王鐵霖+趙東岳+陳美蘭+馬忠華+郭蘭萍

[摘要] 從吉林健康人參根中篩選到一株廣譜根際菌RS-3。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征及16SrDNA 序列同源性分析，鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。平板對峙實驗及帶毒平板法鑒定，該菌株對常見的5種人參病原菌有一定的拮抗作用，對灰霉病菌的抑菌率達(dá)54.4%。說明根際細(xì)菌RS-3可作為人參常見病害的潛在廣譜生防菌進(jìn)一步開發(fā)利用。

[關(guān)鍵詞] 人參；根際細(xì)菌；抑菌活性

[Abstract] A rhizobacteria strain named RS-3 exhibited inhibitory activity against all five Panax ginseng pathogens was isolated from the root of P. ginseng. This strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens based on its morphological character and 16S rDNA sequence. Antagonistic activity experiments indicated that the strain could strongly suppress Botrytis cinerea Pers with an inhibitory rate of 54.4%，suggesting the potentialities of biocontrol agent against diseases that frequently happen on ginseng.

[Key words] Panax ginseng；rhizobacteria；antibacterial activity

doi：10.4268/cjcmm20162413

人參Panax ginseng C. A. Mey為五加科人參屬多年生草本植物，主要分布于東北吉林、遼寧、黑龍江等地區(qū)。其野生資源稀少，被“國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥用動植物名錄”列為一類保護(hù)植物[1-3]。人參有幾千年的藥用歷史，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、安神益智的作用，在國內(nèi)外中藥領(lǐng)域占有極其重要的地位[4]。近年來，隨著人參需求量增加，野生人參已不能滿足需求，人工栽培的規(guī)模不斷擴(kuò)大，人參各類病害也愈加嚴(yán)重等問題，制約了人參種植業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

人參連作障礙主要為根部病害，多從根部開始侵染，采用化學(xué)農(nóng)藥防治必須將其施入土壤[5]。由于土壤對農(nóng)藥的吸附、遷移等一系列復(fù)雜作用及土壤中微生物對農(nóng)藥的降解，嚴(yán)重影響了化學(xué)農(nóng)藥的防效；若過度加大用量，不僅會增加生產(chǎn)成本，而且導(dǎo)致人參根內(nèi)農(nóng)殘量大幅度增加，失去藥用價值。因此，根用藥用植物的土傳病害防治不能單純依靠化學(xué)農(nóng)藥，必須探索新的防治途徑。因而篩選對人參根部病害有抗菌作用的生防菌進(jìn)行生物防治顯得尤為必要[6]。

植物根際細(xì)菌，特別是藥用植物根際細(xì)菌，作為一種新的資源引起了人們的廣泛關(guān)注，目前，對人參根際菌的研究尚處在初級階段。張一鳴等[9-10]開展了人參根際土壤提取物對人參病原菌和拮抗菌的影響研究。肖春萍等[11]開展了人參根際土壤微生物多樣性及其生防真菌資源開發(fā)研究工作。本實驗篩選出一株具有廣譜抑菌活性的根際細(xì)菌，初步研究了其對人參常見病菌抑菌活性，旨在篩選出能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的根際菌，為發(fā)酵生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)及人參資源的綜合開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 土壤采集 土壤樣品采自吉林通化集安三年生健康人參的根際土壤10 cm處。

1.2 供試培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g；酵母提取物 5 g；NaCl 10 g。加水定容至1 L，調(diào)至pH 7.0。121 ℃，滅菌20 min，固體培養(yǎng)基瓊脂為1.5%。

1.3 菌株分離 稱取10 g土壤樣品，于盛有90 mL無菌水的三角瓶中振蕩30 min。取1 mL土壤懸浮液，依次10倍梯度稀釋至1×10^-7。分別取1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5濃度的土壤懸浮液各100 μL均勻涂布于LB平板上。每個濃度梯度重復(fù)3皿。28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。從平板上挑取不同菌落形態(tài)的單菌落，于LB 平板上劃線純化培養(yǎng)，并編號保存。

2 方法

2.1 形態(tài)特征描述 依據(jù)伯杰氏細(xì)菌培養(yǎng)性狀判定方法，描述分離菌在LB培養(yǎng)基上 37 ℃培養(yǎng)24 h后的單菌落特征。

2.2 菌株 RS-3的分子鑒定 根據(jù)16SrDNA序列對菌株進(jìn)行分子鑒定。采用SDS法提取菌株RS-3基因組DNA。利用細(xì)菌16SrDNA序列通用引物F14（5′-AACAGGATTAGATACCCTG-3′）和R1492（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系及條件如下：2×PCR Mix，25 μL；模板 DNA，2 μL；引物各1 μL；ddH₂O 補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收，pEASY-T載體連接，Trans 5α轉(zhuǎn)化涂板，藍(lán)白斑篩選和菌液PCR驗證的陽性克隆送北京華大生物技術(shù)有限公司測序。獲得的序列在NCBI中比對搜索，確定分類地位。

