賴先榮+周邦華+杜明勝+鄭海杰+耿志鵬+李佳川+孟憲麗+張藝+張靜

[摘要] 建立生品、姜炙、醋炙、酒蒸、酒炙、萸炙6種黃連飲片中6種生物堿（鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿）的含量測(cè)定方法，并結(jié)合藥效學(xué)結(jié)果探索其與藥效學(xué)研究結(jié)果及中醫(yī)療效之間的關(guān)系。采用Welch Xtimate_TMC₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以0.1%三乙胺溶液（用碳酸氫銨和氨水調(diào)節(jié)pH 10）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，10%～25%B；15～25 min，25%～30%B；25～40 min，30%～45%B），流速1.0 mL·min^-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。6種生物堿分別在0.85～16.96 mg·L^-1（r=0.999 7），1.25～24.96 mg·L^-1（r=0.999 9），2.05～40.96 mg·L^-1（r=0.999 9），3.65～72.96 mg·L^-1（r=0.999 9），2.88～57.06 mg·L^-1（r=0.999 8），13.25～264.96 mg·L^-1（r=0.999 6）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率（n=9）分別為102.4%（RSD 1.2%），101.8%（RSD 1.3%），100.3%（RSD 1.8%），100.7%（RSD 1.8%），101.2%（RSD 1.5%），97.90%（RSD 2.0%）。測(cè)定6種黃連飲片共36個(gè)批次的6種生物堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.55，4.49，9.12，19.17，15.69，62.56 mg·g^-1。該文建立含量測(cè)定方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可用于6種黃連飲片中6種生物堿的含量測(cè)定。采用主成分分析、分層聚類分析對(duì)含量測(cè)定及前期藥效學(xué)研究結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明酒蒸、酒炙、萸炙3種黃連飲片與生品黃連飲片存在明顯差異，酒蒸飲片與生品飲片具有最大的差異，其差異主要與血清甘油三酯（TG）、空腹血糖水平（FBG）有關(guān)，另外，鹽酸非洲防己堿是6種生物堿成分中影響最大的生物堿成分。酒蒸、酒炙、萸炙3種黃連飲片用于中醫(yī)臨床“治消渴”（防治糖尿?。└袃?yōu)勢(shì)，特別是在治療糖尿病高脂血癥方面。

[關(guān)鍵詞] 黃連飲片；HPLC；鹽酸藥根堿；鹽酸非洲防己堿；鹽酸表小檗堿；鹽酸黃連堿；鹽酸巴馬??；鹽酸小檗堿；含量測(cè)定；藥效學(xué)；主成分分析；分層聚類分析

[Abstract] To establish a method for determining the contents of six alkaloids （jatrorrhizine hydrochloride，columbamine hydrochloride，epiberberine hydrochloride，coptisine hydrochloride，palmatine hydrochloride，berberine hydrochloride） in six types of Coptidis Rhizoma pieces （crude pieces，ginger juice stir-fried pieces，vinegar stir-fried pieces，wine steamed pieces，wine stir-fried pieces，evodiae juice stir-fried pieces） by RP-HPLC，and explore the relationship with the curative effect of traditional Chinese medicine （TCM） and pharmacodynamics results. The chromatographic column was Welch Xtimate_TMC₁₈ （4.6 mm×250 mm，5 μm），with 0.1% triethylamine solution （adjust pH at 10 with ammonium bicarbonate and ammonia） as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B for gradient elution （0-15 min，10%-25%B；15-25 min，25%-30%B；25-40 min，30%-45%B） at a rate of 1.0 mL·min^-1. The column temperature was set at 30 ℃，and the wavelength was set at 270 nm. The six alkaloids showed a good linear relationship within the range of 0.85-16.96 mg·L^-1 （r=0.999 7），1.25-24.96 mg·L^-1 （r=0.999 9），2.05-40.96 mg·L^-1 （r=0.999 9）， 3.65-72.96 mg·L^-1 （r=0.999 9），2.88-57.60 mg·L^-1 （r=0.999 8），and 13.25-264.96 mg·L^-1 （r=0.999 6） respectively. The average recoveries （n=9） of the six alkaloids were 102.4% （RSD 1.2%），101.8% （RSD 1.3%），100.3% （RSD 1.8%），100.7%（RSD 1.8%），101.2% （RSD 1.5%） and 97.90% （RSD 2.0%） respectively，and their average contents were 3.55，4.49，9.12，19.17，15.69，62.56 mg·g^-1，respectively. This determination method was accurate and repeatable，which could be used for the content determination in six types of Coptidis Rhizoma pieces. Data analysis on contents determination and preliminary pharmacodynamics results was conducted by using principal component analysis （PCA） and hierarchical clustering analysis （HCA）. The analysis results showed that three types of Coptidis Rhizoma pieces （wine steamed pieces，wine stir-fried pieces，and evodiae juice stir-fried pieces） had significant differences with crude pieces，and the wine steamed Coptidis Rhizoma pieces showed most difference with crude pieces especially，mainly related to triglyceride （TG） and fasting blood glucose levels （FBG） in serum. In addition，columbamine hydrochloride was most affected among the six alkaloids. Those three types of Coptidis Rhizoma pieces （wine steamed pieces，wine stir-fried pieces，and evodiae juice stir-fried pieces），had more advantages for "anti-diabetes" in TCM clinical application，especially in the treatment of diabetic hyperlipidemia.

