張曉燕，張慧慧，程敏，孫子龍，王俊東

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

氟對大鼠支持細(xì)胞緊密連接occludin基因與蛋白的影響

張曉燕，張慧慧，程敏，孫子龍，王俊東

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

試驗(yàn)旨在研究NaF對支持細(xì)胞occudin基因和蛋白表達(dá)的影響。采用不同濃度的NaF（0，0.1，1，10 mg/L）分別處理大鼠睪丸支持細(xì)胞48 h，qRT-PCR檢測occludin基因水平的變化，免疫熒光技術(shù)檢測occludin蛋白定位及水平的變化。結(jié)果顯示，與對照相比，10 mg/L NaF染毒，occludin mRNA相對表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；0.1，1.0 mg/LNaF染毒，occludin mRNA相對表達(dá)量下降，但差異不顯著；occludin蛋白隨著染氟劑量的增加，表達(dá)量逐漸降低，且occludin蛋白由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核附近的部位。說明NaF對支持細(xì)胞緊密連接的破壞可能與occudin基因與蛋白表達(dá)的變化有關(guān)。

氟化鈉；支持細(xì)胞；緊密連接；基因；蛋白

全世界大約有15%的家庭存在不孕不育問題，其中由男性因素導(dǎo)致的此問題高達(dá)50%[1]。不孕不育癥是繼癌癥和心血管疾病之后出現(xiàn)的新興全球公共衛(wèi)生疾病，所以，深入研究其原因是非常必要的[2]。眾多學(xué)者普遍認(rèn)為，環(huán)境污染是導(dǎo)致生殖功能損害的最重要因素之一，如鎘、雙酚A、全氟辛烷酸、三氧化二砷等[3]。氟是一種非常活潑的鹵族元素，以多種化合物形式存在，廣泛分布于水體、土壤、空氣、食物等環(huán)境中[4-5]。氟中毒的癥狀往往表現(xiàn)為氟斑牙、氟骨癥，但隨著研究的深入，現(xiàn)已證實(shí)氟對雄性生殖系統(tǒng)也有嚴(yán)重的毒性作用[6-7]。睪丸是雄性哺乳動(dòng)物重要的生殖器官和精子發(fā)生場所，其中，血睪屏障（BTB）保證了精子發(fā)生的順利進(jìn)行。BTB是動(dòng)物睪丸中血管和精細(xì)管之間的物理屏障，緊密連接是其主要的組成部分。已有研究表明，動(dòng)物睪丸中的支持細(xì)胞是氟暴露對雄性生殖毒性作用的靶細(xì)胞[8-9]。緊密連接存在于相鄰支持細(xì)胞基部兩側(cè)細(xì)胞膜之間，將生精上皮分成基底室和近腔室[10]。occludin蛋白是緊密連接中最重要的蛋白分子之一，與ZO-1等蛋白形成緊密連接的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。但氟對支持細(xì)胞occludin蛋白的影響幾乎未見報(bào)道。

本試驗(yàn)通過統(tǒng)計(jì)氟暴露對大鼠睪丸支持細(xì)胞緊密連接occludin基因和蛋白表達(dá)的影響，探討氟化鈉損傷睪丸支持細(xì)胞緊密連接的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物出生18～21 d的清潔級SD雄性大鼠，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、IV型膠原酶購于Sigma公司；Trizol，Prime-ScriptTMRT reagent Kit，SYBR@Premix Ex TaqTMII kit購于Takara公司；GATA4抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；occludin抗體、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 支持細(xì)胞的培養(yǎng)20 d左右的SD大鼠頸椎脫臼處死，分離睪丸，去除包膜，在PBS中靜置5min。加入10倍體積的0.1%IV型膠原酶，室溫振蕩7～10min，1000r/min離心5min。棄去上清，加入10倍體積的0.25%胰蛋白酶，室溫振蕩7～10 min，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液（89%DMEM/F12＋10%胎牛血清＋1%青鏈霉素）終止消化，0.074 mm篩網(wǎng)過濾收集懸液，1 000 r/min離心5 min。棄去上清，用PBS洗2次，DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，鋪板接種，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，用20 mmol/mLpH值7.4的Tris-HCl低滲處理2～5min；然后用DMEM/F12培養(yǎng)液洗2次，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 支持細(xì)胞的鑒定

