陳敦雁，黃毅，邱福南，伍嚴(yán)安，黃肖利，李峰，吳文冰

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，1、檢驗(yàn)科；2、肝膽外科；3、病理科，福建福州350001)

eEF1A2基因沉默的原發(fā)性肝細(xì)胞癌BEL-7402細(xì)胞株的建立

陳敦雁1，黃毅1，邱福南2，伍嚴(yán)安1，黃肖利1，李峰3，吳文冰1

(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，1、檢驗(yàn)科；2、肝膽外科；3、病理科，福建福州350001)

目的本研究旨在構(gòu)建針對高表達(dá)真核翻譯延長因子1A2（eEF1A2）的原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）BEL－7402細(xì)胞株的eEF1A2－RNAi的細(xì)胞模型，為從基因沉默基因敲除層面研究eEF1A2在HCC潛在的致癌作用的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法通過針對eEF1A2基因的shRNA與線性化的GV115－GFP載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，對獲得的重組子(GV115－GFP－eEF1A2－shRNA)進(jìn)行PCR和測序鑒定。采用慢病毒載體系統(tǒng)將pHelper 1．0載體、pHelper 2．0載體與GV115－GFP－eEF1A2－shRNA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝成eEF1A2－RNAi－LV，并感染高表達(dá)eEF1A2的BEL－7402細(xì)胞。采用Real time PCR和Western blot法分別從mRNA和蛋白水平驗(yàn)證eEF1A2－RNAi－LV對BEL－7402細(xì)胞eEF1A2表達(dá)的抑制作用。結(jié)果成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)載體GV115－GFP－eEF1A2－shRNA，并通過慢病毒載體系統(tǒng)包裝成eEF1A2－RNAi－LV；將eEF1A2－RNAi－LV轉(zhuǎn)染至BEL－7402細(xì)胞后，細(xì)胞eEF1A2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別下降了84．1%和64．5%，與陰性對照組相比較具顯著性差異(P＜0．01)，表明轉(zhuǎn)染后的BEL－7402細(xì)胞eEF1A2基因被特異性沉默。結(jié)論成功構(gòu)建了eEF1A2－RNAi的BEL－7402細(xì)胞模型，為進(jìn)一步從基因敲除層面研究eEF1A2在HCC潛在的致癌作用奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

真核翻譯延長因子1A2；原發(fā)性肝細(xì)胞癌；BEL－7402細(xì)胞；RNA干擾；慢病毒載體

傳統(tǒng)觀念上人類真核翻譯延長因子1A（eEF1A）被認(rèn)為是管家蛋白，具有兩種異構(gòu)體：eEF1A1與eEF1A2，參與蛋白質(zhì)翻譯過程肽鏈的延長。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)eEF1A具有促進(jìn)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞增殖、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活動的作用，并可參與磷脂酰肌醇、鈣等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)[1]。這種多功能蛋白的特性使eEF1A具有潛在致癌作用，尤其表達(dá)具有組織特異性的eEF1A2被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在著異位高表達(dá)[2－5]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及生物學(xué)行為密切相關(guān)。

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一。HCC惡性程度度高，進(jìn)展快速，預(yù)后不良[6]。有學(xué)者利用微陣列-差異基因組雜交技術(shù)對HCC癌組織和細(xì)胞株進(jìn)行基因表達(dá)譜和候選基因的功能分析，發(fā)現(xiàn)20q13.3上的eEF1A2基因存在過表達(dá)[7]。在我們前期的研究中，亦發(fā)現(xiàn)eEF1A2在HCC癌組織存在著異位高表達(dá)，且其過表達(dá)可對HCC細(xì)胞的生物學(xué)行為造成明顯影響[8]。在此基礎(chǔ)上，為了深入研究eEF1A2在HCC中潛在癌蛋白的作用，本文擬構(gòu)建針對eEF1A2基因特定靶序列的shRNA慢病毒，并轉(zhuǎn)染至前期研究已表明為eEF1A2高表達(dá)的HCC細(xì)胞株BEL-7402[8]中，建立eEF1A2-RNAi的細(xì)胞模型，為從基因沉默層面進(jìn)一步研究eEF1A2基因在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人HCC細(xì)胞株BEL-7402購自中科院細(xì)胞所，用含10%胎牛血清（GIBCO公司）的DMEM培養(yǎng)液（GIBCO公司），置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3d換液傳代一次。

