張國(guó)威，胡國(guó)文，牛鑫，汪泱，鄧志鋒

(1、泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271000；2、上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海200233；3、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西南昌330006；4、上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院四肢顯微外科研究所，上海200233)

人胚胎干細(xì)胞源性間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體生物學(xué)特性的研究

張國(guó)威1，2，胡國(guó)文3，牛鑫4，汪泱4，鄧志鋒2

(1、泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271000；2、上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海200233；3、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西南昌330006；4、上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院四肢顯微外科研究所，上海200233)

目的探討人胚胎干細(xì)胞源性間充質(zhì)干細(xì)胞(human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells，hESCMSCs)來(lái)源的外泌體的生物學(xué)特性。方法將已注冊(cè)的未分化、人類(lèi)ESC H9細(xì)胞系誘導(dǎo)成間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），通過(guò)旋轉(zhuǎn)超濾法從培養(yǎng)基中提取外泌體（exosomes）。流式細(xì)胞分析技術(shù)鑒定hESC-MSCs表面標(biāo)志物，對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行三系分化誘導(dǎo)，利用透射電鏡、Izon qNano納米粒子分析系統(tǒng)觀察外泌體的形態(tài)和大小，Western blotting鑒定外泌體表面特異性標(biāo)志物，觀察hESC-MSCs-Exo對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human microvascular endothelial cells，HMEC-1)增殖和遷移的影響。結(jié)果成功誘導(dǎo)形成hESC-MSCs，并收集純化外泌體。誘導(dǎo)后的MSCs CD29、CD73、CD90、CD105、CD146、CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD133、CD45、HLA-DR-PE表達(dá)陰性；hESC-MSCs通過(guò)誘導(dǎo)完成成骨、成脂和成軟骨分化；hESCMSCs-Exo為粒徑在40~100nm的囊泡，表達(dá)特異性的表面標(biāo)志物CD9、CD63和CD81；體外促進(jìn)HMEC-1的增殖和遷移。結(jié)論hESC-MSCs-Exo作為一種生物活性囊泡，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移；hESC-MSCs-Exo來(lái)源無(wú)限，可為臨床組織損傷的修復(fù)治療提供豐富的干細(xì)胞外泌體來(lái)源。

人胚胎干細(xì)胞源性間充質(zhì)干細(xì)胞；外泌體；生物學(xué)特性

近年來(lái)，大量文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)移植成體組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠減輕缺血后的組織損傷并促進(jìn)損傷組織的功能恢復(fù)[1-3]。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞在體外增殖能力有限，來(lái)源受限，且MSCs的生物學(xué)特性受供者機(jī)體狀態(tài)影響較大，限制了其臨床應(yīng)用。而人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)不但可以分化為組織中所有類(lèi)型的細(xì)胞，還具有無(wú)限擴(kuò)增的特性，有望成為MSCs潛在的細(xì)胞來(lái)源。隨著干細(xì)胞生物治療研究的逐漸深入，研究者發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞主要通過(guò)旁分泌機(jī)制發(fā)揮作用，其中外泌體（exosome）作為一種重要的旁分泌因子，近年受到廣大研究者的青睞[4，5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成間充質(zhì)干細(xì)胞（hESCMSCs），分析其外泌體（hESC-MSCs-Exo）的生物學(xué)特性，為組織損傷性疾病的干細(xì)胞生物治療提供新來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料、主要儀器和試劑實(shí)驗(yàn)所用的HMEC-1來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室凍存。細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)：Thermo Fisher，美國(guó)；恒溫CO2培養(yǎng)箱：Thermo，美國(guó)；透射電子顯微鏡：Hitachi公司，日本；化學(xué)發(fā)光成像分析儀（Image Quant LAS 4000mini）：GE Healthcare，瑞典；Beckman超高速離心機(jī)：Beckman Coulter，美國(guó)；qNANO納米粒子分析系統(tǒng)：Izon，新西蘭；CD29-PE，CD34-APC，CD44-FITC，CD45-FITC，CD73-PE，CD90-PE，CD105-FITC，CD133-PE，CD146-PE，HLA-DR-PE（小鼠抗人流式抗體）（BD Biosciences，美國(guó)）；Guava easyCyteTMsystem流式細(xì)胞儀（Millipore，美國(guó)）；牛血清白蛋白（BSA）（Gibco，美國(guó)）；成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；MSC無(wú)血清培養(yǎng)基（stemRD，美國(guó)）；兔抗人CD9，CD63，CD81單克隆抗體（Abcam，英國(guó)）；BCA試劑盒（Thermo Fisher，美國(guó)）。

