董嘉文，李林林，孫敏華，張建峰，鄺瑞歡，胡奇林，張春紅

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013）

·研究論文·

鴨坦布蘇病毒JM株E蛋白的截?cái)啾磉_(dá)及間接ELISA方法的建立

董嘉文1，李林林1，孫敏華1，張建峰1，鄺瑞歡1，胡奇林2，張春紅1

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013）

本研究利用RT-PCR擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）JM株E基因截?cái)嗥危?22 bp），并將其克隆至原核表達(dá)載體pET32a ( + )，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET32a-E。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到了高效表達(dá)。Western blot分析表明，重組蛋白能與DTMUV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。將純化好的DTMUV E蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)DTMUV血清抗體的間接ELISA方法。經(jīng)過條件優(yōu)化，確定了抗原最適包被濃度為0.093 μg/孔，血清的最佳稀釋度為1∶100。批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的最大變異系數(shù)分別為3.53%和9.73%。用建立的ELISA方法對(duì)免疫鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的鴨血清和對(duì)照鴨血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，同時(shí)與攻毒保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行比較，兩者的陽性符合率為86.67% ，陰性符合率為100%。

鴨坦布蘇病毒；JM株；E 蛋白；截?cái)啾磉_(dá)；ELISA

鴨坦布蘇病毒病是由屬于黃病毒科（Flaviviridae）、黃病毒屬（Flavivirus）、恩塔亞病毒群的坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）感染引起的。該病2010年春季在浙江省、江蘇省、上海市等華東地區(qū)首次發(fā)生，并迅速傳播到全國(guó)大多數(shù)水禽養(yǎng)殖地區(qū)，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大損失[1-5]。TMUV主要感染蛋鴨和種鴨，發(fā)病率幾乎100%，死亡率為5%～10%。臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)病5 d內(nèi)，蛋鴨群的產(chǎn)蛋量驟然下降，從產(chǎn)蛋高峰迅速下降至30%～10%，嚴(yán)重的甚至停產(chǎn)。近年來有報(bào)道該病毒感染的宿主范圍有擴(kuò)大趨勢(shì)，從自然感染蛋鴨，到能夠感染蛋雞、蛋鵝等禽類[6,7]。

鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）呈球形，直徑30～50 nm，是不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒[8,9]。DTMUV編碼結(jié)構(gòu)蛋白（C、prM和E）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。E蛋白是DTMUV的外膜蛋白，參與病毒的細(xì)胞膜融合和穿入，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體，是主要的免疫原性蛋白[10-13]。本研究截取了E基因的主要抗原表位區(qū)段（822 bp），將該基因片段克隆到表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和鑒定。然后以純化的pET32a-E蛋白作為抗原，建立了快速檢測(cè)DTMUV抗體的間接ELISA方法，為鴨坦布蘇病毒病的診斷以及流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株和質(zhì)粒 DTMUV JM株[9,10]、DTMUV陽性血清、大腸埃希菌工程菌株DH5α、Rosseta感受態(tài)細(xì)胞（DE3）、pET32a（+）質(zhì)粒均為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所保存。

1.2 主要試劑 BamH I、XhoI 、T4 DNA連接酶和RNA抽提試劑盒購(gòu)于寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)和小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于天根生物科技有限公司；預(yù)染蛋白質(zhì)Marker為Fmentas公司產(chǎn)品；兔抗鴨IgG為Nordic公司產(chǎn)品；鴨坦布蘇病毒滅活疫苗為本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 蛋鴨購(gòu)自廣東省佛山市三水區(qū)某鴨場(chǎng)，經(jīng)檢測(cè)蛋鴨未感染過鴨坦布蘇病毒。

1.4 重組蛋白pET32a-E的表達(dá)和鑒定

1.4.1 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)DTMUV JM毒株E基因序列（GenBank登錄號(hào):JN811559），設(shè)計(jì)擴(kuò)增E基因截?cái)嗥未笮?22 bp。引物由上海英濰捷基生物技術(shù)公司合成。上游引物:5'-CTAGGATCCC AGAAGGAAAACGTCCAGT -3'（BamH I）；下游引物:5'-CCGCTCGAGTTACCACTGGTACCTGAT -3'（XhoI）