1.2 eEF1A2-RNAi-LV的構(gòu)建⑴eEF1A2-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的eEF1A2基因(NM_001958)編碼序列，按照siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)4條RNAi靶序列，RNAi#1：GTAC AAGATTGGCGGCATT，RNAi#2：AATGCGGAGGTA TTGACAA，RNAi#3：TCAAGAAGATCGGCTACAA，RNAi#4：ACTACATCACCATCATCGA；另設(shè)計(jì)陰性對照序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT，經(jīng)BLAST對比現(xiàn)有基因文庫中所有人源基因均無同源性。合成含RNAi靶序列的單鏈DNAoligo，退火配對產(chǎn)生雙鏈，再克隆入含Age I/EcoR I雙酶切位點(diǎn)的慢病毒表達(dá)載體GV115（購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）中，構(gòu)建重組GV115-GFP-eEF1A2-shRNA-1，2，3，4的慢病毒表達(dá)載體和陰性對照慢病毒載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，挑取重組陽性菌落行PCR及測序鑒定。

⑵慢病毒包裝與滴度檢測：通過Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）將構(gòu)建的重組慢病毒表達(dá)載體和相對應(yīng)的包裝質(zhì)粒pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝成eEF1A2-RNAi #1-LV、eEF1A2-RNAi#2-LV、eEF1A2-RNAi#3-LV、eEF1A2-RNAi#4-LV，48h后收集上清液，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度。即將病毒濃縮液10倍比梯度稀釋，使每100μl培養(yǎng)液中分別含慢病毒原液2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7ml；各取100μl上述慢病毒稀釋液加入每孔293T細(xì)胞中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，熒光顯微鏡觀察各孔中熒光細(xì)胞數(shù)量并測定滴度，病毒滴度(TU/ml)=帶有熒光的細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。

1.3 BEL-7402細(xì)胞的慢病毒感染將獲得的慢病毒按預(yù)先摸索的MOI值感染對數(shù)生長期的BEL-7402細(xì)胞，12h后吸去含病毒和聚凝胺的上清液，加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，感染3d后在熒光顯微鏡下觀察慢病毒上報(bào)告基因GFP的表達(dá)情況，感染效率大于80%者繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)三組，分別為NC組：陰性對照組（感染陰性對照shRNA慢病毒的細(xì)胞組），CON組：空白對照組（未感染慢病毒的細(xì)胞組），KD1組：敲除1組（感染eEF1A2-RNAi#1-LV的細(xì)胞組），KD2組：敲除2組（感染eEF1A2-RNAi#2-LV的細(xì)胞組），KD3組：敲除3組（感染eEF1A2-RNAi#3-LV的細(xì)胞組），KD4組：敲除4組（感染eEF1A2-RNAi#4-LV的細(xì)胞組）。

1.4 Real-time PCR法檢測BEL-7402細(xì)胞eEF1A2 mRNA的表達(dá)慢病毒感染5d后，收集各組細(xì)胞，用Trizol試劑（Invitrogen公司）提取總RNA，分別取2μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以SYBR GreenⅠ（ABI公司）為熒光染料，在Real-time PCR儀（ABI 7300）上分別行eEF1A2和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因的擴(kuò)增。eEF1A2上游引物：5'-GTCAAGGAAGTCAGCGCCTAC-3'；下游引物：5'-TGAACCACGGCATGTTGGG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為124bp；GAPDH上游引物：5'-TGACTTCAACAGCG ACACCCA-3'；下游引物：5'-CACCCTGTTGCTGTA GCCAAA-3，擴(kuò)增產(chǎn)物為121bp。Real-time PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃5s，60℃30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法比較各組eEF1A2 mRNA相對表達(dá)量。

