侯月娥，伍建敏，李中圣

（廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400）

·研究論文·

PEDV和TGEV雙重TaqMan熒光定量一步法RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

侯月娥，伍建敏，李中圣

（廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400）

本文通過(guò)對(duì)豬腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）基因組生物信息學(xué)分析，分別在兩種病毒基因保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性探針和Real-Time PCR引物，并建立了檢測(cè)PEDV和TGEV的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果表明，本研究建立的方法對(duì)其他常見病毒無(wú)交叉檢出，具有較強(qiáng)的特異性；應(yīng)用本方法對(duì)PEDV和TGEV檢測(cè)靈敏度均可達(dá)101個(gè)拷貝。應(yīng)用本法組裝PEDV和TGEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒批次內(nèi)、批次間的變異系數(shù)CV（coefficient of variation，CV）分別低于0.58%和3.7%。應(yīng)用該試劑盒對(duì)97份病例進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率提高了14.93%。本研究建立的一步法熒光定量RT-PCR方法具有快速、特異性好、靈敏度高、定量且重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在PEDV和TGEV感染的快速鑒別診斷，以及流行病學(xué)調(diào)查方面都有廣闊的應(yīng)用前景。

豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea, P E D）和豬傳染性胃腸炎（t r a n s m i s s i b l e gastroenteritis, TGE）二者均為高度接觸性腸道疾病，主要發(fā)生在冬季和春季等寒冷季節(jié)，主要引起豬的嘔吐、腹瀉、食欲下降和脫水，各年齡段的豬均易感染。其病原分別是豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）和傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV），這兩種病毒均可以破壞小腸上皮細(xì)胞而引起腸絨毛萎縮[1]，對(duì)哺乳仔豬的致死率分別為30%～80%、80%～100%[2-5]。由于二者引起的臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)極為相似，且往往混合感染，單憑臨床癥狀和組織病理學(xué)難以鑒別診斷[5]，近幾年已成為當(dāng)前常見引起豬嚴(yán)重腹瀉的病毒，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV和TGEV兩種病毒的分離、免疫組織化學(xué)和電鏡等常規(guī)的診斷技術(shù)操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)且成本較高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR檢測(cè)方法，應(yīng)用越來(lái)越廣泛[6-11]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR）以及后續(xù)的TaqMan熒光探針技術(shù)，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新一代檢測(cè)方法。將PCR與熒光檢測(cè)方法結(jié)合，不僅特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，需求的樣品量更少，而且還能準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的病毒拷貝數(shù)，在病原診斷及病理分析方面有更為廣闊的應(yīng)用前景。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者也建立了PEDV和TGEV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法[12-14]，但尚未見一步法雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)PEDV和TGEV的報(bào)道。本研究利用TaqMan探針上不同熒光基團(tuán)可以檢測(cè)不同病毒的特點(diǎn)，將傳統(tǒng)的RT-PCR擴(kuò)增兩步法合為一步，建立了能在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)快速檢測(cè)PEDV和TGEV的TaqMan雙重?zé)晒庖徊椒≧T-PCR檢測(cè)方法。該方法不僅大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且也減少了檢測(cè)時(shí)的操作步驟，為快速準(zhǔn)確的掌握這兩種病毒實(shí)際感染情況及預(yù)防控制提供了更加可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株及質(zhì)粒 PEDV、豬瘟病毒（Classical swine faver virus，CSFV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcine circovirus，PCV2）、TGEV、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductine and respiratory synarome virus，PRRSV）均由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院保存；大腸桿菌DH5α和pMD18TM-T Vector購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要試劑及主要儀器 體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒購(gòu)自Axygen公司；Ribonuclease Inhibitor、M-MLV Reverse Transcriptase購(gòu)自Promega公司；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）、αNTP均購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒以及普通質(zhì)粒小量提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（In vitro Transcription T7 Kit）購(gòu)自TaKaRa公司；Bio-rad C1000 熒光定量PCR擴(kuò)增儀；核酸蛋白檢測(cè)儀（Thermo）。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)及合成 通過(guò)對(duì)PDEV和TGEV所有已知序列利用MegAlign進(jìn)行同源性分析，確定其保守序列，然后根據(jù)PEDV（Genbank登錄號(hào): KJ645708）和TGEV（Genbank登錄號(hào):AF209745）的保守核酸序列，利用Beacon Designer 7設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針（表1），其中標(biāo)準(zhǔn)品引物設(shè)計(jì)時(shí)在5' 端引入了T7啟動(dòng)子序列（加粗部分），擴(kuò)增的雙鏈DNA片段可以在T7 RNA聚合酶作用下經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄形成單鏈RNA，純化后用作標(biāo)準(zhǔn)品RNA。引物探針由上海Invitrogen公司合成。