1.2.2.1 HE染色選擇第2代細(xì)胞進(jìn)行HE染色，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，95%酒精固定15 min，蒸餾水洗3次，蘇木精染色2～3 min，自來水沖洗直至變藍(lán)，伊紅染色30 s，然后用一系列梯度酒精脫水處理，最后經(jīng)二甲苯透明、明膠封片后，置光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2.2 GATA4免疫熒光鑒定取出爬片，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，0.5%Tritonx-100破膜15 min，PBS洗3次，10%的山羊血清封閉30 min，加入兔抗鼠GATA4抗體（體積比為1∶100稀釋），4℃過夜，PBS洗3次，然后加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37℃避光孵育60 min，PBS洗3次，加入含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3 總RNA的提取采用Trizol法提取支持細(xì)胞總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。應(yīng)用Nanodrop ND-1000 spectrophotometer測定總RNA的濃度及A260/A280，A260/A230。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)美國國立生物信息技術(shù)中心（NCBI）公布的大鼠occludin，GAPDH基因序列，應(yīng)用Primer 3 Plus軟件設(shè)計(jì)其引物，所有引物均于上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成（表1）。

表1 基因引物序列

1.2.5 qRT-PCR反應(yīng)體系的建立采取2步法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。第1步將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，10 μL反應(yīng)體系：5 Prime-ScriptTMRT Master Mix 2.0 μL，Total RNA 2.0 μL，RNase Free ddH2O 6.0 μL；反應(yīng)條件：37℃15 min；85℃5 s。第2步為qRT-PCR反應(yīng)過程，10 μL反應(yīng)體系：SYBR PrimixExTaq II（2×）5.0 μL，正、反向引物各0.4 μL，ROXReferenceDyeII（50×）0.2μL，cDNA模板1 μL，RNase Free ddH2O 3.0 μL；反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，共45個(gè)循環(huán)；95℃1 min，55℃30 s，95℃30 s。采用ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA的表達(dá)量。

1.2.6 免疫熒光分析取出爬片，經(jīng)過4%的多聚甲醛固定，0.5%的Tritonx-100破膜，10%的山羊血清封閉，然后加入兔抗鼠occludin抗體（體積比為1∶50稀釋），4℃過夜，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，最后加入抗熒光淬滅封片劑，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 圖像分析與數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。差異顯著性利用one-way analysis of variance（ANOVA）方法進(jìn)行檢驗(yàn)。*表示P＜0.05差異顯著，**表示P＜0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 支持細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，支持細(xì)胞貼壁能力比較強(qiáng)，培養(yǎng)5 h之后開始貼壁，24～48 h之內(nèi)幾乎完全貼壁，由圓形變?yōu)槎噙呅危囵B(yǎng)液中懸浮著一些圓形的生精細(xì)胞，48 h后Tris-HCl低滲處理可以將其去除，得到圖1所示結(jié)果。細(xì)胞折光性降低，呈單層膜狀分布，胞質(zhì)完全鋪開，間隙縮小，細(xì)胞核清晰可見，呈圓形或橢圓形，此時(shí)核質(zhì)比為（7～9）∶1。

HE染色結(jié)果如圖2所示，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，有多個(gè)突起，相互連接成網(wǎng)狀，胞質(zhì)染色淡，胞核染色深，細(xì)胞核較大且輪廓清晰。

GATA4鑒定結(jié)果如圖3所示，支持細(xì)胞幾乎完全被熒光染料著色，驗(yàn)證了支持細(xì)胞是睪丸中唯一高表達(dá)GATA4的細(xì)胞。

2.2 NaF對緊密連接occludin基因的影響

熒光定量結(jié)果顯示（圖4），隨著染毒劑量的增加，occludin mRNA表達(dá)量降低，且10 mg/LNaF組與對照組相比差異顯著，而0.1，1.0 mg/LNaF組與對照組相比無顯著性變化。

2.3 NaF對緊密連接occludin蛋白的影響

采用免疫熒光法檢測occludin蛋白在氟中毒的支持細(xì)胞中的表達(dá)情況。由圖5可知，染氟48 h后，對照組支持細(xì)胞occludin蛋白主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，染氟組支持細(xì)胞occludin蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)靠近核的部位表達(dá)；且染氟組支持細(xì)胞occludin蛋白與對照組相比表達(dá)量降低，尤其10 mg/L染氟組降低明顯。