1.2 hESC-MSCs的誘導(dǎo)分化以及hESC-MSCs-Exo的富集根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究的方法，將已注冊(cè)的未分化人類(lèi)ESC H9細(xì)胞系通過(guò)一步法誘導(dǎo)成MSCs[6]，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)超濾法提取外泌體并富集[7]。

1.3 hESC-MSCs表面標(biāo)志物的鑒定將細(xì)胞裝于1.5ml EP管中，4℃，2000r/min離心5min，去上清。加入1ml 1%BSA溶液吹散細(xì)胞并冰上靜置30min封閉非特異性抗原。再次4℃，2000r/min離心5min，去上清，分別按要求加入各種流式抗體：CD29-PE、CD34-APC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD133-PE、CD146-PE及HLA-DR-PE，冰上避光孵育45min，1%BSA清洗2遍后，按要求上樣并使用Guava easyCyteTMsystem流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 hESC-MSCs三系分化5×104細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)21d后4%多聚甲醛固定15min，清洗后加入適量茜素紅溶液觀察成骨分化；常規(guī)消化hESC-MSCs后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，細(xì)胞數(shù)約1× 106，1000r/min離心5min，棄上清，加入3ml成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)21d后4%多聚甲醛固定，行OCT包埋制作冰凍切片，1%甲苯胺藍(lán)染色后觀察成軟骨分化；5×104細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)21d后4%多聚甲醛固定15min，加入適量油紅O溶液，拍照記錄。

1.5 透射電子顯微鏡觀察hESC-MSCs-Exo形態(tài)吸取30μl的hESC-MSCs-Exo滴在2nm孔徑的載樣銅網(wǎng)正面，室溫，靜置3min，用濾紙輕輕從側(cè)邊吸干液體，隨后滴加3%醋酸雙氧鈾，室溫，2min，經(jīng)室溫下干燥后將銅網(wǎng)放置在樣品室內(nèi)，觀察hESC-MSCs-Exo的形態(tài)和大小，拍照記錄。

1.6 Izon qNano納米粒子分析系統(tǒng)檢測(cè)hESCMSCs-Exo參照產(chǎn)品使用說(shuō)明，調(diào)整電壓值0.58V，stretch調(diào)制46.2mm；加樣孔中加入35μl過(guò)濾的PBS溶液，調(diào)整電流穩(wěn)定于100~120mA之間；吸去PBS溶液，加入35μl：1000稀釋的CPC100標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)品中粒子數(shù)和粒子濃度；用PBS溶液清洗后，加入35μl 1：100稀釋的hESC-MSCs-Exo樣品，檢測(cè)外泌體粒徑和粒子濃度，重復(fù)測(cè)定3次，分析數(shù)據(jù)，導(dǎo)出分析報(bào)告和圖片。

1.7 Western blotting檢測(cè)hESC-MSCs-Exo特征性標(biāo)志物的表達(dá)采用超聲裂解法提取hESCMSCs-Exo內(nèi)的蛋白質(zhì)，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白濃度后，按常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗CD63(1：1000)、CD81(1：1000)、CD9(1：1000)，與二抗雜交后，通過(guò)化學(xué)發(fā)光法觀察，拍照并記錄。

1.8 hESC-MSCs-Exo對(duì)HMEC-1的增殖的影響將HMEC-1接種到96孔板，細(xì)胞5000個(gè)/孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12h后，加入培養(yǎng)基100μl，再加入1/10體積的CCK8，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h后，于酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，記做第0d。吸去孔內(nèi)溶液，分別加入含有2×109/mlhESC－MSCs－Exo的無(wú)血清培養(yǎng)基（外泌體組）及無(wú)血清培養(yǎng)基（對(duì)照組）各100μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。第1、2、3、4、5d相同時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行CCK8測(cè)量，重復(fù)3次，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1．9 hESC－MSCs－Exo對(duì)HMEC－1的遷移功能的影響將HMEC－1接種到12孔板內(nèi)，密度為2× 105/孔，當(dāng)細(xì)胞完全融合后，使用200μl槍頭進(jìn)行劃痕。用PBS反復(fù)清洗3遍后，加入含2×109/ml hESC－MSCs－Exo的無(wú)血清培養(yǎng)基（外泌體組）及無(wú)血清培養(yǎng)基（對(duì)照組）。在劃痕后0h、12、24h普通光學(xué)顯微鏡下拍照，使用Image J計(jì)算遷移率。