1.4 PEDV和TGEV總核酸提取 參照體液病毒DNA/ RNA小量制備試劑盒說(shuō)明書提取PEDV和TGEV所感染細(xì)胞的總RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PEDV和TGEV標(biāo)準(zhǔn)品制備 取1.4中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。應(yīng)用PEDV引物PEDVT7-F/PEDV-T7-R和TGEV引物TGEV-T7-F/TGEVT7-R（見表1），以上述反轉(zhuǎn)錄的PEDV和TGEV基因組cDNA為模板，分別進(jìn)行PEDV和TGEV目的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出PEDV（166 bp）和TGEV（191bp）目的基因。將獲得的兩者PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化，分別克隆至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒，送Invitrogen公司測(cè)序鑒定。對(duì)于鑒定正確的重組質(zhì)粒，分別命名為pMD-PEDVT7和pMD-TGEVT7[15]。按照大連寶生物公司生產(chǎn)的T7反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，分別以純化后的兩種質(zhì)粒為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。獲得體外轉(zhuǎn)錄RNA，將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNA提取試劑盒純化后，進(jìn)行濃度測(cè)定、拷貝數(shù)計(jì)算，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 TaqMan熒光定量一步法RT-PCR擴(kuò)增 以提取的PEDV和TGEV的核酸RNA為模板，反應(yīng)體系如下: M-MLV Buffer 2 μL、M-MLV 0.25 μL、Ex TaqTMHS 0.3 μL、2.5×dNTP 1.5μL，將引物PEDV-F、PEDV-R、TGEV-F、TGEV-R和探針稀釋至終濃度為0.1～0.6 μmol/mL，模板RNA為1.5 μL，無(wú)RNase的水補(bǔ)足反應(yīng)體系為10 μL。TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量一步法RT-PCR擴(kuò)增程序:37℃孵育5 min，95℃預(yù)變性1 min，然后95℃變性10 s，退火溫度55℃～65℃30 s，40個(gè)循環(huán)。按照不同體系，不同濃度配比，不同的退火溫度進(jìn)行一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，篩選出最好的體系、引物、探針濃度及退火溫度。

1.7 TaqMan熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將1.5制備的PEDV和TGEV的RNA標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，用不同稀釋梯度的RNA作為模板，每個(gè)梯度的RNA設(shè)立3個(gè)重復(fù)。使用摸索出來(lái)的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增。熒光定量RT-PCR的反應(yīng)條件:37℃孵育5 min，95℃預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，退火溫度根據(jù)1.6摸索出來(lái)的最適溫度，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)采集。

1.8 雙重TaqMan熒光定量RT-PCR敏感性、特異性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.8.1 敏感性試驗(yàn) 將測(cè)定好RNA濃度的模板進(jìn)行10倍系列稀釋，用已建立的雙重TaqMan熒光定量RTPCR測(cè)定其敏感性。

1.8.2 特異性試驗(yàn) 分別以提取的PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV核酸RNA以及PCV2、PRV的DNA為模板，分別進(jìn)行RT-PCR/PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。

1.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在上述已經(jīng)稀釋好的樣品中選取1×106copies/μL～1×101copies/μL，進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)，每個(gè)梯度濃度均做3個(gè)重復(fù)，然后比較批次內(nèi)和批次間的變異系數(shù)。

