梁素蕓，聞治國，謝 明，黃 葦，侯水生*，李復(fù)煌

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193 2. 北京市畜牧總站，北京 100107）

綠頭野鴨蛋品質(zhì)研究及蛋殼強(qiáng)度相關(guān)基因的篩選

梁素蕓1，聞治國1，謝 明1，黃 葦1，侯水生1*，李復(fù)煌2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193 2. 北京市畜牧總站，北京 100107）

本試驗(yàn)選取體重、周齡一致的100只綠頭野鴨，對(duì)其蛋品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行相關(guān)分析，測(cè)定指標(biāo)包括蛋殼顏色、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋形指數(shù)、蛋白高度、哈氏單位和蛋黃顏色，同時(shí)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選了與蛋殼強(qiáng)度相關(guān)的候選基因。結(jié)果表明：不同蛋殼顏色的鴨蛋之間蛋形指數(shù)、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋白高度和哈氏單位有顯著差異（P<0.05）；綠頭鴨大部分蛋品質(zhì)性狀之間相關(guān)性顯著，其中蛋殼厚度與蛋殼強(qiáng)度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.8742，而蛋殼顏色作為蛋殼強(qiáng)度的衡量指標(biāo)時(shí)，白殼組強(qiáng)度最大，綠殼組次之，黃綠殼組最?。≒<0.01）；通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Φ皻?qiáng)度進(jìn)行差異表達(dá)模式對(duì)比分析，共找到差異表達(dá)基因325個(gè)，其中149個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)， 176個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)，與蛋殼強(qiáng)度相關(guān)的基因有CACNA1I、CACNB4、CALN、CACNA1S、LOC101801793等17個(gè)基因,這些基因主要參與了鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣離子結(jié)合、鈣離子釋放等生物學(xué)過程，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究蛋殼強(qiáng)度差異的分子機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

綠頭野鴨；蛋品質(zhì)；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；基因篩選

禽蛋品質(zhì)直接關(guān)系到禽蛋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和人類的健康生活，蛋殼的破損會(huì)給禽蛋產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失[1]，因此蛋殼質(zhì)量在整個(gè)蛋品質(zhì)中至關(guān)重要。禽類的品種和產(chǎn)蛋年齡[2-4]、攝入的營養(yǎng)[5]、產(chǎn)蛋環(huán)境[6]以及蛋在子宮中的時(shí)間長短都會(huì)對(duì)蛋殼強(qiáng)度造成影響[7]，而蛋殼的結(jié)構(gòu)屬性（蛋殼厚度）和物質(zhì)屬性（超微結(jié)構(gòu)）可能是蛋殼強(qiáng)度出現(xiàn)差異的主要原因[8]。蛋殼顏色一直作為衡量蛋殼強(qiáng)度的一種重要指標(biāo)[9]，研究發(fā)現(xiàn)綠殼蛋的蛋殼主要由膽綠素和膽綠素鋅螯合物2種色素組成[10-11]，綠殼蛋的藍(lán)綠色度與蛋殼中膽綠素的濃度呈顯著相關(guān)[12-13]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，在雞產(chǎn)蛋過程中，子宮部位基因的表達(dá)會(huì)影響蛋殼質(zhì)量，禽類卵清蛋白基因（OVAL）、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶基因家族（ATP2家族）[14]、鈣離子通道上皮亞基家族（SCNN1家族）[15]等基因均被發(fā)現(xiàn)與蛋殼強(qiáng)度的差異形成有關(guān)。而水禽子宮組織基因表達(dá)是否影響蛋殼質(zhì)量，目前未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以綠頭鴨為研究對(duì)象，對(duì)蛋品質(zhì)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，并對(duì)蛋殼強(qiáng)度相關(guān)基因進(jìn)行篩選，為蛋鴨分子育種提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用的綠頭野鴨均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)基地。選取健康、體重、周齡大小一致的母鴨100只，每只鴨均單籠飼養(yǎng)，營養(yǎng)水平一致，自由采食，最后收集300枚蛋用于測(cè)定蛋品質(zhì)。挑選高低2個(gè)蛋殼強(qiáng)度組的蛋鴨各2只，采集子宮組織樣品，迅速置于液氮中冷卻，保存于-80℃超低溫冰箱，用于總RNA的提取。