1.4.2 RNA的抽提及cDNA的反轉(zhuǎn)錄 參照TaKaRa公司的RNA抽提試劑盒操作說明抽提RNA。40 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:21 μL RNA、2 μL 隨機(jī)引物、4 μL dNTP Mixture（2.5 mmol/ L），65℃水浴5 min，在冰浴下依次加入8 μL 5×First strand buffer、4 μL DTT和1 μL 反轉(zhuǎn)錄酶，混勻，于37℃水浴1 h，取出置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 DTMUV-E基因的PCR擴(kuò)增 25μL PCR反應(yīng)體系:10×ExTaq buffer 2.5μL、dNTPs（2.5 mmol/ L） 2.0 μL、P1（10 pmol/μL） 1.0 μL、P2（10 pmol/μL）1.0 μL、ExTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.125 μL、cDNA 2 μL，加ddH2O至25μL。首先94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，循環(huán)30次后，最后72℃再延伸10 min。

1.4.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 截?cái)郋基因PCR產(chǎn)物純化回收后和表達(dá)載體pET32a（+）用BamH I、Xho I進(jìn)行雙酶切，16℃連接過夜后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將培養(yǎng)液涂布于含Amp (100 mg/ L) 的平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑選單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定，將鑒定的陽性重組質(zhì)粒送測(cè)序。然后把測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosseta感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。

1.4.5 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定按照1∶50比例將陽性菌液加入含Amp的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.5～0.8時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/ L的IPTG，然后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后2、3、4、5 、6 h吸取1 mL菌液于4℃保存，10 800×g 離心1 min，收集細(xì)菌沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，同時(shí)以誘導(dǎo)的空載體和未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒為對(duì)照。

1.4.6 pET32a-E表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 按照確定的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)pET32a-E陽性菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。然后4℃、7378×g 離心10 min，收集菌體，加入20 mLPBS重懸菌體，于冰浴中進(jìn)行超聲裂解。超聲完畢后于4℃、轉(zhuǎn)速必須是10 800×g 離心20 min，分離超聲產(chǎn)物的上清和沉淀，用10 mL PBS重懸沉淀。取50 μL的超聲上清和沉淀重懸液，分別加入50 μL上樣緩沖液，混勻，置沸水浴中煮10 min后離心1 min，最后分別取10 μL上清進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.4.7 重組蛋白PET32a-E的提取及純化 采用上述最佳誘導(dǎo)條件進(jìn)行大量表達(dá)蛋白并超聲破碎，棄去上清，15 mL（含8 mol/L尿素）重懸菌體，冰浴2 h后，4℃、8928 ×g 離心20 min，收集上清，即為溶解的包涵體。按照Novagen 公司的Ni-NTA His·Bind 樹脂說明書對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，將純化好的目的蛋白用超濾管進(jìn)行濃縮，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.8 Western blot檢測(cè) 重組蛋白pET32a-E經(jīng)SDSPAGE電泳分離后，將預(yù)先在轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡后的濾紙、膠、NC膜，按以下順序組裝:平板陽極-三層濾紙-NC 膜-凝膠-三層濾紙-平板陰極，15 mA轉(zhuǎn)1.5 h。電轉(zhuǎn)印結(jié)束后， NC膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，用PBST洗滌3次，每次5 min；加入1∶50稀釋的DTMUV陽性血清，37℃作用1 h后，再用PBST洗滌3次；加入1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗鴨IgG 37 ℃作用1 h，用PBST洗滌3次；用DAB顯色，然后用ddH2O終止，拍照保存。

1.5 間接ELISA方法的建立

1.5.1 重組蛋白抗原最適包被濃度和血清最適稀釋濃度的確定 用包被液將重組蛋白抗原進(jìn)行倍比稀釋后包被酶標(biāo)板，濃度分別為0.047、0.093、0.186、0.372、0.744、1.448μg/孔，4℃過夜。用血清稀釋液將DTMUV陽性血清和健康鴨陰性血清分別進(jìn)行50、100、200及400倍稀釋，與重組蛋白不同稀釋度進(jìn)行方陣滴定[8]，100 μL/孔，每個(gè)濃度設(shè)1個(gè)重復(fù)，HRP兔抗鴨二抗?jié)舛葹?∶16 000，按常規(guī)進(jìn)行ELISA，測(cè)定血清的OD490值。

1.5.2 間接ELISA方法陰、陽臨界值的確定 用以上確定的最適反應(yīng)條件進(jìn)行ELISA，分別檢測(cè)健康鴨陰性血清40份，測(cè)定OD490，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算平均值（） 和標(biāo)準(zhǔn)差（s），按照公式:+ 2s判定陽性和陰性。