[Key words] Coptidis Rhizoma pieces；HPLC；jatrorrhizine hydrochloride；columbamine hydrochloride；epiberberine hydrochloride；coptisine hydrochloride；palmatine hydrochloride；berberine hydrochloride；content determination；pharmacodynamics data；principal components analysis （PCA）；hierarchical clustering analysis （HCA）

doi：10.4268/cjcmm20162416

黃連系毛茛科植物黃連（味連）Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連（雅連）C. deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao、云連C. teeta Wall.的干燥根莖，以味連為主流品種。《中國(guó)藥典》2015年版收載的黃連飲片有生品飲片、姜（炙）飲片、酒（炙）飲片、萸（炙）飲片[1]，此外歷代本草文獻(xiàn)還收載了其他黃連飲片，如明代《本草綱目》收載了醋（炙）飲片、酒蒸飲片等飲片。

黃連飲片中主要含有小檗堿、巴馬汀對(duì)照品、藥根堿對(duì)照品、黃連堿等多種生物堿成分，其含量測(cè)定方法主要有薄層掃描法[2-3]、高效液相色譜法[4-7]等。現(xiàn)今文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC測(cè)定黃連及其炮制品中生物堿含量的方法，最多同時(shí)測(cè)定6種主要生物堿含量[7]。本文采用RP-HPLC對(duì)6種黃連飲片中的6種主要生物堿的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，各生物堿峰分離良好，方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，為黃連生品飲片及炮制品飲片的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，同時(shí)結(jié)合黃連“治消渴”藥效學(xué)結(jié)果，進(jìn)行了譜-效關(guān)系的主成分分析、分層聚類分析，探索中醫(yī)臨床用于“治消渴”（防治糖尿病）用途的黃連飲片與其他黃連飲片的差異性及其來(lái)源。

1 材料

日本島津LC-10A高效液相色譜儀（LC-10ATvp輸液泵A，B，AT-330柱溫箱，SPD-10Avp紫外檢測(cè)器，7725i手動(dòng)進(jìn)樣器，N-2000色譜數(shù)據(jù)工作站，日本島津公司）；CQ-250型超聲波清洗器（上海必能信公司，功率200 W，頻率40 kHz）；BP211D電子天平（1/10萬(wàn)，德國(guó)Sartorius公司）；ULUP-I-10T超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。

鹽酸藥根堿對(duì)照品、鹽酸巴馬汀對(duì)照品、鹽酸小檗堿對(duì)照品（均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，均為供含量測(cè)定用，批號(hào)分別為0733-200005，110732-200506，110713-200609）；鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿（均由重慶市中藥研究院中藥藥物化學(xué)研究所羅維早研究員提供，面積歸一化法RP-HPLC檢測(cè)其純度>98%）。乙腈為色譜純，甲醇、鹽酸、碳酸氫銨、氨水、三乙胺等其他試劑均為分析純，水為超純水。生品、姜炙、醋炙、酒蒸、酒炙、萸炙6種黃連飲片各6批，由成都中醫(yī)大惠康藥業(yè)有限公司提供，按照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄規(guī)定的炮制方法，采用同一批次黃連藥材（味連）加工制備而成，味連藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝研究員鑒定為黃連（味連）C. chinensis。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Welch Xtimate_TMC₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相A-0.1%三乙胺溶液（用碳酸氫銨和氨水調(diào)pH 10），流動(dòng)相B-乙腈，梯度洗脫（0～15 min，10%～25% B；15～25 min，25%～30% B；25～40 min ，30%～45% B）；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；流速1.0 mL·min^-1；柱溫30 ℃；6種生物堿的混合對(duì)照品以及6種黃連飲片HPLC圖見圖1。

