陳 寧，王 平，程 田，龔振興，謝天柱，李俊鵬，張延忠，王曉煒，魯 藝

（1. 深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，深圳 518057；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046；4.深圳市瑞鵬寵物醫(yī)院，深圳 518000）

·研究論文·

鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因的克隆與序列分析

陳 寧1，王 平1，程 田2，龔振興3，謝天柱1，李俊鵬1，張延忠4，王曉煒1，魯 藝1

（1. 深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，深圳 518057；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046；4.深圳市瑞鵬寵物醫(yī)院，深圳 518000）

為獲得鼠隱藏管狀線蟲（Syphacia obvelata）烯醇化酶結(jié)構(gòu)及其功能，采用同源克隆方法結(jié)合RACE技術(shù)克隆獲得了烯醇化酶基因cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得的鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因大小序列為1603 bp，包含全長(zhǎng)為1311 bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列，共編碼436個(gè)氨基酸，推導(dǎo)分子量為47.428 kDa。序列分析結(jié)果顯示，鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶含有10個(gè)絲氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)蘇氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)潛在的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，無信號(hào)肽剪切位點(diǎn)；在亞細(xì)胞水平，預(yù)測(cè)其主要定位于胞漿；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其中α-螺旋占34.86%，無規(guī)則卷曲占30.50%，延伸鏈占24.08%，β-轉(zhuǎn)角占10.55%。Swiss-Model模建的3D結(jié)構(gòu)顯示，鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶為一“啞鈴”樣結(jié)構(gòu)，包含氨基端和羧基端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域之間為L(zhǎng)inker區(qū)。每個(gè)結(jié)構(gòu)域由多個(gè)α-螺旋、β-折疊和卷曲所構(gòu)成桶形結(jié)構(gòu)，催化中心和Mg2+結(jié)合位點(diǎn)位于桶形結(jié)構(gòu)的中心。本研究結(jié)果為鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

鼠隱藏管狀線蟲；烯醇化酶；克??；生物信息學(xué)分析

鼠隱藏管狀線蟲（Syphacia obvelata）又稱鼠蟯蟲，是寄生于嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)最普遍的寄生蟲之一，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康、抗體制備以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果等影響巨大[1]。與其他寄生蟲相似，鼠隱藏管狀線蟲缺少典型的或僅具有不完整的有氧氧化途徑，也不能利用脂肪酸和蛋白質(zhì)進(jìn)行供能，糖酵解代謝（glycolysis metabolism）是其獲取能量最重要的途徑。烯醇化酶（enolase）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶之一，主要功能為催化2-磷酸-D-甘油酸生成磷酸烯醇丙酮酸。烯醇化酶廣泛存在于各種寄生蟲中，結(jié)構(gòu)具有高度保守性，在寄生蟲生化代謝途徑中發(fā)揮重要功能，還能與細(xì)胞骨架蛋白和多聚核苷酸結(jié)合[2]，并可參與寄生蟲的入侵[3]、調(diào)節(jié)寄生蟲的生長(zhǎng)發(fā)育[4]及免疫保護(hù)[5,6]等。截至目前，鼠隱藏管狀線蟲的烯醇化酶研究尚無相關(guān)報(bào)道，因此，本研究通過對(duì)鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶編碼基因的克隆和序列分析，為其功能的進(jìn)一步研究以及探索烯醇化酶在鼠隱藏管狀線蟲病的診斷、藥物及疫苗研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲種、工具酶與試劑 鼠隱藏管狀線蟲為本實(shí)驗(yàn)室保種；DNA Marker（DL 2000）、瓊脂糖（Agarose）、膠回收試劑盒 ( Agarose Gel DNA Extraction Kit)、pMD18-T Vector 連接試劑盒、E.coli Competent Cells DH5α購自大連寶生物公司；DNA 聚合酶(DNA Taq)、RNA提取試劑盒(RNA Extraction Kit)、dCTP、PrimeScript RT reagent Kit、SMARTScribe TM Reverse Transcriptase 購自大連TaKaRa 公司；5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0 試劑盒、SUPERSCRIPT II RT購自美國(guó) Invitrogen 公司；3' SMARTer TM RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒購自美國(guó) Clontech 公司；PCR引物合成與測(cè)序均由深圳華大基因有限公司合成。

