Dalton K P, Abrantes J, Lopes A M, et al. Complete genome sequence of two rabbit hemorrhagic disease virus variant b isolates detected on the Iberian Peninsula[J]. Arch Virol, 2015, 160(3)∶ 877-881.

[11] Barcena J, Guerra B, Angulo I, et al. Comparative analysis of rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) and new RHDV2 virus antigenicity, using specific virus-like particles[J]. Vet Res, 2015, 46∶106.

[12] Duarte M D, Carvalho C L, Barros S C, et al. A real time Taqman RT-PCR for the detection of rabbit hemorrhagic disease virus 2 (RHDV2) [J]. J Virol Methods, 2015, 219∶90-95.

DIFFERENTIATION OF SUBTYPES OF RABBIT HEMORRGAGIC DISEASE VIRUS USING SYBR GREEN II REAL-TIME PCR AND DIFFERENT MELTING CURVES

TAN Yong-gui, LIU Teng, ZHU Jie, GUO Hui-min, WU Qiao-mei, LI Qi, MIAO Qiu-hong, CHEN Zong-yan , LI CHUAN-feng , LIU Guang-qing

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The real - time fl uorescence PCR in combination of unique melting curves was developed to distinguish Rabbit hemorrhagic disease virus(RHDV) and RHDV2. A pair of specifi c primers were designed according to the published GenBank database of RHDV and RHDV2 capsid protein VP60 and labeled with SYBR Green fl uorescent dye II. The melting temperatures of RHDV and RHDV2 were (86.3 + 0.1) ℃ and (85.1-0.1) ℃, respectively, and single specifi c peaks were observed. These results indicated that the method developed here was able to quickly identify RHDV and RHDV2.

Rabbit hemorrhagic disease virus; Real - time fl uorescence PCR; melting curve; differentiation

S852.659.6

A

1674-6422（2017）01-0007-05

2016-05-06

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0500108）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31502068）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目

譚永貴，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

劉光清，E-mail:liugq@shvri.ac.cn