1.5.3 間接ELISA方法的特異性試驗(yàn) 用純化的重組蛋白作為包被抗原，分別與番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus disease，MPV）、鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）、鴨甲肝病毒I 型（Duck Hepatitis A virus type-1，DHAV-I）、鴨瘟病毒（DPV）和鴨疫里默氏桿菌（Rhemerellc anatioesfifer，RA）陽性血清反應(yīng)，同時(shí)設(shè)DTMUV陽性和陰性血清對(duì)照，按照以上建立的ELISA方法檢測(cè)其OD490值。

1.5.4 間接ELISA方法的敏感性試驗(yàn) 將DTMUV陽性血清分別進(jìn)行100、200、400、800、1600、3200、6400倍和12 800倍稀釋，按照以上建立的ELISA方法檢測(cè)其OD490值。

1.5.5 間接ELISA方法的重復(fù)性試驗(yàn) 取4份陽性血清和4份陰性血清進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，每份樣品平行設(shè)6個(gè)重復(fù)，在4個(gè)不同試驗(yàn)日重復(fù)測(cè)定4份陽性血清和4份陰性血清，每份樣品平行設(shè)4個(gè)重復(fù)，進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)。

1.5.6 間接ELISA方法的臨床應(yīng)用 120日齡非免蛋鴨30只隨機(jī)分成3組，每組10只，腿部肌肉注射DTMUV滅活疫苗（1 mL/只），同時(shí)設(shè)立對(duì)照組10只。21 d后加強(qiáng)免疫1次，28 d后采血，分離血清用所建立的ELISA方法檢測(cè)抗體。采血完后用鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒株腿部肌肉注射攻擊，103.0ELD50/只，攻毒后4 d后，全部剖殺，記錄卵巢的病變情況。

2 結(jié)果

2.1 DTUMV-E基因的RT-PCR擴(kuò)增 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后電泳，截?cái)郋基因擴(kuò)增產(chǎn)物在750～1000 bp條帶之間獲得一條特異性的條帶，與預(yù)期片段大小相一致（圖1）。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 pET32a-E質(zhì)粒經(jīng)過BamH I和XhoI雙酶切后，電泳可見在1000 bp和7000 bp附近出現(xiàn)2條清晰條帶，前者為E基因，后者為pET32a (+)載體片段，說明截?cái)郋基因片段正確插入到表達(dá)載體中（圖2）。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定 如圖3所示，pET32a-E陽性菌誘導(dǎo)2～6 h均在48 kDa左右出現(xiàn)特異性蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白分子量大小一致，而未誘導(dǎo)的pET32a-E沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，且誘導(dǎo)5～6 h的蛋白表達(dá)量最大，考慮到實(shí)驗(yàn)的效率，故選取5 h作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖 1 DTUMV-E基因RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig. 1 PCR-amplifi ed E gene from DTMUVM∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1∶ E 基因 RT-PCR 產(chǎn)物M∶ DNA Marker(DL2000); 1∶ PCR products of E gene

圖 2 pET32a-E質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳結(jié)果Fig. 2 Identifi cation of recombinant plasmid pET32a-E by restriction enzymes digestionM∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL10000); 1∶ pET32a-E質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物M∶ DNA Marker (DL10000); 1∶ Restriction enzymes digestion products of pET32a-E

2.4 pET32a-E表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 pET32a-E表達(dá)蛋白經(jīng)過超聲波破碎、離心后，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在（圖4）。

2.5 Western blot檢測(cè)結(jié)果 pET32a-E重組蛋白經(jīng)過純化后進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示在48 kDa左右出現(xiàn)特異條帶，說明純化重組蛋白在大腸桿菌中獲得正確表達(dá)，并且能被DTMUV陽性血清所識(shí)別，表明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性（圖5）。

圖 3 不同誘導(dǎo)時(shí)間pET32a-E蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombination protein pET32a-EM∶ 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1∶ 重組質(zhì)粒pET32a-E未誘導(dǎo)菌; 2～6∶分別為IPTG誘導(dǎo)2、3、4、5、6 h的重組質(zhì)粒pET32a-E; 7∶pET32a ( + )誘導(dǎo)菌M∶ Protein Marker; 1∶ Un-induced recombinant plasmid pET32a-E; 2-6∶ Recombinant plasmid pET32a-E induced with IPTG for 2, 3, 4, 5, 6 h, respectively; 7∶ pET32a (+) /Rosetta induced with IPTG

圖4 pET32a-E表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析圖Fig. 4 The analysis of solubility of pET32a-E expression productsM∶ 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn); 1∶ 重組質(zhì)粒pET32a-E 誘導(dǎo)菌裂解上清; 2∶ 重組質(zhì)粒pET32a-E 誘導(dǎo)菌裂解沉淀M∶ Protein Marker; 1∶ Supernatant of ultrasonicated pET32a-E/ Rosetta after induction; 2∶ Pellets of ultrasonicated pET32a-E/ Rosetta after induction