1.2 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶全長(zhǎng) cDNA 序列的克隆

1.2.1 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因 EST 序列的獲得 利用RNA 提取試劑盒提取鼠隱藏管狀線蟲總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA質(zhì)量。依據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫中已知的豬蛔蟲（ADQ00605.1）、異尖線蟲（AJ496792.1）、馬來布魯線蟲（XM_001896246.1）、旋盤尾絲蟲（AF532606.1）、旋毛蟲（AF363629.1）和秀麗新桿線蟲（NM_001027178.2）烯醇化酶基因設(shè)計(jì)了5對(duì)引物。F1:5'-GAGGCAATGCGTATGGGTTC -3'，R1:5'-GATGCGAAACCATTACTCCCC-3'。獲得烯醇化酶基因的 EST 序列，測(cè)序并鑒定比對(duì)。

1.2.2 5'RACE 和3'RACE技術(shù)獲得烯醇化酶的全長(zhǎng)序列 根據(jù)獲得的已知片段序列和5'RACE、3' RACE 的要求設(shè)計(jì)引物，引物由華大基因合成。5'端序列是由用SUPERSCRIPT II RT 酶和引物GSP1∶5'-CCATCCCTATTGACAC-3' 對(duì)總RNA進(jìn)行目的基因第一鏈cDNA的合成，在其末端加上多聚 C；使用引物GSP2∶ 5'-GTGTATCCGGCTAGAGCAAT-3' 和橋連錨定引物 AAP 進(jìn)行 PCR 第 1 輪擴(kuò)增，再使用引物GSP3:5'-CCAATCCTTCCTTGTTGTCTT-3' 和橋連通用擴(kuò)增引物 AUAP 進(jìn)行巢式 PCR；PCR 產(chǎn)物純化后進(jìn)行T克隆、轉(zhuǎn)化和PCR鑒定，對(duì)PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序分析。

3'RACE 是利用引物3'CDS primer A 對(duì)總 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；用引物 3'P1∶5'-TGGCAGAAGTTCCACTCCAACACGC-3'和UPM 對(duì) cDNA 模板進(jìn)行第1 輪 PCR 擴(kuò)增；然后用引物 3' P2:5'-AACCCTAAACGCATTCAAATGGCAA -3'和 UPM 進(jìn)行第 2輪 PCR 擴(kuò)增；膠回收PCR產(chǎn)物，T克隆、轉(zhuǎn)化和PCR鑒定后對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。將5'RACE和3'RACE擴(kuò)增獲得的序列重疊拼接，獲得烯醇化酶基因的cDNA序列，并進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證引物Eno-F1∶ 5'-CGGGA TCCATGCCAATTACAAAAATTC-3'和Eno-R1∶5'-CCGCTCGAGTCGCTTGAGGGT TGCGGA-3'。

1.3 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因的生物信息學(xué)分析 根據(jù)烯醇化酶基因的克隆結(jié)果，利用 NCBI 中的 ORF Finder（http∶/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html）預(yù)測(cè)烯醇化酶基因的開放閱讀框，從而推導(dǎo)其氨基酸順序；利用ProtParam在線軟件(http∶/ / web.expasy.org/protparam/)分析其基本理化性質(zhì)；利用NCBI數(shù)據(jù)庫，BLAST搜索其他物種的烯醇化酶序列，利用在線比對(duì)分析軟件http∶//www.ebi.ac.uk/ tools/clustalW進(jìn)行比對(duì)分析。利用在線工具對(duì)鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因的親疏水性、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因的全長(zhǎng)cDNA克隆及驗(yàn)證 利用5'RACE 和3'RACE技術(shù)對(duì)烯醇化酶基因分別擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得5'和3'端的序列，分別為840 bp（圖1A）和607 bp（圖1B），拼接后獲得全長(zhǎng)為1603 bp的cDNA序列，其全長(zhǎng)ORF序列為1311 bp（圖1C），推導(dǎo)其編碼436個(gè)氨基酸。