1.9 臨床樣本的檢測(cè)試驗(yàn) 選取經(jīng)過(guò)普通PCR檢測(cè)驗(yàn)證的PEDV和TGEV共同陽(yáng)性、單獨(dú)PEDV陽(yáng)性或TGEV陽(yáng)性，PEDV和TGEV可疑的樣品分別為13份和8份，另外其他病毒也陽(yáng)性的部分樣品，其中動(dòng)物組織31份、血清26份、感染不同代次的細(xì)胞19份，共累計(jì)樣本97份。分別采用該雙重TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行樣品陰陽(yáng)性鑒定，從而驗(yàn)證該方法的靈敏性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備 應(yīng)用含有T7啟動(dòng)子序列的PEDV-T7-F/PEDV-T7-R、TGEV-T7-F/TGEVT7-R的引物分別進(jìn)行相應(yīng)病毒的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。將切膠純化的PCR產(chǎn)物分別與pMD18-T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-PEDVT7和pMD-TGEVT7，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將陽(yáng)性的重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示，兩對(duì)引物均能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段（圖1）。

圖1 PEDV和TGEV陽(yáng)性重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.1 Identifi cation results of PEDV and TGEV positive recombinant plasmidsM∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1∶ TGEV基因的PCR產(chǎn)物; 2∶PEDV基因的PCR產(chǎn)物M∶ DNA Marker(DL2000); 1∶ PCR products of TGEV; 2∶ PCR products of PEDV

2.2 雙重TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增 通過(guò)對(duì)PEDV和TGEV單項(xiàng)和雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的條件優(yōu)化，PEDV-F/PEDV-R的終濃度為0.35 μmol/mL，探針終濃度為0.3 μmol/mL，TGEV-F/TGEV-R的終濃度為0.3 μmol/mL，探針終濃度為0.2 μmol/mL，退火溫度為60℃時(shí)，對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)信號(hào)值最強(qiáng)，Ct值最小。

2.3 雙重TaqMan熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 PEDV和TGEV的熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，其RNA混合液的梯度濃度從1×106copies/μL～1×101copies/μL的6個(gè)線性梯度的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線呈等距性和平行性，具有較好的梯度性（圖2）。

2.4 雙重TaqMan熒光定量PCR特異性、敏感性以及穩(wěn)定性

2.4.1 特異性試驗(yàn) 以PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV、PCV2、PRV的基因組為模板進(jìn)行TaqMan熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，僅有PEDV、TGEV二者相應(yīng)病毒的熒光信號(hào)為陽(yáng)性，其他病毒的檢測(cè)均為陰性，說(shuō)明此次構(gòu)建的雙重TaqMan熒光定量RT-PCR方法的特異性較強(qiáng)（圖3）。

圖2 PEDV(A)和TGEV(B)的Real-time RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Real-time RT-PCR standard curve for PEDV(A) and TGEV(B)

圖3 雙重?zé)晒釸T-PCR體系的特異性檢測(cè)Fig.3 Specifi city test of the Real-time RT-PCR system for PEDV和TGEV detection

2.4.2 敏感性試驗(yàn) 將體外轉(zhuǎn)錄純化后的PEDV和TGEV的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其濃度，計(jì)算其拷貝數(shù)，然后進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，獲得1×106copies/μL～1×101copies/μL，利用本研究建立的一步法PEDV和TGEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量進(jìn)行擴(kuò)增，得到PEDV和TGEV TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線（圖4），在Ct＜40范圍內(nèi)可以檢出的最低RNA量為10 copies/μL，因此建立的此方法敏感性可以達(dá)到10 copies/μL。與本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的檢測(cè)PEDV和TGEV普通PCR及SYBR Green Real-time PCR法相比較，是普通PCR法敏感性的100倍（圖5），SYBR Green Real-time PCR敏感性的10倍，并且檢測(cè)結(jié)果較SYBR Green Real-time PCR法方法穩(wěn)定。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 熒光定量RT-PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度從1×106copies/μL～1×101copies/μL的6個(gè)濃度，通過(guò)每一個(gè)濃度樣本的3次重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定的Ct值來(lái)檢驗(yàn)該方法的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，同批內(nèi)的變異系數(shù)分別為0.05%、0.58%、0.16%、0.09%、0.41%、0.32%；批間的變異系數(shù)分別為1.8%、2.7%、3.3%、2.4%、3.2%、3.7%（表2）。將混合好的標(biāo)準(zhǔn)品存放于-80℃，1個(gè)月后重復(fù)檢測(cè)結(jié)果依然可信，驗(yàn)證了該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