2.6 間接ELISA方法的建立

2.6.1 重組蛋白抗原最適包被濃度和血清最適稀釋濃度的確定 純化重組蛋白用brandford方法測(cè)定其濃度為0.370 mg/mL。從方陣試驗(yàn)結(jié)果可以看出，pET32a-E 抗原濃度為0.093 μg/孔，血清的稀釋度為1∶100時(shí)，陽性血清的OD490值在1.0左右，且陰性血清的OD490較低，P/N值最高（表1）。因此，我們確定pET32a-E 抗原的最適濃度為0.093 μg/孔，血清的最適稀釋度為1∶100。

圖5 重組蛋白pET32a-E Western blot分析結(jié)果Fig. 5 Western blot analysis of pET32a-E protein M∶ 預(yù)染蛋白Marker ; 1∶ 陰性對(duì)照; 2∶ pET32a-E 蛋白M∶ Protein Marker; 1∶ Negative control; 2∶ pET32a-E protein

表1 重組蛋白抗原最適包被濃度與血清稀釋度的確定Table 1 The optimization of coating concentration with E protein by checkerboard titration

2.6.2 間接ELISA陰、陽性血清臨界值的確定 按照以上確定的ELISA 反應(yīng)條件檢測(cè)34份健康鴨陰性血清，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性對(duì)照。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，40份健康鴨血清OD490值平均數(shù)（）等于0.24，方差（s）等于0.096，“+2s”等于0.432，因此陰、陽性血清臨界值為0.432。

2.6.3 間接ELISA方法的特異性試驗(yàn) 用建立的間接ELISA方法對(duì)GPV、MPV、DHAV-I、DPV和RA陽性血清進(jìn)行測(cè)定，其OD490值分別為0.203、0.144、0.113、0.167、0.11，均小于陰陽性臨界值0.432，見表2。表明重組蛋白pET32a-E均不與GPV、MPV、DHAV-I、DPV和RA陽性血清反應(yīng)，建立的間接ELISA方法具有較好的特異性。

2.6.4 間接ELISA方法的敏感性試驗(yàn) 抗原按最佳包被濃度和條件進(jìn)行包被，將DTMUV陽性血清分別做100、200、400、800、1600、3200、6400、12 800倍稀釋，其他條件按最適反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA測(cè)定。結(jié)果顯示，陽性血清1∶1600稀釋后其OD490值仍大于臨界值0.432，而3200倍之后稀釋的陽性血清OD490值則小于0.432（表3）。

2.6.5 間接ELISA方法的重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)的吸收變異系數(shù)為2.69%～4.32%（表 4），表明同一樣品在同一批試驗(yàn)中變異程度很小，具有良好的重復(fù)性；批間重復(fù)的吸收變異系數(shù)為3.53%～9.73%（表5），其批間變異系數(shù)控制在10%以下，表明同一樣品在同一批試驗(yàn)中變異程度較小，具有較好的重復(fù)性。

2.6.6 間接ELISA方法的臨床應(yīng)用 鴨坦布蘇病毒疫苗滅活疫苗免疫120日齡麻鴨采血，用建立的ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，采血完后用鴨坦布蘇病毒強(qiáng)毒攻毒，4 d后剖檢，檢查卵巢病變情況，試驗(yàn)結(jié)果見表6。當(dāng)抗體效價(jià)ELISA OD490值≥0.821時(shí)，攻毒后卵巢沒有出現(xiàn)病變；當(dāng)抗體效價(jià)ELISA OD490值為0.432～0.821，即可實(shí)現(xiàn)攻毒保護(hù)，攻毒后剖檢至少80%的鴨卵巢沒有出現(xiàn)病變。攻毒對(duì)照組抗體效價(jià)小于0.432時(shí)，攻毒后剖檢蛋鴨卵巢中100%出現(xiàn)病變。本研究建立的間接ELISA方法與攻毒保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果見表7，兩者的陽性符合率為86.67%，陰性符合率為100%。

3 討論

鴨坦布蘇病毒病是從2010年春季在我國(guó)華東地區(qū)出現(xiàn)的一種感染鴨的新病，經(jīng)過病原分離和系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷，確定了病原為鴨坦布蘇病毒，該病主要引起蛋鴨的產(chǎn)蛋下降。DTMUV基因組含有3個(gè)結(jié)構(gòu)基因（C、prM、E）和非結(jié)構(gòu)基因NS。E蛋白是主要的免疫原性蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體。此外，該蛋白可能在病毒粒子的組裝、在病毒入侵過程中介導(dǎo)細(xì)胞的融合等有著重要作用。因此，開展對(duì)DTMUV E蛋白的研究，對(duì)深入了解DTMUV的感染和致病機(jī)理有重要的意義。

