陳媞穎+蔣超+袁媛+陳康+周駿輝+趙玉洋+黃璐琦

[摘要] 將高分辨率熔解曲線（high resolution melting curve analysis，HRM）技術(shù)應(yīng)用于金銀花種質(zhì)鑒定中，對(duì)已知7對(duì)SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列，simple sequence repeats）引物進(jìn)行篩選，通過(guò)熔解曲線峰型及T_m差異，確定適合鑒別引物并考察其DNA模板濃度、退火溫度及循環(huán)數(shù)的適宜范圍。結(jié)合SIMCA-P軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行處理分析，結(jié)果表明利用其中4對(duì)引物的熔解曲線可以區(qū)分金銀花的3個(gè)主栽種質(zhì)，為進(jìn)一步完善金銀花種質(zhì)鑒定方法提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 高分辨率熔解曲線；金銀花；種質(zhì)鑒定

[Abstract] To establish a new high resolution melting analytical method for identification of Lonicera japonica germplasm，the screening of 7 pairs of SSR （simple sequence repeats） primers，determining the suitable diagnostic primers by the differences of peak pattern and T_m was conducted. Then into the DNA template concentration，annealing temperature and the suitable range of cycle number were investigated. Combined with SIMCA-P software for data processing analysis，the results show that three main germplasm honeysuckle could be divided by four sets of primers. It provides methodology for improving L. japonica germplasm identification.

[Key words] high resolution melting；Lonicerae Japonicae Flos；germplasm identification

doi：10.4268/cjcmm20162415

藥材金銀花的基原植物為忍冬屬植物忍冬Lonicera japonica Thunb.，在長(zhǎng)期的栽培過(guò)程中其形態(tài)發(fā)生了明顯的變異和分化，形成了很多農(nóng)家栽培品種或品系[1-2]。近年來(lái)，隨著金銀花價(jià)格走高，栽培面積擴(kuò)大，新興產(chǎn)區(qū)與傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)間交互引種，致使出現(xiàn)同質(zhì)異名或異質(zhì)同名情況，限制了生產(chǎn)發(fā)展和種植效益的提高。由于不同種質(zhì)金銀花在植株形態(tài)、藥材產(chǎn)量與質(zhì)量等方面均表現(xiàn)出明顯差異，因此建立合適的種質(zhì)資源鑒定方法，對(duì)于金銀花的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、良種選育、規(guī)范種子種苗市場(chǎng)以及保障藥材品質(zhì)均有重大意義。利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)資源分類與鑒定已取得重要進(jìn)展，本課題組前期通過(guò)對(duì)金銀花栽培種質(zhì)進(jìn)行調(diào)查與分類，表明7對(duì)SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列，simple sequence repeats）引物的指紋圖譜可作為“分子身份證”區(qū)分全國(guó)58個(gè)金銀花種質(zhì)[3-4]，但該方法需要通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜進(jìn)行檢測(cè)，操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。

為了建立準(zhǔn)確、快速、可視化的主栽種質(zhì)鑒定方法，本研究將高分辨率熔解曲線（high resolution melting curve analysis，HRM）技術(shù)應(yīng)用于金銀花種質(zhì)SSR鑒定中。高分辨率熔解曲線分析是在實(shí)時(shí)熒光定量PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，其通過(guò)監(jiān)測(cè)DNA雙螺旋隨溫度升高時(shí)解鏈情況變化，具有簡(jiǎn)便、快速、高通量、對(duì)樣本無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，在中藥鑒定中顯示出良好的應(yīng)用前景 [5]。使用HRM技術(shù)檢測(cè)SSR標(biāo)記，與常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分型相比，不需要PCR后續(xù)處等步驟，大大降低了檢測(cè)時(shí)間并提高了靈敏度和特異性[6-7]。本研究使用HRM技術(shù)檢測(cè)金銀花種質(zhì)的7對(duì)SSR鑒定標(biāo)記，通過(guò)熔解曲線峰型及T_m差異，實(shí)現(xiàn)了金銀花3個(gè)主栽種質(zhì)的可視化鑒定，為金銀花種質(zhì)的栽培、流通、追溯監(jiān)管及仲裁提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Light Cycler 480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司），DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京市六一儀器廠），5810R型低溫冷凍離心（Eppendorf公司） ，MM 400型混合型球磨儀（Retsch公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2型，國(guó)華電器有限公司），紫外凝膠成像分析儀（英國(guó)Syngene公司，型號(hào)GBOXHR）。