3 討論

精子的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分化過程，它包括3個(gè)階段，第1階段是有絲分裂，第2階段是減數(shù)分裂，第3階段是精子形成[11]。睪丸支持細(xì)胞是曲細(xì)精管內(nèi)唯一與生精細(xì)胞直接接觸的體細(xì)胞，在生精過程中起支持、免疫屏障等作用[12]。有研究表明，人類支持細(xì)胞在含有血清的培養(yǎng)基中，且不添加其他激素和生長因子的條件下能夠恢復(fù)增殖能力[13]。本試驗(yàn)選取的是18～20 d的大鼠，分離得到的支持細(xì)胞純度高達(dá)98%，此時(shí)支持細(xì)胞已經(jīng)分化完全，且停止分裂[12]。試驗(yàn)分離培養(yǎng)原代大鼠支持細(xì)胞運(yùn)用組合酶消化法和差速貼壁法[14]，剛分離的睪丸支持細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下呈圓形或橢圓形，貼壁后胞質(zhì)伸展，伸出偽足，呈不規(guī)則狀。

支持細(xì)胞的鑒定主要是靠形態(tài)觀察、富爾根染色、免疫組化、免疫熒光等。WT1在小鼠的胚胎期青青春期、成年期都有表達(dá)，但在睪丸的其他體細(xì)胞如間質(zhì)細(xì)胞和外周小管肌樣細(xì)胞內(nèi)，均未見到WT1的表達(dá)，表明WT1可以作為支持細(xì)胞的特異性蛋白分子[15]。SUN等[8]通過免疫組化的方法利用GATA4蛋白的高表達(dá)鑒定睪丸支持細(xì)胞。本試驗(yàn)對培養(yǎng)的支持細(xì)胞進(jìn)行HE染色和GATA4免疫熒光鑒定，結(jié)果符合支持細(xì)胞的特征，故判定培養(yǎng)的是純度極高的支持細(xì)胞。

在曲細(xì)精管中，細(xì)胞間連接分為緊密連接、橋粒連接、縫隙連接和胞質(zhì)外特化[2，16]，其中，緊密連接是血睪屏障最主要的組成部分，其主要由2種成分組成：跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白。occludin蛋白是第1個(gè)被確定的定位于緊密連接的完整膜蛋白，其基因在進(jìn)化上非常保守，其中，人、小鼠、狗的該基因有90%的同源性[17]。每一個(gè)occludin蛋白分子都有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，第1個(gè)細(xì)胞外環(huán)參與了細(xì)胞的黏附功能；第2個(gè)細(xì)胞外環(huán)是緊密連接建立和封閉功能所必需的[18]?？梢?，occludin蛋白是緊密連接功能能夠正常發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)，它在精子發(fā)生中及睪丸內(nèi)緊密連接屏障的形成和維持上具有重要作用。已有研究表明，全氟辛烷、氯化鎘、雙酚A等外源化合物誘導(dǎo)的支持細(xì)胞間的緊密連接破壞伴隨著occludin蛋白的表達(dá)下降[17，19]，但是氟暴露是否可以導(dǎo)致occludin蛋白的降低還需進(jìn)行深入探討。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞進(jìn)行染氟，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，隨著染氟劑量的增加，occludin基因和蛋白表達(dá)量都下降，且occludin蛋白由細(xì)胞膜逐漸轉(zhuǎn)移至靠近細(xì)胞核的部位，表明氟暴露影響occludin基因和蛋白的表達(dá)。由此推斷，氟暴露破環(huán)支持細(xì)胞之間的緊密連接，可能是由occludin基因和蛋白表達(dá)量的降低與occludin蛋白位置的改變導(dǎo)致的。

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Effect of Fluorine on Sertoli Cell Tight JunctionoccludinGene and Protein in Rat

ZHANGXiaoyan，ZHANGHuihui，CHENGMin，SUNZilong，WANGJundong
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The aim of this study was to figure out the effect of NaF on sertoli cell occludin gene and protein expression.Different concentrations of NaF（0,0.1,1.0,10 mg/L）were used to treat rat testis sertoli cells for 48 h,then detected occludin gene changes by qRT-PCR,the protein changes by immunofluorescence technique.The result showed that the relatire expression of occludin mRNA decreased remarkbly（P＜0.05）,when the cell was treated with 10 mg/LNaF,compared with other groups.When the cell was treated with 0.1,1.0 mg/L NaF,the relative expression of occludin mRNA decreased,but the difference was not significant.And occludin protein expression gradually decreased and transferred from cell membrane to near the nucleus with the increasing dose ofNaF.It illustrates that broken cell tight junction caused byNaF maybe associated with the changes of occludin gene and protein expression.

sodiumfluoride;sertoli cell;tight junction;gene;protein

R114

A

1002-2481（2017）04-0518-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.07

2017-01-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31540061）

張曉燕（1990-），女，山西長治人，在讀碩士，研究方向：環(huán)境獸醫(yī)學(xué)。王俊東、孫子龍為通信作者。