表2 間接ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The specifi city test of the indirect ELISA

表3 間接ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The sensitivity test of the indirect ELISA

表4 間接ELISA批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of intra-assay of indirect ELISA

表5 間接ELISA批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of inter-assay of indirect ELISA

表6 鴨坦布蘇病毒滅活疫苗二免120日齡麻鴨后的抗體效價(jià)試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The antibody titer results of 120-day-old duck after the second immunization by Duck Tembusu virus inactivated vaccine

表7 間接ELISA方法與攻毒保護(hù)試驗(yàn)的比較結(jié)果Table 7 The comparison result of indirect ELISA and challenge-protection test

本試驗(yàn)利用RT-PCR方法擴(kuò)增出822 bp的DTMUV E 基因截?cái)嗥?，將其克隆至原核表達(dá)載體pET32a（+），構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET32a-E。結(jié)果表明E蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)，重組蛋白的表達(dá)主要以包涵體的形式存在。Western blot分析表明表達(dá)的E蛋白能與DTMUV陽性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)。此外，原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的E蛋白在用于制備診斷抗原、單克隆抗體以及疫苗等[14-16]方面具有廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)為探索以融合蛋白作為診斷抗原建立DTMUV血清抗體的檢測(cè)方法提供了理論依據(jù)，奠定了良好的基礎(chǔ)。

因此，本研究利用該重組蛋白作為檢測(cè)抗原，建立了間接ELISA抗體檢測(cè)方法。根據(jù)方陣滴定法確定了DTMUV E蛋白ELISA方法的抗原最適包被濃度為0.093μg/孔，血清的最佳稀釋度為1∶100，并確定了其陰、陽臨界值為0.432，通過進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證所建立的間接ELISA方法具有較好的特異性、敏感性和可重復(fù)性。用建立的ELISA方法對(duì)免疫鴨坦布蘇病毒滅活疫苗的鴨血清和對(duì)照鴨血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，同時(shí)與攻毒保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果表明兩者的陽性符合率為86.67%，陰性符合率為100%。綜上所述，本研究所建立的DTMUV間接ELISA抗體檢測(cè)方法具有實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值，可用于檢測(cè)感染DTMUV鴨群的血清抗體，以及監(jiān)測(cè)免疫接種后鴨群的免疫狀況，從而評(píng)估疫苗的免疫效果。

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ESTABLISHMENT OF AN INDIRECT ELISA ASSAY FOR DETECTION OF ANTIBODIES AGAINST DUCK TEMBUSU VIRUS

DONG Jia-wen1, LI Lin-lin1, SUN Min-hua1, ZHANG Jian-feng1, KUANG Rui-huan1, HU Qi-lin2, ZHANG Chun-hong1

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention, Guangdong Open Laboratory of Veterinary Public Health, Institute of Veterinary Medicine, Guangdong Academy of Agriculture Sciences, Guangzhou 510640, China; 2. Institute of Animal Health and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China)

The E gene of Duck Tembusu virus, (DTMUV) JM strain was amplifi ed in RT-PCR and cloned into pET32a (+) vector. The recombinant protein was highly expressed in E. coli Rosseta by induction with IPTG and exhibited a favorable reactivity against the DTMUV antibodies in Western blot. The recombinant protein was used as coating antigen to develop an indirect ELISA. The reaction conditions were optimized and determined to be 0.093μg/well coating antigen of E protein and 1∶100 dilution of antiserum. The intraand inter-assay demonstrated that the coeffi cient of maximum varation was 3.53% and 9.73%. Clinical antiserum samples from vaccinatedducks and non- vaccinated ducks were tested using this ELISA. As compared with vaccination-challenge experiment, the results revealed that the correlation rates of positive serum samples from vaccinates and negtive serum samples from non-vaccinated controls were 86.67% and 100%, respectively.

Duck Tembusu virus ; JM strain; E protein; truncated expression; ELISA

S852.659.6

A

1674-6422（2017）01-0012-07

2016-06-06

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B020307001、2014A040401049、2014A020208052、2015B020203003、2015B070701015、2016A020210049）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201510010250）；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)基金項(xiàng)目（201436、201412）

董嘉文，女，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物疾病研究

胡奇林，E-mail:hql562713@163.com；張春紅，E-mail:13660450420@139.com