1.2 蛋品質(zhì)測(cè)定指標(biāo)與方法 利用 QCR測(cè)色儀進(jìn)行蛋殼顏色測(cè)定，以純黑色為0，純白色為81.2進(jìn)行校正，數(shù)據(jù)越大表示蛋殼顏色越淺。蛋殼反射率(L* value)進(jìn)行三點(diǎn)（蛋殼的銳端、頓端和中間）測(cè)定，結(jié)果取其平均值。蛋殼強(qiáng)度用蛋殼強(qiáng)度測(cè)定儀( ROBOT-MATION MODEL-Ⅲ)將鴨蛋尖端向上、垂直豎放測(cè)定；蛋殼厚度用蛋殼厚度測(cè)定儀（PEACOCK）測(cè)定，每個(gè)蛋測(cè)定鈍端、銳端和中間三點(diǎn)，結(jié)果取其平均值；蛋形指數(shù)用蛋形指數(shù)測(cè)定儀測(cè)定，量取短軸和長軸長度，結(jié)果取長軸與短軸的比值。蛋黃高度、哈氏單位、蛋黃顏色均由EMT5200多功能蛋品分析儀測(cè)定。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異基因篩選 樣品總RNA提取步驟按照Trizol法進(jìn)行，使用 Oligotex mRNA Midi試劑盒（Qiagen，德國）進(jìn)行純化提取的mRNA樣品。RNA 的質(zhì)量通過使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和核酸分光光度計(jì)（Nanodrop ND-1000?）檢測(cè)260 nm吸光度，當(dāng)260/280 nm下測(cè)定值大于1.8時(shí)，RNA質(zhì)量較好。RNA完整性通過Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 檢 測(cè) RIN值， 當(dāng)RIN值大于8時(shí)被認(rèn)為RNA比較完整。所有RNA樣品均送到北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行mRNA分離、cDNA文庫構(gòu)建和測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為 Illumina HiSeqTM2500。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估和可信度的分析，通過質(zhì)量控制得到質(zhì)量較高的序列，利用Tophat將數(shù)據(jù)映射到基因組上，然后進(jìn)行堿基并鑒別遺傳變異。篩選差異表達(dá)基因的過濾條件為Probability ≥ 80%，SD = 2.0，篩選顯著差異基因的過濾條件為logFC > 2 或logFC < -2； P ≤ 0.05。根據(jù)基因的差異表達(dá)進(jìn)行功能注釋和富集分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.0中One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各處理間平均值比較采用Duncan氏多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD） 表示，以P <0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蛋品質(zhì)性狀及其相關(guān)分析 蛋品質(zhì)間的表型性狀相關(guān)分析見表1。由表1可以看出，不同顏色蛋殼具有顯著的蛋殼反射率（P<0.05）；綠頭野鴨群體中，白殼組的蛋殼強(qiáng)度大于綠殼組和黃綠殼組（P<0.01），而白殼組的蛋殼厚度極顯著低于綠殼組和黃綠殼組（P<0.01），隨著蛋殼顏色的加深，蛋殼強(qiáng)度逐漸降低，說明在綠頭野鴨群體中蛋殼顏色可以作為一種衡量蛋殼強(qiáng)度的指標(biāo)；3組在蛋形指數(shù)上呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05）；白殼組在蛋白高度與哈氏單位上均優(yōu)于綠殼組和黃綠殼組，3組蛋黃顏色無顯著差異。