圖1 烯醇化酶基因5' RACE、3' RACE和ORF序列的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR-amplifi ed enolase gene from S.obvelataM∶ DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); A∶ 5'RACE的PCR產(chǎn)物; B∶ 3'RACE的PCR產(chǎn)物; C∶ ORF序列M∶ DNA Marker(DL2000); A∶ PCR products of 5'RACE; B∶ PCR products of 3'RACE; C∶ PCR products of ORF

2.2 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因理化性質(zhì)及氨基酸序列分析

2.2.1 基因理化性質(zhì)分析 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因核苷酸序列經(jīng)在線ProtParam軟件分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼436個(gè)氨基酸（圖2），蛋白分子量為47.428 kDa，含有48個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸（K、R），55個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸（D、E），161個(gè)疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V），95個(gè)極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y），等電點(diǎn)為5.93，pH值為7.0時(shí)的靜電荷為-5.165。

在組成鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因蛋白的20種氨基酸中，丙氨酸(Ala)所占比例最高，達(dá)到 10.6%。而半胱氨酸和色氨酸含量最低，為5%和4%，負(fù)電荷氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）56個(gè)，正電荷氨基酸殘基（精氨酸和賴氨酸）49 個(gè)。烯醇化酶編碼多肽的原子組成為C2096H3330N578O643S16。烯醇化酶的不穩(wěn)定系數(shù)是37.81，由此說明該蛋白是一個(gè)較穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為85.96，總平均親水性為-0.269，說明該蛋白的疏水性較強(qiáng)。

2.2.2 氨基酸序列同源性分析 利用NCBI的BLAST搜索與鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶具有同源性的其他物種的氨基酸序列，并用在線工具h(yuǎn)ttp∶//www.ebi.ac.uk/ tools/clustalW 將烯醇化酶與其他物種（白紋伊蚊（KXJ70801.1）、馬來布魯線蟲（AHI18146.1）、秀麗新桿線蟲（NP_001022349.1）、鉤口線蟲（EYB81234.1）、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（CDJ96217.1））的烯醇化酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。紅色框線標(biāo)識(shí)出烯醇化酶的保守motif區(qū)域，其中aa343～356“LLLKVNQIGSVTES”為烯醇化酶的基因標(biāo)簽位點(diǎn)，藍(lán)色框線標(biāo)識(shí)出酶結(jié)合位點(diǎn)，綠色框線標(biāo)識(shí)出酶活性位點(diǎn)（圖3）。

圖2 烯醇化酶全長(zhǎng)cDNA序列及其ORF編碼的氨基酸序列Fig. 2 Full-length cDNA sequence of enolase and the amino acid sequence encoded by ORF

2.3 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因的信號(hào)肽、疏水性和跨膜區(qū)分析 利用在線工具h(yuǎn)ttp∶//www.expasy. ch/tools/protscale.html對(duì)鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶蛋白的疏水性進(jìn)行分析（圖4），發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白的氨基酸殘基疏水性最大值為2.8，氨基酸序列內(nèi)含有較多的疏水區(qū)域，表明該基因編碼蛋白可能為疏水性蛋白。結(jié)合其疏水性、脂肪系數(shù)與總平均親水性來綜合分析，可以判定鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶是一個(gè)疏水性蛋白。同時(shí)我們也用在線分析軟件SignalP 3.0（http∶//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）分析信號(hào)肽序列，發(fā)現(xiàn)鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶不含信號(hào)肽序列。利用在線軟件https∶//www. predictprotein.org/ 進(jìn)行跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn)在aa108～125有一個(gè)潛在的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（圖5）。

2.4 結(jié)構(gòu)和功能域分析 用在線軟件InterPro scan http∶//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html掃描一級(jí)結(jié)構(gòu)中包含的結(jié)構(gòu)和功能域特征序列（圖6），其蛋白質(zhì)序列中含有烯醇化酶的典型結(jié)構(gòu)域和保守位點(diǎn)，包含氨基端（aa3～138）和羧基端（aa128～434）兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，并含有烯醇化酶aa343～356的保守位點(diǎn)。