1．10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），兩組間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 hESC－MSCs成功分化后表面標(biāo)志物的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)后的hESC－MSCs表達(dá)CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146，不表達(dá)CD34、CD45、CD133、HLA－DR（圖1），這符合MSCs的特征。

流式分析間充質(zhì)干細(xì)胞表面陽(yáng)性標(biāo)志物CD29，CD44，CD73，CD90，CD105和CD146，以及陰性表面標(biāo)志物CD34，CD45，CD133和HLA－DR；Western blot檢測(cè)hESC－MSC－Exo標(biāo)志物CD9，CD63，CD81。

2．2 hESC－MSCs成骨、成脂和成軟骨分化成骨分化：hESC－MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)12d后可出現(xiàn)鈣鹽沉積，至成骨誘導(dǎo)20d后細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)大量鈣鹽沉積，細(xì)胞表面和周?chē)?jīng)茜素紅染色可見(jiàn)大量紅色著色，表明hESC－MSCss可成骨分化（圖2A）；成軟骨分化：hESC－MSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)20d后可見(jiàn)細(xì)胞聚集成球體狀，經(jīng)1%甲苯胺藍(lán)染色后，形成的軟骨基質(zhì)被染成藍(lán)色，表明hESC－MSCs可成軟骨分化（圖2C）；成脂分化：hESC－MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)7d后可見(jiàn)逐漸增大的胞體，14d后胞漿內(nèi)出現(xiàn)折光性強(qiáng)的脂肪小滴，并逐漸融合成大的脂肪滴，成脂誘導(dǎo)20d后細(xì)胞經(jīng)油紅O染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴，表明hESC－MSCs可成脂分化，這些符合MSCs的特征（圖2B）。

圖2 h ESC-MSC三系分化能力鑒定

2．3 hESC－MSCs－Exo的鑒定經(jīng)過(guò)超速離心結(jié)合旋轉(zhuǎn)超濾后獲得hESC－MSCs－Exo，透射電鏡下觀察到粒徑約100nm的球形囊泡（圖3A），qNANO納米粒子分析系統(tǒng)顯示外泌體粒徑范圍在40－100nm之間（圖3B），與電鏡結(jié)果相一致。同時(shí)，Western blotting結(jié)果顯示，hESC－MSCs－Exo表達(dá)CD9、CD63和CD81蛋白標(biāo)志物（圖3C）。

圖3 hESC-MSCs-Exo的特征

2．4 hESC－MSCs－Exo對(duì)HMCE－1的增殖的影響對(duì)照組的HMCE－1增殖曲線(xiàn)較為平坦，表現(xiàn)出增殖緩慢，而hESC－MSCs－Exo組內(nèi)的HMCE－1增殖曲線(xiàn)較為陡直，表現(xiàn)出增殖加快。在第2d后，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下hESC－MSCs－Exo組的吸光度值開(kāi)始較對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)果表明hESCMSCs－Exo能夠促進(jìn)HMCE－1的增殖（圖4）。

圖4 h ESC-MSCs-Exo對(duì)HMCE-1的增殖活力的影響

2．5 hESC－MSCs－Exo對(duì)HMCE－1的遷移的影響培養(yǎng)12h后，無(wú)血清培養(yǎng)基組HMCE－1的遷移指數(shù)為0．208±0．029，加入外泌體題組中HMCE－1的遷移指數(shù)為0．467±0．039，差異具有統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；培養(yǎng)24h后，無(wú)血清培養(yǎng)基組HMCE－1的遷移指數(shù)為0．413±0．035加入外泌體題組中HMCE－1的遷移指數(shù)0．773±0．041，差異具有統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（圖5），表明hESC－MSCs－Exo能促進(jìn)HMCE－1的遷移。

圖5 h ESC-MSCs-Exo對(duì)HMCE-1遷移能力的影響

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cells，MSCs)存在于多種組織器官當(dāng)中[8，9]，對(duì)組織損傷修復(fù)和疾病治療具有良好的作用，無(wú)成瘤性[10]，成為再生醫(yī)學(xué)理想的種子細(xì)胞之一。然而，成體間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源受限，取材具有一定的創(chuàng)傷性，并且易受到機(jī)體狀態(tài)的影響而具有一定的生物學(xué)差異，同時(shí)體外不能無(wú)限增殖，限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。人們發(fā)現(xiàn)，人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)能夠無(wú)限擴(kuò)增，具有向三胚層分化的能力，而成為最有潛力的種子細(xì)胞來(lái)源，然而成瘤性以及倫理宗教等是其面臨的主要問(wèn)題。研究者將人源ESCs定向誘導(dǎo)分化為間充質(zhì)干細(xì)胞，即為hESC－MSCs，與成體MSCs相比，二者的生物學(xué)特性和功能比較相似，并具有很好的均一性，無(wú)致瘤性[11，12]，來(lái)源充足。hESC－MSCs結(jié)合了ESCs和成體MSCs的優(yōu)點(diǎn)，避免了各自的缺陷，為干細(xì)胞生物治療提供了更廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)將人胚胎干細(xì)胞H9細(xì)胞系成功誘導(dǎo)成間充質(zhì)干細(xì)胞，并驗(yàn)證了其能夠表達(dá)表面特性標(biāo)志物分子以及成骨、成脂、成軟骨分化。