對(duì)7個(gè)蛋品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析（表2）發(fā)現(xiàn)，蛋殼強(qiáng)度與蛋殼厚度的相關(guān)系數(shù)為0.8742，具有較強(qiáng)相關(guān)性；蛋殼強(qiáng)度與蛋殼顏色、蛋形指數(shù)、蛋白高度、哈氏單位屬于中等相關(guān)水平；蛋殼顏色與蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈氏單位屬于中等相關(guān)水平。

2.2 蛋殼強(qiáng)度相關(guān)差異基因的分析 本試驗(yàn)中，高低蛋殼強(qiáng)度組強(qiáng)度大小分別為3.968 kg/cm2、3.693kg/cm2，呈極顯著差異。對(duì)不同蛋殼強(qiáng)度的個(gè)體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析差異表達(dá)基因，共篩選出325條差異表達(dá)基因。與低蛋殼強(qiáng)度組相比，高蛋殼強(qiáng)度組表達(dá)量顯著上調(diào)的基因有149個(gè)，表達(dá)量顯著下調(diào)的基因有176個(gè)。

表1 綠頭野鴨不同顏色（L* value）蛋的蛋品質(zhì)比較

表2 蛋品質(zhì)性狀間的相關(guān)系數(shù)

表3 與蛋殼強(qiáng)度相關(guān)的差異表達(dá)基因

2.3 與蛋殼強(qiáng)度相關(guān)基因的篩選 本研究從325個(gè)顯著差異基因中篩選了17個(gè)與綠頭鴨蛋殼強(qiáng)度相關(guān)的重要基因，包括CACNA1S、CACNB4、LOC101801793、CAMK2A、CALN1等，如表3所示。 這些差異基因大部分與鈣離子代謝相關(guān)，主要參與鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣離子結(jié)合、鈣離子的釋放等，表明鈣離子在蛋殼強(qiáng)度形成過程中具有重要的作用。

3 討 論

3.1 蛋品質(zhì)性狀及相關(guān)分析 鳥類蛋殼顏色的變化多種多樣，而這種顏色的變化主要取決于膽綠素與原卟啉的含量，膽綠素濃度越高，蛋殼顏色越深，隨之蛋殼反射率越低。Daniel Hanley等[16]為了更好地解釋蛋殼顏色的變化而建立了蛋殼顏色的混合模型，模型基于膽綠素與原卟啉濃度的多少，利用蛋殼碳酸鈣的反射率進(jìn)行模型的校正，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋殼顏色的變化與膽綠素濃度直接相關(guān)，尤其是與蛋殼的反射率結(jié)合起來測(cè)定結(jié)果更加可靠，這說明L* value對(duì)蛋殼顏色的測(cè)定具有一定的可靠性。本實(shí)驗(yàn)利用L* value對(duì)各品種（系）蛋殼顏色進(jìn)行分組且結(jié)果呈極顯著差異，證明L* value對(duì)蛋殼顏色的測(cè)定具有一定的可靠性，這與Reynolds[17]等的結(jié)論一致。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著蛋殼顏色的加深，蛋殼強(qiáng)度逐漸降低，說明在綠頭野鴨群體中蛋殼顏色可以作為一種衡量蛋殼強(qiáng)度的指標(biāo)。Campo等[18]最早提出在未受到人工選擇的群體中，蛋殼顏色與蛋殼的強(qiáng)度存在顯著的正相關(guān)，隨著蛋殼顏色的變深，蛋殼質(zhì)量越好，而人工選擇會(huì)根據(jù)不同的選擇指標(biāo)而改變蛋殼強(qiáng)度的這一趨勢(shì)。這同時(shí)也意味著，在每個(gè)群體中，隨著蛋殼顏色的變化，強(qiáng)度也會(huì)呈現(xiàn)不同的變化。Ingram等[4]認(rèn)為若只用蛋殼顏色去衡量蛋殼質(zhì)量，結(jié)果并不準(zhǔn)確。Carter等[19]也提出蛋殼顏色作為衡量蛋殼質(zhì)量的指標(biāo)并不適用于所有的品系，本研究結(jié)果只適用綠頭野鴨。因此，育種工作者在蛋鴨育種工作中應(yīng)先進(jìn)行顏色與強(qiáng)度的分析，再根據(jù)不同的情況進(jìn)行選擇。