2.5 模體（Motif）分析 利用在線軟件http∶//myhits. isb-sib.ch/cgi-bin/Motif_scan對(duì)鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因的Motif結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白有6個(gè)保守的Motif結(jié)構(gòu)，這些都與烯醇化酶的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)，見圖7。

2.6 潛在磷酸化位點(diǎn)分析 根據(jù) NetPhos2.0 http∶// www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/對(duì)鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶中絲氨酸激酶、蘇氨酸激酶與酪氨酸激酶的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析（圖8），結(jié)果顯示，該烯醇化酶含有10個(gè)絲氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（第14、105、177、241、271、294、352、356、365、376 位氨基酸）、3個(gè)蘇氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（第 41、88、237 位氨酸）和4個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（第12、131、189、252位氨基酸），可能成為相應(yīng)蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)，烯醇化酶可能通過相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化修飾來實(shí)現(xiàn)對(duì)其功能的調(diào)控。

2.7 亞細(xì)胞定位分析 利用亞細(xì)胞定位分析軟件PSORT http∶//psort.hgc.jp/form.html對(duì)鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析（表1），預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該基因主要定位于胞質(zhì)中。

2.8 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用SOPMA https∶//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ secpred_ sopma.pl對(duì)鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖9所示，上行為氨基酸序列，下行為其所對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中 h 代表α-螺旋（alpha helix）、e代表延伸鏈（extended strand）、t 代表 β-轉(zhuǎn)角（beta turn）、c代表無規(guī)則卷曲（randomcoil）。預(yù)測(cè)結(jié)果表明烯醇化酶二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中，h占34.86%，e占24.08%，t占10.55%，c占30.50%。

圖3 烯醇化酶氨基酸序列比對(duì)分析Fig. 3 Amino acid sequence alignment of enolase using Clustal W

圖4 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因疏水性分析Fig. 4 Hydrophobicity analysis of enolase from S.obvelata

圖5 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶跨膜雙螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Transmembrane helices prediction for enolase from S.obvelata

圖6 烯醇化酶的功能結(jié)構(gòu)域Fig.6 The domains of enolase

圖7 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因的Motif分析Fig.7 Motif analysis of enolase from S.obvelata1∶ N端糖基化位點(diǎn); 2∶ 酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn); 3∶ 十四?；稽c(diǎn); 4∶ 蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn); 5∶ 酪氨酸磷酸化位點(diǎn); 6∶ 烯醇化酶1∶ ASN glycosylation site; 2∶ CK2 phosphorylation site; 3∶ Myristyl; 4∶ PKC phosphorylation site; 5∶ TYR phosphorylation site; 6∶ Enolas

圖8 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶基因磷酸化位點(diǎn)分析Fig.8 Phosphorylation site analysis on enolase of Syphacia obvelata

表1 由PSORT Prediction預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞定位Table1 Subcellular localization of enolase predicted by PSORT prediction program

圖9 烯醇化酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Secondary structure prediction of enolase from S.obvelata

2.9 鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用Swiss-Model http∶//swissmodel. expasy.org/對(duì)鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶編碼氨基酸的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶三級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)啞鈴樣，由linker連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域是由一個(gè)小的N端和一個(gè)大的C端組成，多個(gè)α-螺旋、β-折疊和卷曲所構(gòu)成的桶形結(jié)構(gòu)，有4個(gè)Mg2+結(jié)合位點(diǎn)和2個(gè)磷酸根結(jié)合位點(diǎn)，并位于桶形結(jié)構(gòu)的中心（圖10）。紅色圓圈出部分即是兩個(gè)催化中心，兩邊兩個(gè)綠色點(diǎn)代表4個(gè)Mg2+結(jié)合位點(diǎn)，棒狀三角錐結(jié)構(gòu)代表磷酸根結(jié)合位點(diǎn)。

圖10 鼠隱藏管狀線蟲三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.10 3D structure of enolase in S.obvelata

3 討論

烯醇化酶作為生物體內(nèi)廣泛存在的一種古老而又高度保守的基因，近幾年漸漸成為研究的熱門，目前在寄生蟲領(lǐng)域研究比較多的是原蟲，包括瘧原蟲[7,8]、弓形蟲[9]、利氏曼原蟲[10]、錐蟲[10]等；線蟲有豬蛔蟲[6]、廣州管圓線蟲[11]、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲[12]等；絳蟲有細(xì)粒棘球蚴絳蟲[13]、牛帶絳蟲[14]、亞洲帶絳蟲[15]等及吸蟲[16]。