1.2 試劑

改良 2×CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取緩沖液，含有2%CTAB，100 mmol·L^-1Tris-HCl （三羥甲基氨基甲烷，pH 8.0）、20 mmol·L^-1乙二胺四乙酸二鈉（pH8.0）、2.5 mol·L^-1氯化鈉；無(wú)水乙醇、異戊醇、巰基乙醇購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純；LC Green Plus（Idaho公司）。

1.3 樣品

收集了來(lái)自河北、河南、山東等地的8個(gè)金銀花種質(zhì)，分別為：一線紅、巨花一號(hào)、線花一號(hào)、四季花、雞爪花、亞特紅蕾、亞特良種、九豐一號(hào)，采樣量為10～30株。采集樣品為忍冬頭茬花，包括二白期花蕾、帶葉新枝、帶花新枝等，單株取樣，樣品用硅膠干燥后保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。

2 方法

2.1 模板DNA提取

取100 mg實(shí)驗(yàn)材料，液氮環(huán)境下研磨，采用改良CTAB法提取樣品總DNA[9]。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用核酸定量?jī)x檢測(cè)定DNA濃度，調(diào)整DNA終濃度約50 mg·L^-1，作為模板用于PCR擴(kuò)增。

2.2 PCR擴(kuò)增與熔解曲線分析

以不同種質(zhì)的金銀花DNA為模板，在Light Cycler 480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析。25 μL PCR反應(yīng)體系，包括10×buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，正反向引物各0.25 μL，LC Green Plus 2 μL，rTaq酶1 μL，DNA模板1 μL及dd H₂O 17.8 μL。PCR反應(yīng)及熔解曲線程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，X ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃ 7 min；PCR結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析：95 ℃ 變性1 min，40 ℃ 1 min形成異源雙鏈DNA，而后升溫至70 ℃，最后從70 ℃至97 ℃，期間每個(gè)溫度點(diǎn)采集15個(gè)熒光值。 X ℃表示退火溫度依據(jù)引物不同而不同，見表1。

2.3 引物篩選

以8個(gè)不同種質(zhì)的金銀花DNA為模板，考察SSSR9008219等7對(duì)金銀花種質(zhì)鑒定引物HRM分析熔解曲線峰形和T_m差異的影響，篩選出合適的鑒別引物。SSR信息、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，引物序列及PCR反應(yīng)條件見表1。

2.4 條件優(yōu)化

分別考察了DNA模板濃度，退火溫度以及循環(huán)次數(shù)對(duì)于熔解曲線峰形和T_m的影響，確定可依據(jù)峰形和T_m鑒別不同種質(zhì)金銀花的條件并考察重復(fù)性。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SIMCA-P11.5對(duì)熔解曲線熒光信號(hào)進(jìn)行主成分分析，根據(jù)分離度篩選引物。

3 結(jié)果與分析

3.1 金銀花種質(zhì)HRM鑒定引物的篩選

為獲得適用于金銀花種質(zhì)HRM鑒定引物，以8個(gè)金銀花常見種質(zhì)的DNA作為模板，利用SSSR9008219等7對(duì)金銀花種質(zhì)SSR鑒定引物進(jìn)行HRM檢測(cè)，依據(jù)其熔解曲線熒光信號(hào)進(jìn)行主成分分析，篩選出分離度好的引物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

結(jié)果表明引物SSSR9008219，SSR9118060，SSR9122370，SSR9553121的熔解曲線，可以區(qū)分種質(zhì)一線紅、亞特紅蕾、九豐一號(hào)和其他金銀花種質(zhì)。