1.5 Western blot法檢測BEL-7402細(xì)胞eEF1A2蛋白的表達(dá)慢病毒感染5d后，收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白并測定含量；分別取等量總蛋白99℃變性5min，進(jìn)行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜上；封閉NC膜1h，加入相應(yīng)抗體4℃孵育過夜，其中GAPDH兔抗購自Cell Signaling Technology公司，eEF1A2兔抗購自Novusbio公司；TBS洗滌后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（KPL公司），室溫孵育1h；TBS洗滌后加LumiGLO Chemiluminescent Substrat（KPL公司）室溫下孵育1min，曝光，洗片，然后在Gel Doc凝膠圖像分析儀（BIO－RAD公司）上掃描條帶的灰度，并以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算eEF1A2蛋白的相對表達(dá)量。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均在SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件包上進(jìn)行。其中陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)；定量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間均值的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 GVll5－eEF1A2－shRNA慢病毒表達(dá)載體的測序結(jié)果GVll5與含特定RNAi靶序列的DNAoligo經(jīng)酶切鏈接到病毒載體上，轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞后用菌落PCR篩選陽性克隆，將PCR陽性克隆進(jìn)行測序；在4種RNAi靶序列的慢病毒載體中，GVll5－GFP－eEF1A2－shRNA－4慢病毒表達(dá)載體的測序結(jié)果見圖1，分析顯示其含有正確的RNAi靶序列（下劃線部分）：ccgggtACTACATCACCATCATCGA ctcgagTCGATGATGGTGATGTAGTactttttg。

圖1 GVll5-GFP-e EF1A2-shRNA-4慢病毒表達(dá)載體的測序結(jié)果

2．2慢病毒滴度檢測包裝好的慢病毒經(jīng)熒光法測定病毒滴度(TU/ml)=帶有熒光的細(xì)胞數(shù)/病毒原液量=達(dá)4×108(TU/ml)。慢病毒感染293T細(xì)胞3d后，在倒置熒光顯微鏡下可見超過90%的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯GFP綠色熒光（見圖2）。

圖2 包裝慢病毒感染293T細(xì)胞檢測圖

2．3 BEL－7402細(xì)胞的慢病毒感染效率在倒置熒光顯微鏡下觀察感染慢病毒3d后的BEL－7402細(xì)胞，超過90%的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯GFP綠色熒光（見圖3）。

圖3 慢病毒感染BEL-7402細(xì)胞檢測圖

2．4 eEF1A2－RNAi－LV感染對BEL－7402細(xì)胞eEF1A2 mRNA表達(dá)的影響Real－time PCR法檢測結(jié)果顯示，與NC組相比較，KD1組、KD2組、KD3組、KD4組的eEF1A2 mRNA的表達(dá)水平分別下降了9．7%（P＞0．05）、40．9%（P＜0．05）、54．0%（P＜0．05）、84．1%（P＜0．01）；4種eEF1A2－RNAi－LV中，以eEF1A2－RNAi#4－LV對BEL－7402細(xì)胞eEF1A2 mRNA表達(dá)的抑制效率最高（見圖4）。

圖4 e EF1A2-RNAi-LV對BEL-7402細(xì)胞e EF1A2 mRNA表達(dá)的影響

2．5 eEF1A2－RNAi－LV感染對BEL－7402細(xì)胞eEF1A2蛋白表達(dá)的影響Western blot法檢測結(jié)果顯示，與NC組相比較，KD1組、KD2組、KD3組、KD4組的eEF1A2蛋白的表達(dá)水平分別下降了1．2%（P＞0．05）、19．6%（P＞0．05）、42．2%（P＜0．05）、64．5%（P＜0．01）；4種eEF1A2－RNAi－LV中，以eEF1A2－RNAi#4－LV對BEL－7402細(xì)胞eEF1A2蛋白表達(dá)的抑制效率最高（見圖5）。