本研究采用RACE技術(shù)獲得了長(zhǎng)為1603 bp的鼠隱藏管狀線蟲的烯醇化酶基因序列，含有一個(gè)長(zhǎng)度為1311 bp的完整ORF，預(yù)計(jì)編碼436個(gè)氨基酸，蛋白分子量為47.428 kDa。經(jīng)NCBI網(wǎng)站Blast在線分析，我們所獲的基因序列與 GenBankTM中豬蛔蟲和弓首蛔蟲Enolase基因最接近，推測(cè)為鼠隱藏管狀線蟲Enolase基因，并含有完整的開放閱讀框，是一個(gè)全長(zhǎng) cDNA 序列。

鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶的信號(hào)肽和疏水性分析表明，烯醇化酶編碼的氨基酸序列中沒有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，疏水性較強(qiáng)。通過對(duì)其功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)含有烯醇化酶的典型結(jié)構(gòu)域和保守位點(diǎn)?？缒るp螺旋結(jié)構(gòu)分析顯示有一個(gè)潛在的跨膜雙螺旋結(jié)構(gòu)（aa108～125），這與Gan等[13]的研究結(jié)果一致。Gan等[13]在獲得細(xì)粒棘球絳蟲烯醇化酶全長(zhǎng)序列后預(yù)測(cè)其氨基酸序列中含有一段跨膜區(qū)（aa104～124），并對(duì)絳蟲烯醇化酶的免疫學(xué)特性分析，發(fā)現(xiàn)該酶含有大量線性B細(xì)胞表位和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）表位。在這些表位中有2個(gè)重要肽段，即aa49～aa57和aa228～aa 236。這兩個(gè)肽段均同時(shí)含有B細(xì)胞和CTL表位，分別位于跨膜區(qū)的兩側(cè)，能刺激體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。無論這種蛋白質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如何變化，它均可介導(dǎo)絳蟲對(duì)宿主的免疫刺激作用，說明烯醇化酶具有較好的免疫診斷和疫苗應(yīng)用前景。

Motif 是指蛋白質(zhì)或 DNA 序列中局部的保守區(qū)域，或者是一個(gè)序列集中共有的一小段序列模式，也譯為基序。一個(gè)蛋白質(zhì)家族所有的或大多數(shù)的成員共同擁有的Motif極可能是該家族執(zhí)行重要功能或組成結(jié)構(gòu)不可缺少的部分。識(shí)別出一個(gè)蛋白質(zhì)家族共同的Motif就能夠刻畫該蛋白質(zhì)家族特征，從而可以利用這些特征來發(fā)掘蛋白家族新成員等[17]。通過鼠隱藏管狀線蟲烯醇化酶包括該蛋白motif結(jié)構(gòu)以及保守區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白高度保守，且有6種Motif結(jié)構(gòu)，分別是N端糖基化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、十四酰化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和烯醇化酶保守結(jié)構(gòu)域。對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)有10個(gè)絲氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)蘇氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，可能成為相應(yīng)蛋白激酶磷酸化的位點(diǎn)，說明烯醇化酶可能通過相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化來實(shí)現(xiàn)其功能的調(diào)控。

作為重要的糖酵解催化酶，烯醇化酶存在于很多真核和原核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞表面，如植物乳桿菌[18]、炭疽桿菌[19]，瘧原蟲[7,8]，利士曼原蟲[20]、日本血吸蟲[16]，盡管它不具備經(jīng)典表面蛋白所擁有的信號(hào)肽，跨膜區(qū)等特點(diǎn)，但它還是能夠在細(xì)胞表面表達(dá)，而且能在豬蛔蟲的排泄/分泌物（ES）中被檢測(cè)出來[21]。