2.3 RS-3對人參常見病原菌拮抗作用測定 平板對峙培養(yǎng)法測定拮抗作用。供試人參病原菌在PDA平板上培養(yǎng)8 d，取直徑0.5 cm的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中心。然后用接種環(huán)蘸取細(xì)菌RS-3菌株在菌餅的兩側(cè)約4 cm處劃線，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，測量抑菌帶的寬度，并記錄統(tǒng)計。每個處理重復(fù)3次，觀察并測量拮抗帶[12]。帶毒平板法：RS-3菌株于LB 液體培養(yǎng)基中，180 r·min^-1，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至A₆₀₀1.5。將菌懸液在12 000 r·min^-1離心1 min，上清液經(jīng)0.22 μm孔徑的濾膜過濾得到無菌濾液。待 PDA 培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右時加入無菌濾液（1∶9），混勻后倒平板。取直徑0.5 cm病原菌菌餅置于 PDA 培養(yǎng)基平板中間，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察抑菌效果。

相對抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑] ×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 RS-3菌株菌落形態(tài)描述及分子鑒定 該菌株可在LB培養(yǎng)基上迅速生長，菌落圓形，近乳白色且表面具皺褶。

以菌株RS-3基因組DNA為模板，利用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約1 436 bp的DNA片段。經(jīng)克隆、測序和序列比對分析發(fā)現(xiàn)，所獲得菌株的16SrDNA序列與解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum Se12菌株（JN700114.1），同源性為99%。結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)特征和生理生化反應(yīng)特性，確定RS-3菌株為解淀粉芽孢桿菌。與常見芽孢桿菌16SrDNA片段比較，分析系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果可見，該菌株與解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens親緣關(guān)系最近（圖1）。

3.2 根際菌RS-3 的拮抗作用評價 對峙平板法評價結(jié)果表明：根際菌RS-3具有廣譜抑菌活性，對供試病原菌菌絲生長均有一定的抑制作用。其中，灰霉病菌效果最好，人參立枯病菌效果不佳。抑菌帶分別為根腐病0.7 cm，銹腐病菌為0.7 cm，人參疫病菌為0.45 cm，灰霉病菌為0.7 cm，人參立枯病菌抑制效果不佳，為0.2 cm（圖2）。

帶毒平板法評價結(jié)果表明：該實驗結(jié)果與平板對峙實驗結(jié)果一致，根際菌RS-3對灰霉病菌的抑菌率最高，為54.4%，對人參立枯病菌抑菌效果較差，為13.18%。其他病原菌的抑菌率分別為：人參根腐病菌 30.0%，人參銹病菌 42.2%，人參疫病菌 33.3%。

4 討論

目前，對于人參種植病害的防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、人參品種改良及使用哈茨木霉等廣譜生防制劑等[13-14]。盡管針對人參連作障礙進(jìn)行改善栽培措施、化學(xué)防治等了相關(guān)探索，并取得了一定效果，但仍未從根本上解決人參病害防治難的問題。植物根際有豐富的具有生防潛力的微生物資源，它們具有繁殖速度快的特點(diǎn)，大量繁殖后施入土壤中，可以調(diào)節(jié)植物根部微生態(tài)環(huán)境、限制土傳病原真菌的繁殖和抑制土傳病害的發(fā)生蔓延，且具有對環(huán)境安全、無污染、不易引起病原菌產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)。因此，植物根際細(xì)菌作為一類新的生防資源，已成為植物病害防控的研究熱點(diǎn)[15]。

拮抗細(xì)菌篩選研究報道多數(shù)針對單一病害，而獲得新類型具有廣譜抑菌的菌株較少[16]。本研究通過分離所獲得的人參根際細(xì)菌RS-3為解淀粉芽孢桿菌，對人參常見病害的病原菌均有不同程度的抑制作用，尤其對人參灰霉病菌的抑制率高達(dá)54.4%。為人參根腐病、枯萎病等常見病害的生物防治提供更多的資源菌，為人參土傳根部病害的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

芽胞桿菌內(nèi)生芽胞，繁殖力強(qiáng)，利于工業(yè)化生產(chǎn)，且是自然界中廣泛存在的非致病細(xì)菌，對人、畜無害，不污染環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，芽胞桿菌屬可以產(chǎn)生很多抗菌物質(zhì)，抑制多種病原菌的生長[17-21]。因此，利用芽胞桿菌進(jìn)行植物病害生物防治成一個研究熱點(diǎn)。其中，解淀粉芽孢桿菌可以成功定殖于植物表皮，與病原菌競爭寄主周圍的營養(yǎng)，分泌抗菌物質(zhì)而抑制病原菌生長，同時可誘導(dǎo)寄主防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而起到生防的作用。Arrebola等從水果表面分離出解淀粉芽孢桿菌PPCB004，對7種不同的柑橘采后病原真菌具有抑制作用[22]。郝建安等研究表明，解淀粉芽孢桿菌NK10.BAhjaWT菌株對茄病鐮刀菌Fusarinm solani、水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani Kuhn、黑曲霉 Aspergillus niger V.Tiegh、黑痘病菌Elsinoe ampelina Shear等多種真菌都有較好的抑制作用，其中對黑痘病菌的抑制效果最好，生防效果達(dá)到80.3%[23]。一些國家已在實驗室研制開發(fā)有效的生物制劑，一些拮抗菌已經(jīng)進(jìn)行了半商業(yè)化的實驗，有的拮抗菌已經(jīng)制成商品投放市場，2001年Gustafson將解淀粉枯草芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌混合制成生防藥劑Bio Yield[24]。因此，本研究中所篩選得到的解淀粉芽胞桿菌是一類具有很大生防潛力的生防菌，它對人參的生長乃至藥材品質(zhì)會有怎樣的影響有待進(jìn)一步研究。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]