1.鹽酸小檗堿；2.鹽酸巴馬??；3.鹽酸黃連堿；4.鹽酸表小檗堿；5.鹽酸非洲防己堿；6.鹽酸藥根堿；A.混合對(duì)照品；B.生品飲片；C.姜炙飲片；D.醋炙飲片；E.酒蒸飲片；F.酒炙飲片；G.萸炙飲片。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，以鹽酸-甲醇（1∶100）分別制成質(zhì)量濃度為1.060，1.040，0.256，0.456，0.480，0.552 g·L^-1的溶液，做為對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。分別精密吸取上述6種生物堿對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，以鹽酸-甲醇（1∶100）分別制成質(zhì)量濃度為16.96，24.96，40.96，72.96，57.6，264.96 mg·L^-1的混合溶液，作為混合對(duì)照品儲(chǔ)備液備用。

2.3 供試品溶液的制備

取本品（酒蒸飲片）粉末（過(guò)3號(hào)篩，下同）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入鹽酸-甲醇（1∶100）50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用鹽酸-甲醇（1∶100）補(bǔ)足失重，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 方法與結(jié)果

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取6種生物堿混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5，1，2.5，5 mL置10 mL量瓶中，加鹽酸-甲醇（1∶100）稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸各混合對(duì)照品溶液各10 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，各生物堿質(zhì)量濃度（mg·L^-1）（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）。結(jié)果表明，6種生物堿分別在0.85～16.96 mg·L^-1（r=0.999 7），1.25～24.96 mg·L^-1（r=0.999 9），2.05～40.96 mg·L^-1（r=0.999 9），3.65～72.96 mg·L^-1（r=0.999 9），2.88～57.06 mg·L^-1（r=0.999 8），13.25～264.96 mg·L^-1（r=0.999 6）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，結(jié)果6種生物堿峰面積的RSD分別為1.1%，0.96%，0.53%，1.8%，0.61%，0.61%（n=5），均小于2.0%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.3供試品制備方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，結(jié)果6種生物堿峰面積的RSD分別為0.25%，1.7%，1.6%，1.4%，1.8%，1.6%（n=5），均小于2.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)酒蒸飲片粉末，按2.3項(xiàng)供試品制備方法平行制備供試品溶液，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果6種生物堿含量的RSD分別為1.3%，1.1%，1.3%，0.83%，1.6%，1.2%（n=6）。結(jié)果表明供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的酒蒸飲片粉末，取0.05 g（6份），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入6種生物堿對(duì)照品溶液（以μg計(jì)）各169.6，200.0，512.0，980.4，816.0，3 372.8 μg，按2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制成回收率測(cè)定樣品，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果6種生物堿平均回收率（n=6）分別為102.4%（RSD 1.2%），101.8%（RSD 1.3%），100.3%（RSD 1.8%），100.7%（RSD 1.8%），101.2%（RSD 1.5%），97.90%（RSD 2.0%），表明本法具有較好的回收率。

2.4.6 樣品測(cè)定 分別稱取6種黃連飲片各6批樣品粉末分別約0.1 g，按2.3項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定6批樣品中6種生物堿的含量，結(jié)果見表1。測(cè)定6種黃連飲片共36個(gè)批次的6種生物堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.55，4.49，9.12，19.17，15.69，62.56 mg·g^-1。