本研究用PSORT軟件亞細(xì)胞定位結(jié)果預(yù)測(cè)，表明烯醇化酶主要存在于細(xì)胞質(zhì)，其次在過氧化物酶體，線粒體基質(zhì)間隙和溶酶體上。研究表明，烯醇化酶屬于一種新類型的表面蛋白，不具有表面蛋白的典型的表面轉(zhuǎn)運(yùn)功能，但可以通過一種未知的機(jī)制，被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面[22]。分布在表膜的蛋白有可能成為藥物的靶分子，或是診斷抗原的候選分子。

Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)廣州管圓線蟲烯醇化酶并不像預(yù)期所示存在于蟲體表皮和真皮層中，而是大多存在于細(xì)胞質(zhì)，如壁肌肉、生殖道、神經(jīng)環(huán)和消化道中，這與本研究預(yù)測(cè)的烯醇化酶主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的發(fā)現(xiàn)一致。同時(shí)，Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，廣州管圓線蟲烯醇化酶也能在細(xì)胞核表達(dá)，表明它可能參與機(jī)體生長(zhǎng)和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，可能參與其他的生物功能，而不是作為纖溶酶原的受體或者分泌性抗原組分。Ghosh等[7]發(fā)現(xiàn)烯醇化酶存在于瘧原蟲生命周期的每一個(gè)階段。除了細(xì)胞質(zhì)之外，烯醇化酶還與細(xì)胞核、食物泡、細(xì)胞骨架和離子體膜形成有關(guān)。烯醇酶的多樣化定位表明，除了在糖酵解的催化作用之外，烯醇化酶可能參與許多其他生物機(jī)體的調(diào)節(jié)功能。

基于烯醇化酶在病原體物質(zhì)與能量代謝、生長(zhǎng)發(fā)育及其與免疫保護(hù)等方面的重要性，研究分析烯醇化酶的亞細(xì)胞定位和生物信息學(xué)功能預(yù)測(cè)，將有助于進(jìn)一步了解鼠隱藏管狀線蟲的入侵機(jī)制、致病機(jī)理、能量代謝等，為鼠隱藏管狀線蟲病的預(yù)防、免疫診斷和藥物研發(fā)等提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)。

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CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF ENOLASE GENE IN SYPHACIA OBVELATA

CHEN Ning1, WANG Ping1, CHENG Tian2, GONG Zhen-xing3, XIE Tian-zhu1, LI Jun-peng1, ZHANG Yan-zhong4, WANG Xiao-wei1, LU Yi1

(1.Shenzhen Institute for Drug Control, Shenzhen 518057, China; 2. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3. Lanzhou Veterinary Research Institute, CAAS, Lanzhou 730046, China; 4. Shenzhen Ruipeng Pet Hospital, Shenzhen 518000, China)

To learn the structure and function of the enolase gene of Syphacia obvelata, we fi rst obtained the full-length cDNA of enolase by using homology-based cloning together with RACE technology. The cDNA sequence was then analyzed by bioinformatics databases and software. The full-length cDNA of enolase was 1611 bp in length, with a coding region of 1311 bp. This sequence encoded a protein of 436 amino acids with a molecular weight of 47.428 kDa. The enolase contained ten serine phosphorylation sites，three threonine phosphorylation sites，four tyrosine phosphorylation sites and a potential transmembrane helices region, but no signal peptide was found in the protein. At the subcellular level, the enolase protein was mainly localized to the cytoplasm, peroxisome, mitochondrial matrix space and lysosome. The secondary structure of enolase was mainly composed of alpha helix, consisting of 34.86% helix, 30.50% random coil,24.08% extended strand, and 10.55% beta turn. Swiss-Model modulated predicted that 3D structure was like dumbbell with a linker in the middle, each substrate unit was comprised of alternatively arranged α helix-β sheet and forms a barrel, the active sites, Mg2+binding sites closely located in the center of barrel. By cloning the enolase gene and predicting its structure, character and functions，we have obtained valuable information which can be used to study the relationship between parasite and host in the future.

Enolase; Syphacia obvelata; cloning; bioinformatics analysis

S852.731

A

1674-6422（2017）01-0050-09

2016-04-19

深圳市科技研發(fā)資金知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（JCYJ20130402144215888）

陳寧，女，博士，主要從事藥理毒理學(xué)及寄生蟲病的防控

陳寧，E-mail∶ cn82cn@163.com