然而，在無(wú)限傳代過(guò)程中，有部分ESCs子代細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生染色體缺失或突變，影響其來(lái)源的hESC－MSCs的核型穩(wěn)定性；使hESC－MSCs存在核型變異的風(fēng)險(xiǎn)[13]。因此，發(fā)揮干細(xì)胞優(yōu)越功能的同時(shí)，思考如何避免潛在的移植風(fēng)險(xiǎn)，成為我們新的探究方向。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞主要通過(guò)旁分泌一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化分子和細(xì)胞外囊泡，發(fā)揮促組織修復(fù)作用[14]。Chen L等研究發(fā)現(xiàn)，在體外心臟前體細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠阻止缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，以及在心臟急性缺血再灌注小鼠模型中阻止心肌細(xì)胞的凋亡[15]。Bian S等人發(fā)現(xiàn)外泌體MSC－Exo具有與MSC相似的效果，在缺血性損傷中，促進(jìn)血管新生保護(hù)心肌組織[16]。外泌體包裹大量的生物活性物質(zhì)，如miRNA、mRNA、DNA和蛋白質(zhì)等，廣泛存在于各種組織細(xì)胞以及所有體液中；外泌體作為干細(xì)胞一個(gè)重要的旁分泌機(jī)制，在缺血性損傷中發(fā)揮主要的修復(fù)作用[17，18]；其效果類(lèi)似于來(lái)源干細(xì)胞移植修復(fù)損傷作用[17]，因此干細(xì)胞來(lái)源的外泌體，日益受到研究者的重視。

在修復(fù)缺血性損傷過(guò)程中，恢復(fù)血流灌注發(fā)揮重要的作用，我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞來(lái)源的外泌能夠促進(jìn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管，以此闡釋了干細(xì)胞的血管新生作用[19]。本研究通過(guò)旋轉(zhuǎn)超濾法，成功提取hESC－MSCs－Exo，檢測(cè)其表達(dá)外泌體特異性CD63、CD81和CD9表面分子；并能夠促進(jìn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human microvascular endothelial cells，HMEC－1)增殖和遷移，有望成為修復(fù)組織損傷的新型功能活性物質(zhì)的豐富來(lái)源。

[1]Hou B，Ma J，Guo X，et al.Exogenous neural stem cells transplantation as a potential therapy for photothrombotic ischemia stroke in kunming mice model[J].Mol Neurobiol，2017，54(2)：1254-1262.

[2]Zhu K，Li J，Wang Y，et al.Nanoparticles-assisted stem cell therapy for ischemic heart disease[J].Stem Cells Int，2016，2016：1384658.

[3]Shin JY，Yoon JK，Noh MK，et al.Enhancing therapeutic efficacy and reducing cell dosage in stem cell transplantation therapy for ischemic limb diseases by modifying the cell injection site[J].Tissue Eng Part A，2016，22(3-4)：349-362.

[4]Ratajczak MZ，Jadczyk T，Pedziwiatr D，et al.New advances in stem cell research：practical implications for regenerative medicine [J].Pol Arch Med Wewn，2014，124：417-426.

[5]Thery C，Zitvogel L，Amigorena S.Exosomes：composition，biogenesis and function[J].Nat Rev Immunol，2002 Aug；2(8)：569-579.

[6]胡國(guó)文，李青，牛鑫，等.人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為間充質(zhì)干細(xì)胞的方法研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2014，34（10）：1428-1434.

[7]胡國(guó)文，李青，牛鑫，等.旋轉(zhuǎn)超濾：一種提取細(xì)胞外泌體的新方法[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（6）：598-602.

[8]Wang S，Cheng H，Dai G，et al.Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation significantly improves neurological function in patients with sequelae of traumatic brain injury[J].Brain Res，2013，1532：76-84.

[9]Bao XJ，Liu FY，Lu S，et al.Transplantation of Flk-1+human bone marrow-derived mesenchymal stem cells promotes behavioral recovery and anti-infl ammatory and angiogenesis effects in an intracerebral hemorrhage rat model[J].Int J Mol Med，2013，31(5)：1087-1096.