引物SSSR9008219以亞特良種為基線作差異曲線，亞特紅蕾82.9 ℃具有單一拐點(diǎn)，九豐一號(hào)83.4 ℃具有單一拐點(diǎn)，與其他品種曲線具有明顯差異；轉(zhuǎn)換為峰形曲線，亞特紅蕾與九豐一號(hào)均為雙峰，T_m分別為（77.71±0.06），（83.52±0.03）℃ 以及（76.78±0.06），（83.51±0.11）℃。使用 SIMCA-P軟件對(duì)HRM熒光信號(hào)進(jìn)行主成分分析，九豐一號(hào)、亞特紅蕾、一線紅均表現(xiàn)出較大的分離度，優(yōu)于HRM差異曲線結(jié)果，可專屬性鑒定這3個(gè)種質(zhì)，見圖1。

引物SSR9118060歸一化曲線中，一線紅具有74.4，75.7，77.6 ℃ 3個(gè)拐點(diǎn)，與其他品種曲線具有明顯差異；轉(zhuǎn)換為峰形曲線，一線紅為雙峰，T_m分別為（75.17±0.13），（78.64±0.05） ℃。使用 SIMCA-P軟件對(duì)HRM熒光信號(hào)進(jìn)行主成分分析，一線紅、亞特紅蕾、九豐一號(hào)均表現(xiàn)出較大的分離度，優(yōu)于歸一化曲線結(jié)果，可專屬性鑒定這3個(gè)種質(zhì)，見圖2。

引物SSR9122370歸一化曲線中，九豐一號(hào)具有78.5，82，83.9 ℃ 3個(gè)拐點(diǎn)，與其他品種曲線具有明顯差異；轉(zhuǎn)換為峰形曲線，九豐一號(hào)為雙峰，T_m分別為（79.26±0.08），（84.86±0.04） ℃。使用 SIMCA-P軟件對(duì)HRM熒光信號(hào)進(jìn)行主成分分析，亞特紅蕾、九豐一號(hào)均表現(xiàn)出較大的分離度，優(yōu)于歸一化曲線結(jié)果，可專屬性鑒定這2個(gè)種質(zhì)，見圖3。

引物SSR9553121歸一化曲線中，亞特紅蕾78.6 ℃具有單一拐點(diǎn)，以亞特紅蕾為基線作差異曲線，也可見與其他品種曲線具有明顯差異；轉(zhuǎn)換為峰形曲線，亞特紅蕾為單峰，T_m為（79.43±0.03）℃。使用 SIMCA-P軟件對(duì)HRM熒光信號(hào)進(jìn)行主成分分析，線花一號(hào)、亞特紅蕾、九豐一號(hào)均表現(xiàn)出較大的分離度，優(yōu)于歸一化熔解曲線結(jié)果，可專屬性鑒定這3個(gè)種質(zhì)，見圖4。

通過(guò)歸一化曲線和主成分分析2個(gè)方法進(jìn)行分析和對(duì)比，可以看出，同種引物相同條件下，金銀花不同種質(zhì)在種質(zhì)間表現(xiàn)出較大差異，可專屬鑒別相應(yīng)種質(zhì)，結(jié)合篩選所得4個(gè)引物，利用種質(zhì)間差異可以分別鑒別一線紅、亞特紅蕾、九豐一號(hào)3個(gè)種質(zhì)。通過(guò)熔解曲線峰形T_m并計(jì)算其RSD，考察不同種質(zhì)種質(zhì)內(nèi)差異性，結(jié)果表明金銀花不同種質(zhì)內(nèi)差異較小，高分辨率熔解曲線法可鑒定相應(yīng)種質(zhì)，見表2。

3.2 HRM鑒別條件優(yōu)化結(jié)果

3.2.1 DNA模板濃度 隨機(jī)選取金銀花DNA為模板，逐級(jí)調(diào)整其質(zhì)量濃度為30，40，50，60 mg·L^-1以SSR9118060為引物，退火溫度為52 ℃，在35個(gè)循環(huán)的條件下進(jìn)行HRM分析，結(jié)果表明其峰形和T_m在30～60 mg·L^-1無(wú)明顯差異。

3.2.2 循環(huán)數(shù)篩選 以SSR9118060為引物，退火溫度為52 ℃，分別選擇30，35，40為循環(huán)數(shù)，進(jìn)行HRM分析并對(duì)其峰形及T_m進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在30個(gè)循環(huán)條件下，擴(kuò)增出的曲線難以成形，可能與擴(kuò)增效率低有關(guān)，在35，40個(gè)循環(huán)下，DNA熔解曲線峰型一致，T_m無(wú)明顯差異。