2.4.7 生物堿含量-藥效學(xué)數(shù)據(jù)分析 主成分分析（principal components analysis，PCA）是一種多元多維數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，通過(guò)具有一定相關(guān)性多維數(shù)據(jù)的降維處理，較少的互不相關(guān)的新變量（主成分）來(lái)代替原有的多個(gè)變量，盡可能多地反映原來(lái)變量的信息[8]。分層聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）屬于另一類基于定量分類學(xué)的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，通過(guò)衡量不同數(shù)值變量間的相似性，將不同分組變量降維處理分類到不同的類，同類對(duì)象具有很大的相似性、不同類對(duì)象有很大的相異性。因此，PCA，HCA可以較好地處理本文的多維相關(guān)數(shù)據(jù)。

本文前期對(duì)6種黃連飲片進(jìn)行了與“治消渴”作用有關(guān)的藥效學(xué)研究[9]，結(jié)果見表2，分別觀察了6種黃連飲片對(duì)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的小鼠急性高血糖模型、四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型和鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型相關(guān)生化指標(biāo)的影響[9]；由于生物堿含量與藥效學(xué)結(jié)果之間存在一定的相關(guān)性，通過(guò)適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)挖掘方法，可以發(fā)現(xiàn)其中的相關(guān)性；本文采用Unscrambler 9.7及SPSS 22多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件[10]，對(duì)6種黃連炮制品中生物堿含量數(shù)據(jù)與“治消渴”作用有關(guān)的藥效學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）、分層聚類分析（HCA），以優(yōu)選發(fā)現(xiàn)“治消渴”作用相關(guān)的黃連飲片及其相關(guān)的主要生物堿成分，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥。

但是2類數(shù)據(jù)（含量測(cè)定數(shù)據(jù)與藥效學(xué)數(shù)據(jù)）之間的量綱單位、數(shù)量級(jí)決定了不可能進(jìn)行直接分析、比較，必須采用適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化變換對(duì)各指標(biāo)數(shù)值進(jìn)行無(wú)量綱化處理，以解決數(shù)據(jù)指標(biāo)之間的可比性問(wèn)題。常用的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化有對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化、反正切標(biāo)準(zhǔn)化、偏差標(biāo)準(zhǔn)化、離差標(biāo)準(zhǔn)化[11-12]，本文采用4種數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法對(duì)表1，2的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理（藥效學(xué)各數(shù)據(jù)為逆指標(biāo)，即數(shù)據(jù)越大藥效越差，按要求預(yù)處理結(jié)果將指標(biāo)的正負(fù)號(hào)對(duì)調(diào)），對(duì)主成分的方差貢獻(xiàn)率進(jìn)行了比較，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明2種數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法（對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化、反正切標(biāo)準(zhǔn)化，其PC1的方差貢獻(xiàn)率在80%以上），適合本文2類數(shù)據(jù)的預(yù)處理，其中優(yōu)選對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為本文適用的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法，對(duì)數(shù)變換后結(jié)果的數(shù)值在[-1，1]內(nèi)，各指標(biāo)均處于同一數(shù)量級(jí)，適合進(jìn)行綜合對(duì)比評(píng)價(jià)，對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化變換后的數(shù)值見表4。

采用Unscrambler 9.7軟件，對(duì)6種黃連飲片生物堿含量-藥效學(xué)數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化變換數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見圖2，3，表5。圖2表示經(jīng)過(guò)降維處理后6種黃連飲片在二維空間的分布情況，圖中橫坐標(biāo)表示每種黃連飲片的第一主成分得分值，縱坐標(biāo)表示每種黃連飲片的第二主成分得分值，主成分1（PC1）解釋了總變異（方差）的86%、主成分2（PC2）解釋了總變異的9%，可以看出酒蒸飲片、酒炙飲片、萸炙飲片為一類，生品飲片、姜炙飲片、醋炙飲片為一類，可以看出生品飲片與其他飲片（酒蒸飲片、酒炙飲片、萸炙飲片）存在明顯差異。圖3，表5表示各數(shù)據(jù)變量與主成分的相關(guān)性，代表各數(shù)據(jù)變量的影響程度，可以看出C-TG，A-FBG，B-FBG對(duì)主成分1（PC1）的載荷最大，表明C-TG，A-FBG，B-FBG是6種黃連飲片的主要藥效學(xué)差異，說(shuō)明黃連飲片在治療糖尿病高脂血癥方面可能療效較好，而具有較大影響的生物堿成分中是鹽酸非洲防己堿。