[10]Kita K，Gauglitz GG，Phan TT，et al.Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane[J].Stem Cells Dev，2010，19(4)：491-502.

[11]Kita K，Gauglitz GG，Phan TT，et al.Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane[J].Stem Cells Dev，2010，19(4)：491-502.

[12]Gruenloh W，Kambal A，Sondergaard C，et al.Characterization and in vivo testing of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells[J].Tissue Eng Part A，2011，17(11/12)：1517-1525.

[13]Karagiannidou A，Varela I，Giannikou K，et al.Mesenchymal derivatives of genetically unstable human embryonic stem cells are maintained unstable but undergo senescence in culture as do bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Cell Reprogram，2014，16(1)：1-8.

[14]Kwon HM，Hur SM，Park KY，et al.Multiple paracrine factors secreted by mesenchymal stem cells contribute to angiogenesis[J]. Vasc Pharmacol，2014，63：19-28.

[15]Chen L，Wang Y，Pan Y，et al.Cardiac progenitor-derived exosomes protect ischemic myocardium from acute ischemia/reperfusion injury[J].Biochem Biophys Res Commun，2013，431(3)：566-571.

[16]Bian S，Zhang L，Duan L，et al.Extracellular vesicles derived from human bone marrow mesenchymal stem cells promote angiogenesis in a rat myocardial infarction model[J].J Mol Med(Berl)，2014，92 (4)：387-397.

[17]Camussi G，Deregibus MC，Cantaluppi V.Role of stem-cell-derived microvesicles in the paracrine action of stem cells[J]. Biochem Soc Trans，2013，41：283-287.

[18]Caplan AI，Dennis JE.Mesenchymal stem cells as trophic mediators[J].Cell.Biochem，2006，98：1076-1084.

[19]Zhang JY，Chen CY，Hu B，et al.Exosomes derived from human endothelial progenitor cells accelerate cutaneous wound healing by promoting angiogenesis through erk1/2 signaling[J].Int J Biol Sci，2016，12：1472-1487.

Study on the biological characteristics of exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchy-mal stem cells

ZHANG Guowei1，4，HU Guowen2，NIU Xin3，WANG Yang3，DENG Zhifeng4.1.Taishan Medical University，Shandong，271000；2.Department of Neurosurgery，the Sixth People's Hospital of Shanghai，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200233，China；3.Department of Neurosurgery of the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China；4.Institute of Microsurgery on Extremities，Shanghai Jiaotong University Affiliated Sixth People’s Hospital，Shanghai 200233，China.

Objective To investigate the biological characteristics of exosomes secreted by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells(hESC-MSCs-Exo).Method The registered undifferentiated human ESC H9 cell line was induced into mesenchymal stem cells(MSCs)in a modified one-step method.Exosomes were collected by ultracentrifugation from the culture medium of hESC-MSCs.The mesenchymal stem cells were identified by flow cytometry.The morphology and size of the exosomes were observed by transmission electron microscopy(TEM)and Izon qNano nanoparticles.Western blotting was used to identify the exosome.The effects of hESC-MSCs-Exo on the proliferation and migration of human microvascular endothelial cells (HMEC-1)were observed.Result hESC H9 cell line was efficiently induced into hESC-MSCs，and hESC-MSCs-Exo were collected and identified.hESC-MSCs were verified by positive markers for CD34，CD40，CD90，CD105，CD146，CD44 antigens，and negative markers for CD34，CD133，CD45 and HLA-DR-PE.And hESC-MSCs own the osteogenesis，chondrogenesis，and adipogenesis multi-differentiation potential.hESC-MSCs-Exo is a vesicle with a diameter of 40-100nm，which expresses specific surface markers CD9，CD63 and CD81，and promotes the proliferation and migration of HMEC-1 in vitro.Conclusion hESC-MSCs-Exo，as a bioactive vesicle，can promote vascular endothelial cells proliferation and migration and has a wide range of sources for the treatment of tissue damage.

Human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells；Exosomes；Biological characteristics

R329.2+8，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0143-05

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.003

2017-03-17；

2017-03-22)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目，編號(hào)81471243

張國(guó)威，男，1989年生，碩士研究生，研究方向：主要從事干細(xì)胞與損傷修復(fù)研究。E-mail：zgwei1989@qq.com

鄧志鋒，男，1963年生，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：干細(xì)胞與中樞系統(tǒng)再生修復(fù)。E-mail：dengzf63@126.com