3.2 與蛋殼強(qiáng)度相關(guān)的差異基因篩選 與蛋殼礦化過程有關(guān)的子宮部基因可能是導(dǎo)致蛋殼質(zhì)量變異的關(guān)鍵因素，因此，研究蛋殼礦化時(shí)期影響碳酸鈣沉積的關(guān)鍵候選基因及其遺傳變異是新的研究方向。為了尋找蛋殼強(qiáng)度差異形成的分子機(jī)制，本研究采用RNA-seq技術(shù)對(duì)不同強(qiáng)度差異組的鴨子宮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序及對(duì)比分析。在本研究篩選到的325個(gè)差異表達(dá)的基因中，共找到17個(gè)與鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因，主要參與鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣離子結(jié)合、鈣離子的釋放等過程。與鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因如ATP家族、SCNN1家族與OPN等基因位于其中，這些家族基因通過鈉、鈣等陽離子通道的改變而改變蛋殼質(zhì)量。除了上述出現(xiàn)的基因之外，本研究發(fā)現(xiàn)了包括了CA家族（CALN、CAMK、CALM、CACNB4等）與手鈣結(jié)合蛋白（NECAB2）等一系列新的差異基因，這些基因也是通過控制鈣電壓門控通道進(jìn)而改變蛋殼中鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，說明鈣離子通道的改變?cè)诘皻?qiáng)度差異形成的分子機(jī)制中占據(jù)重要地位。這些基因的篩選為鴨蛋殼強(qiáng)度的分子選育提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過比較綠頭野鴨群體蛋殼顏色與質(zhì)量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)蛋殼顏色可作為綠頭野鴨蛋殼強(qiáng)度的衡量指標(biāo)，其中白殼鴨蛋的蛋殼強(qiáng)度最大。采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序找到17個(gè)與蛋殼強(qiáng)度相關(guān)的差異基因，這些基因主要參與了鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣離子結(jié)合、鈣離子釋放等生物學(xué)過程，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究蛋殼強(qiáng)度差異的分子機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

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Study on Quality of Mallard Eggs and Screening of Genes Related to Eggshell Strength

LIANG Su-yun, WEN Zhi-guo, XIE Ming, HUANG Wei, HOU Shui-sheng*, LI Fu-huang2
( 1.Insitite of Animal Science of CAAS, Beijing 100193,China 2.Beijing Animal Husbandry Station, Beijing 1000107, china)

A total of 100 healthy and same age mallard were selected were selected to analysis their eggs quality, including eggshell color, eggshell strength, eggshell thickness, egg shape index, White height, Haugh unit value and egg yolk color, in addition ,candidate genes related to eggshell strength were screened by transcriptome sequencing. The results showed that there were significant differences in egg shape index, eggshell strength, White height and Haugh unit value(P<0.05). The correlation coefficient of eggshell strength and thickness was 0.8742,while the eggshell color can be as a measure of egg quality in mallard, the strength of white shell was largest and yellow-green shell was the smallest(P<0.001).A total of 325 dif f erentially expressed genes were identif i ed, among which 149 genes were up-regulated and 176 genes were down-regulated. The genes related to shell strength were CACNA1I,CACNB4,CALN,CACNA1S,L OC101801793, are involved in the processes of calcium ion binding , calcium ion transmembrane transport and calcium release. The results provide a basis for further study on the molecular mechanism of the dif f erences in eggshell strength.

Mallard; Eggshell strength; Transcriptome sequencing; Gene screening

S834.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-028

2016-11-12；

2017-01-10

現(xiàn)代水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-43）

梁素蕓（1990-），女，山東滕州人，在讀碩士，研究方向?yàn)榧仪葸z傳育種，E-mail:liangsu_yun@163.com

* 通訊作者：侯水生(1959-)，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與營養(yǎng)，E-mail:houss@263.net