圖4 熒光定量RT-PCR體系的敏感性檢測(cè)Fig.4 Sensitivity of the Real-time RT-PCR for PEDV and TGEV detection注∶ PEDV (a至f) 和 TGEV (1至6)模板拷貝數(shù)依次∶ 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×10Note∶ PEDV (a to f) and TGEV (1 to 6), and the number of copies were 1×106, 1×105, 1×104, 1×103, 1×102and 1×10 copies，respectively

表2 PEDV和TGEV雙重?zé)晒舛縋CR重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Repetitive and stability verifi cation of PEDV and TGEV duplex fl uorescence quantitative PCR

圖5 普通RT-PCR PEDV和TGEV標(biāo)準(zhǔn)品敏感性檢測(cè)Fig.5 Sensitivity test of the normal PCR for PEDV and TGEV注∶ PEDV(1至7)和TGEV(8至13)拷貝數(shù)依次為∶ 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10; 14∶ 陰性對(duì)照; M∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)Note∶ PEDV(1 to 7) and TGEV(8 to 14), and the number of copies were 1×106, 1×105, 1×104, 1×103, 1×102, 1×10 copies, respectively; 14∶ Negative; M∶ DNA Marker(DL2000 )

2.5 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果 對(duì)76份普通PCR鑒定的已知臨床病料和21份可疑臨床病料進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示，PEDV和TGEV共同陽(yáng)性7份，病毒拷貝數(shù)在3.1×103～9.7×107copies/μL（超過(guò)以及等于106copies/μL的樣品，均102倍稀釋后再次檢測(cè)），感染率為7.2%；單PEDV陽(yáng)性的47份，病毒拷貝數(shù)為1.3×101～9.1×109copies/μL，感染率為48.45%；單TGEV陽(yáng)性13份，病毒拷貝數(shù)為1.5×101～7.5×107copies/μL，感染率為13.4%；21份可疑的病料檢測(cè)結(jié)果顯示，感染PEDV的7份，感染TGEV的3份，其他樣品為陰性，與已知樣品結(jié)果的符合率為114.93%。

3 討論

PEDV和TGEV作為豬病毒性腹瀉的主要病原，近年來(lái)引起的豬病毒性腹瀉在國(guó)內(nèi)外的各大豬場(chǎng)反復(fù)爆發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前常規(guī)的病毒診斷方法有病毒分離、熒光抗體檢測(cè)、血清學(xué)診斷方法和免疫組織化學(xué)以及PCR方法等，由于病毒分離困難，PCR方法具有快速、特異、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)己經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的快速診斷。上述診斷方法在特異性上尚存在一定的缺陷，在敏感性方面對(duì)早期感染往往不能做出準(zhǔn)確的判定。單一的RT-PCR方法用于多種病毒感染的臨床鑒別診斷時(shí)，不能一次達(dá)到目的，并且因?yàn)樾枰獙?duì)不同檢測(cè)病毒分別進(jìn)行擴(kuò)增，樣品需求量較大，耗時(shí)較長(zhǎng)。疾病的嚴(yán)重程度與病毒的含量相關(guān)，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法很難準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的病毒含量，因此實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法不僅在定量研究中具有重要意義，而且在檢測(cè)病毒存在及其在疾病發(fā)展過(guò)程中病毒對(duì)機(jī)體持續(xù)性作用方面的也起重要作用[16]。