圖5 e EF1A2-RNAi-LV對BEL-7402細(xì)胞e EF1A2蛋白表達(dá)的影響

2．6 eEF1A2－RNAi－LV感染BEL－7402細(xì)胞1個(gè)月后的穩(wěn)定性驗(yàn)證倒置熒光顯微鏡下觀察eEF1A2－RNAi#4－LV慢病毒感染1個(gè)月的BEL－7402細(xì)胞，結(jié)果顯示超過90%的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯GFP綠色熒光（見圖6）；Western blot法檢測結(jié)果顯示細(xì)胞eEF1A2蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)61．3%（見圖6）。

3 討論

作為一種在人類免疫缺陷型病毒(HIV)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基因治療載體，慢病毒它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，轉(zhuǎn)染效率高，并且可以將外源基因有效整合到宿主染色體上，達(dá)到穩(wěn)定、持久性的表達(dá)，此外，慢病毒還具有不產(chǎn)生任何有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，長期表達(dá)無病理損害現(xiàn)象發(fā)生的優(yōu)點(diǎn)[9－11]，因此其日漸成為了一種理想的基因運(yùn)輸工具。RNAi是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)、由特定酶參與的特異性基因沉默技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤相關(guān)致癌基因功能與機(jī)制的研究中[12]。采用慢病毒作為shRNA的攜帶者，可充分發(fā)揮慢病毒載體自身所具備優(yōu)勢，使shRNA在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、持久性的表達(dá)，有利于特定基因表達(dá)沉默細(xì)胞模型的建立，為從基因敲除層面進(jìn)行功能與機(jī)制的研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖6 e EF1A2-RNAi-LV感染BEL-7402細(xì)胞1個(gè)月后的穩(wěn)定性驗(yàn)證

為了保證shRNA序列的有效性，我們采用siRNA序列設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了4種針對eEF1A2的RNAi靶序列，測序結(jié)果顯示序列成功整合入GV115載體中；將包裝好的慢病毒導(dǎo)入BEL－7402細(xì)胞，顯示感染效率高達(dá)90%以上；根據(jù)沉默作用的結(jié)果，我們最終選取編號RNAi#4的靶序列作為針對eEF1A2的RNAi有效靶序列：ACTACATCACCATCATCGA。Real－time PCR法與Western blot法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)含RNAi#4靶序列的慢病毒感染5d后，BEL－7402細(xì)胞eEF1A2 mRNA與蛋白的表達(dá)被明顯抑制，與陰性對照組相比較，分別減少了84．1%與64．5%，提示該病毒能有效沉默BEL－7402細(xì)胞eEF1A2的表達(dá)。此外，對感染1個(gè)月后BEL－7402細(xì)胞的GFP綠色熒光與eEF1A2蛋白的表達(dá)情況予以檢測，結(jié)果顯示GFP的表達(dá)率仍高達(dá)90%以上，eEF1A2蛋白的表達(dá)仍被明顯抑制（P＜0．01），說明本研究成功構(gòu)建了eEF1A2基因穩(wěn)定沉默的BEL－7402細(xì)胞模型。