同時(shí)，對(duì)表4的數(shù)值，采用SPSS 22數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，對(duì)6種黃連飲片進(jìn)行HCA分析，應(yīng)用wards方法，生成dendrogram分層聚類譜系圖，見圖4。

由圖4可知，HCA可將6種黃連飲片聚類分成2類：酒蒸飲片、酒炙飲片、萸炙飲片為一類，生品飲片、姜炙飲片、醋炙飲片為一類，可以看出生品飲片與其他飲片（酒蒸飲片、酒炙飲片、萸炙飲片）基于生物堿含量-藥效學(xué)數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化變換數(shù)據(jù)。

存在明顯差異，其中酒蒸飲片與生品飲片差異最大，甚至可以單獨(dú)聚合成一類，說(shuō)明酒蒸飲片在6種黃連飲片中獨(dú)具“個(gè)性”，在糖尿病及其并發(fā)癥的防治方面，具有進(jìn)一步深入研究的必要。

從PCA，HCA的分析結(jié)果可以看出，本文使用的這2種數(shù)據(jù)挖掘方法都能夠?yàn)?種黃連飲片的分類提供一個(gè)可信的規(guī)律：生品飲片與其他飲片（酒蒸飲片、酒炙飲片、萸炙飲片，其中特別是酒蒸飲片可以單獨(dú)聚為一類）存在明顯差異；酒蒸飲片是歷代本草收載的飲片品種，6種黃連飲片中，生品黃連飲片與酒蒸黃連飲片之間存在最大的差異；對(duì)STZ 高脂復(fù)合小鼠糖尿病模型的血清甘油三酯（C-TG）、對(duì)四氧嘧啶致小鼠糖尿病模型的空腹血糖水平（B-FBG）、對(duì)高濃度葡萄糖致小鼠急性血糖升高模型的空腹血糖水平（A-FBG）的影響是6種黃連飲片在藥效學(xué)方面的主要差異。同時(shí)，PCA結(jié)果還提示，具有較大影響的生物堿成分是鹽酸非洲防己堿，但是，該成分是否與糖尿病及其并發(fā)癥防治的藥效學(xué)結(jié)果密切相關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究。

3 討論

文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道的HPLC測(cè)定的黃連及其炮制品的方法中多采用離子對(duì)色譜法，但是該條件下黃連中鹽酸藥根堿和鹽酸非洲防己堿的分離度達(dá)不到要求，而且加入離子對(duì)試劑（《中國(guó)藥典》2015年版一部黃連項(xiàng)下采用十二烷基硫酸鈉）的操作及干擾比較復(fù)雜。本文與文獻(xiàn)[7]均采用三乙胺為流動(dòng)相改性劑，在堿性條件下對(duì)6種黃連飲片中6種生物堿進(jìn)行分離，可將鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿完全分離，實(shí)現(xiàn)了同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定6種黃連飲片中6種主要生物堿的含量。本文還考察了大連依利特C₁₈色譜柱、Diamonsil C₁₈色譜柱，結(jié)果表明Xtimate_TMC₁₈色譜柱能夠適應(yīng)寬pH范圍（其允許的范圍為1.5～12），可以在堿性流動(dòng)相條件下抑制生物堿成分的離子化，與離子對(duì)試劑有相近的效果，從而在Xtimate_TMC₁₈色譜柱上實(shí)現(xiàn)了生物堿成分的良好分離，而前2種色譜柱可耐受的pH范圍較窄（僅為pH 2～8）。

本文建立了6種黃連飲片中6種生物堿成分的含量測(cè)定方法，需要使用6種生物堿對(duì)照品，日常測(cè)定中常有生物堿對(duì)照品供應(yīng)問(wèn)題，為簡(jiǎn)化含量測(cè)定操作，以鹽酸小檗堿為內(nèi)參物s，用一測(cè)多評(píng)法進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果表明鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿、鹽酸表小檗堿等4種生物堿成分符合《指南》[13]的RSD方面的要求，但是，本文由于黃連飲片樣品的批次數(shù)量不符合《指南》要求（每種黃連飲片僅有6批樣品），不能建立6種黃連飲片中這4種生物堿成分的一測(cè)多評(píng)法，僅適合建立傳統(tǒng)含量測(cè)定方法?！吨改稀吩诮⒎椒ōh(huán)節(jié)要求代表性樣品數(shù)量必須符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求 “原則上擬建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的藥材樣品不低于40批”。在驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)環(huán)節(jié)要求 “測(cè)定樣品應(yīng)≥30 批”，而鹽酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿2種生物堿成分暫不符合《指南》對(duì)RSD方面的要求，因此，本文沒(méi)有建立黃連飲片的一測(cè)多評(píng)法。在《中國(guó)藥典》2015年版一部黃連項(xiàng)下也僅建立了以小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀等4種生物堿成分的一測(cè)多評(píng)法，是否也是因?yàn)辂}酸藥根堿、鹽酸非洲防己堿2種生物堿成分的RSD超過(guò)了規(guī)定的5%，或是其他原因，這些都需要進(jìn)一步深入研究。