3.2.3 退火溫度篩選 以SSR9118060為引物，依次調(diào)整退火為48，50，52，54 ℃，在35循環(huán)下進(jìn)行擴(kuò)增，HRM分析并對(duì)其峰形及T_m進(jìn)行比較。結(jié)果表明不同的溫度下T_m差異介于0～1.43，無(wú)明顯差異，峰形結(jié)果顯示，溫度在50～54 ℃有較為穩(wěn)定的區(qū)分度。

3.2.4 重復(fù)性 為測(cè)試操作重復(fù)性，取1個(gè)金銀花DNA樣品，分成9份，使用SSR9118060為引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，分析高分辨率熔解曲線分型結(jié)果，峰形一致，計(jì)算其峰T_m為（79.26±0.07），（84.86±0.04） ℃；RSD為0.080%，0.050%。將同一個(gè)金銀花樣品分成4份，使用SSR9118060為引物進(jìn)行擴(kuò)增，分4次連續(xù)進(jìn)樣，分析高分辨率熔解曲線結(jié)果，計(jì)算其峰T_m為（79.30±0.13），（85.05±0.24） ℃；RSD為0.18%，0.33%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性較高。

4 討論

一些農(nóng)家品種如大毛花、小毛花、大雞爪花、小雞爪花、四季花、九豐一號(hào)、巨花一號(hào)等在山東、河南、河北等主產(chǎn)區(qū)廣泛種植，并經(jīng)無(wú)性系繁育和修剪成形成其他農(nóng)家品種。種質(zhì)差異是影響金銀花質(zhì)量和產(chǎn)量的重要因素，由于種質(zhì)間植物外觀形態(tài)差異不明顯，且性狀特征易隨著產(chǎn)地變化而改變。本項(xiàng)目組建立了一套含有7個(gè)SSR標(biāo)記及其SSSR9008219等7對(duì)引物的金銀花種質(zhì)鑒定標(biāo)記，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜可區(qū)分來(lái)自全國(guó)各地的58個(gè)金銀花種質(zhì)。

在此基礎(chǔ)上，本文針對(duì)其中亞特紅蕾、九豐一號(hào)等8個(gè)種質(zhì)，引入高分辨率熔解曲線優(yōu)化種質(zhì)鑒定方法。高分辨率熔解曲線可以在分子水平上準(zhǔn)確地反映DNA片段的特征，可用于臨床疾病的分子診斷與分型、植物遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位與標(biāo)記輔助選擇、突變檢測(cè)及種質(zhì)鑒定等研究[9]。高分辨率熔解曲線應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定研究，常用于檢測(cè)SSR或SNP片段[10-12]，具有高通量、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性好以及無(wú)需設(shè)計(jì)探針，不需重新設(shè)計(jì)PCR引物等優(yōu)點(diǎn)[13-14]。

HRM技術(shù)對(duì)于金銀花的種質(zhì)資源鑒定不受藥材原植物生長(zhǎng)發(fā)育階段、供試部位等條件的影響，能較好地反映金銀花不同品種的遺傳多樣性，并加以快速鑒定及準(zhǔn)確區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)篩選獲得4種鑒別引物SSSR9008219，SSR9118060，SSR9122370，SSR9553121，在相應(yīng)退火溫度、循環(huán)數(shù)為35～40、DNA模板30～60 mg·L^-1進(jìn)行熔解曲線分析。采取歸一化曲線，峰型熔解曲線及主成分分析3種方法相結(jié)合進(jìn)行金銀花種質(zhì)鑒定。其中峰型熔解曲線可從T_m判斷，最為簡(jiǎn)單，但分離度較低；主成分分析方法準(zhǔn)確度最高，可鑒定樣品量最大，歸一化曲線易于數(shù)據(jù)庫(kù)化，三者各有特點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)際情況予以選擇或相互結(jié)合已達(dá)到最佳效益。該方法可分別對(duì)一線紅、亞特紅蕾、九豐一號(hào)予以區(qū)分，其中亞特紅蕾來(lái)源于紅白忍冬、九豐一號(hào)為四倍體金銀花，對(duì)金銀花品種選育及后續(xù)開發(fā)利用具有重要意義。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]