PEDV和TGEV多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的文獻(xiàn)已有陸續(xù)的報(bào)道[17]，而一步法PEDV和TGEV雙重TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法目前沒(méi)有報(bào)道。本研究建立方法存在顯著優(yōu)勢(shì):不需要反轉(zhuǎn)錄，提取的RNA可以直接做為模板檢測(cè)，并能一次確診單一感染或混合感染，可以準(zhǔn)確得知兩種病毒在疾病感染中拷貝數(shù)的變化情況，達(dá)到診斷、鑒別和定量的多重目的，比傳統(tǒng)檢測(cè)方法更準(zhǔn)確便快捷。

本研究對(duì)PEDV和TGEV分別設(shè)計(jì)1條探針和與探針匹配的2對(duì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化單項(xiàng)試驗(yàn)選取與探針匹配更好的一對(duì)特異性引物，然后再對(duì)多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。將提取的PRRSV、CSFV、PEDV、TGEV核酸RNA以及PCV2、PRV的DNA模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，僅有目的曲線擴(kuò)增，其余均為陰性，說(shuō)明具有良好的特異性。敏感性試驗(yàn)的結(jié)果顯示可以檢出的最低RNA量可達(dá)到101copies/μL，R2＞99%，具有較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系。與常規(guī)的RT-PCR反應(yīng)和已構(gòu)建的SYBR Green方法比較，是普通RT-PCR的100倍，已構(gòu)建的SYBR Green方法的10倍。穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果顯示批次內(nèi)的變異系數(shù)≤0.58%，批次間的變異系數(shù)均≤3.7%，說(shuō)明該方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法只需要較少的樣品就可以對(duì)PEDV和TGEV進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量檢測(cè)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法在重復(fù)性和耗時(shí)長(zhǎng)的不足，同時(shí)具有較高的特異性，可以避免臨床樣品中其他病原的干擾。臨床發(fā)病中PEDV和TGEV二者混合感染比例較高，且在腹瀉病例中占較高的比例，本研究所建立的方法適用于臨床PEDV和TGEV的快速檢測(cè)診斷及病理分析。

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DEVELOPMENT OF ONE STEP DUPLEX TAQMAN REAL-TIME PCR ASSAY FOR DETECTION OF PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS AND TRANSMISSIBLE GASTROENTERITIS VIRUS

HOU Yue-e, WU Jian-min, LI Zhong-sheng

(Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry & Veterinary, Guangzhou 511400, China)

In the present study, one step duplex TaqMan fl uorescent real-time RT-PCR assay of PEDV and TGEV was developed to detect and differentiate Porcine epidemic diarrhea virus, (PEDV) and Transmissible gastroenteritis virus, (TGEV). The specifi c primers and TaqMan fl uorescent probes of these viruses were designed based on the bio-information analysis and then the amplifi cation condition and the concentration of each virus were optimized. The result showed that the detection limits were 101copies for both PEDV and TGEV and there was no cross reaction with other common viruses. Subsequently, one step Duplex TaqMan Real-time PCR assay was assembled into the PEDV and TGEV Detection Kit. The inter and intra-assay trials demonstrated that the variations were less than 0.58% and 3.7%, respectively, indicating its good reproducibility. Total 97 samples were examined using this kit and the positive rate of PEDV and TGEV was 14.93% higher than the current PCR method. These results demonstrated that this assay was a rapid, specifi c and sensitive method for detection of PEDV and TGEV. In conclusion, the method established in the present study can be used for rapid detection and epidemiology study of PEDV and TGEV.

Porcine epidemic diarrhea virus; Transmissible gastroenteritis virus; duplex TaqMan real-time RT-PCR

S852.659.6

A

1674-6422（2017）01-0019-07

2016-05-03

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目——豬偽狂犬突變株的鑒定及新型、高效豬偽狂犬疫苗開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化（2015B020203006）

侯月娥，女，碩士，主要從事畜禽和水產(chǎn)疫病及病疫防治技術(shù)方面的研究

李中圣，E-mail:Lizs@haid.com.cn