酒蒸黃連是歷代本草、醫(yī)籍收載品種[14]，明代《玉機(jī)微義》記載：“酒蒸黃連丸，治消渴，飲水無(wú)度至二三升，小便五七十次，發(fā)熱瘦弱，口干，食已如饑，此名消癉。今用味苦無(wú)毒，除熱正氣，消渴厚腸。消渴之人，脾胃惡濕，黃連為對(duì)。黃連凈，半斤，酒一升，湯重蒸。伏時(shí)曬干用，右末，滴水丸，梧子大，每五十丸食前溫水下?！泵鞔顣r(shí)珍也認(rèn)識(shí)到不同黃連飲片之間的臨床功能存在差異，總結(jié)歷代對(duì)黃連用藥經(jīng)驗(yàn)，在《本草綱目》中記載“治消渴，用酒蒸黃連”。由PCA，HCA的分析結(jié)果可知3種黃連飲片（酒蒸飲片、酒炙飲片、萸炙飲片）與生品飲片之間存在差異，特別是酒蒸飲片甚至可以單獨(dú)聚為一類，差異主要來(lái)源于藥效學(xué)結(jié)果中對(duì)STZ 高脂復(fù)合小鼠糖尿病模型的血清甘油三酯（C-TG）、對(duì)四氧嘧啶致小鼠糖尿病模型的空腹血糖水平（B-FBG）、對(duì)高濃度葡萄糖致小鼠急性血糖升高模型的空腹血糖水平（A-FBG）的影響，藥理研究結(jié)果表明酒蒸飲片、酒炙飲片、萸炙飲片都有明顯的降低空腹血糖水平的作用[9]，而且本文PCA，HCA的結(jié)果表明這3種黃連飲片與生品飲片的藥效學(xué)差異主要在明顯降低對(duì)STZ高脂復(fù)合小鼠糖尿病模型的血清甘油三酯（C-TG），對(duì)糖尿病模型的血脂、血糖具有明顯的影響，加之中醫(yī)臨床中應(yīng)用黃連“治消渴”（治療糖尿?。┯兄凭玫臍v史[14-15]，對(duì)酒蒸黃連治消渴作用更是“言之鑿鑿”，因此，酒蒸、酒炙、萸炙3種黃連飲片用于中醫(yī)臨床“治消渴”（防治糖尿?。└袃?yōu)勢(shì)，特別是在治療糖尿病高脂血癥方面的用途?？梢灶A(yù)見，酒蒸飲片、酒炙飲片、萸炙飲片在中醫(yī)臨床應(yīng)用中必將發(fā)揮其應(yīng)有的作用[16-18]。

本文的含量測(cè)定與前期藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)酒蒸、酒炙、萸炙3種黃連炮制品飲片與生品飲片的化學(xué)成分并未發(fā)生顯著變化，但在改善糖脂代謝紊亂等方面作用均明顯優(yōu)于生品飲片[19]，而且，在糖尿病及其并發(fā)癥防治方面，中醫(yī)古籍與現(xiàn)代研究均顯示出這3種黃連飲片具有良好的應(yīng)用前景，提示炮制可能改變了藥物在體內(nèi)的生物利用度。同時(shí)，PCA結(jié)果表明，6種生物堿成分中，具有較大影響的是鹽酸非洲防己堿，但是，目前非洲防己堿在糖尿病相關(guān)的生物活性方面研究不夠深入，該成分是否與糖尿病及其并發(fā)癥防治相關(guān)？是否還有其他成分的協(xié)同作用？有待進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

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