作為一種傳統(tǒng)的管家蛋白，eEF1A2僅存在于腦、心臟和骨骼肌，其表達(dá)具有組織局限性；但在對乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤癌組織的研究中，eEF1A2被發(fā)現(xiàn)存在異位高表達(dá)[2－5]，且能有效調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路主要效應(yīng)分子Akt的磷酸化，發(fā)揮潛在的致癌作用[13－14]。近來eEF1A2與HCC的相關(guān)性引起關(guān)注[7，15]。我們的前期研究結(jié)果表明eEF1A2在62例HCC癌組織的陽性率高達(dá)75．8%（47/62），而配對的癌旁組織僅5例呈弱陽性表達(dá)，正常肝臟組織均為陰性；過表達(dá)eEF1A2可增強(qiáng)HCC細(xì)胞的增殖能力，降低HCC細(xì)胞的分化程度，并促使細(xì)胞周期通過G0/G1期、進(jìn)入S期和G2/M期，以上結(jié)果提示eEF1A2的過表達(dá)可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[8]。細(xì)胞的增殖、分化及周期調(diào)控的生物學(xué)行為異常是腫瘤形成的重要基礎(chǔ)，是否eEF1A2基因沉默亦能對HCC細(xì)胞這些生物學(xué)行為發(fā)揮影響有待探討。為此，本研究運(yùn)用慢病毒基因干擾技術(shù)構(gòu)建了eEF1A2基因沉默的HCC細(xì)胞模型，驗(yàn)證結(jié)果表明該細(xì)胞模型實(shí)現(xiàn)了對eEF1A2基因的高效、穩(wěn)定沉默，這為進(jìn)一步從基因敲除層面深入研究eEF1A2在HCC潛在的致癌作用以及相應(yīng)作用機(jī)制提供了理想的工具細(xì)胞，奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Establishment of eEF1A2 Gene Silenced BEL-7402 Cell Line

CHEN Dunyan1，HUANG Yi1，QIU Funan2，WU Yanan1，HUANG Xiaoli1，LI Feng3，WU Wenbing1.1.Department of Clinical Laboratory；2.Department of Hepatobiliary Surgery；3.Department of Pathology，Provincial Clinical College，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China.

Objective To construct model cell line of eukaryotic elongation factor 1A2(eEF1A2)－RNAi in BEL－7402 cells with highly eEF1A2 expression as to provide a experimental basis for investigating the putative oncogene role of eEF1A2 on hepatocellular carcinoma(HCC)by the way of gene knockdown．Methods The shRNA targeting to eEF1A2 was ligated into linear GV115－GFP vector and transformed．Positive clone was identified by PCR and Sanger sequencing．pHelper 1．0，pHelper 2．0 and GV115－GFP－eEF1A2－shRNA were cotransformed into 293T cells by lentivius(LV)vector system，and then eEF1A2－RNAi－LV was transfected into BEL－7402 cells．The efficiency of eEF1A2－RNAi－LV on mRNA and protein in the infected cells were detected by real time PCR and western blot respectively．Results The recombinant eukaryotic expression vector GV115－GFP－eEF1A2－shRNA was constructed seccessfully and packed into eEF1A2－RNAi－LV by LV system．eEF1A2－RNAi－LV was transfected into BEL－7402 cells．Compared with negative control cells transfected with negative control LV，eEF1A2 mRNA and protein expression levels of BEL－7402 cells transfected with eEF1A2－RNAi－LV were significantly reduced 84．1%and 64．5%respectively (P＜0．01)．Conclusions It is concluded that the model cell line of eEF1A2－RNAi in BEL－7402 cells is successfully constructed，which might contribute to exploring the putative oncogene role of eEF1A2 on HCC by the way of gene knockdown．

Eukaryotic elongation factor 1A2；Hepatocellular carcinoma；BEL－7402 cell；RNA interference；Lentivirus vector

R735．7，R446．62

A

1674－1129(2017)02－0148－05

10．3969/j.issn.1674－1129．2017．02．004

2016－09－18；

2017－03－15)

福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目（No.2013-Z QN-JC-2）；福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（No.2014Y0009）

陳敦雁，男，1983年生，碩士學(xué)位，主管檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)分子和免疫學(xué)方向。

黃毅，男，1971年生，博士學(xué)位，主任檢驗(yàn)師，醫(yī)學(xué)分子和免疫學(xué)方向，E-mail：hyi8070@126.com。