湯增秋，熊小亮

(南昌大學醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，江西南昌330006)

miR-320a靶向FOXQ1抑制結腸癌細胞增殖和侵襲的分子機制

湯增秋，熊小亮

(南昌大學醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，江西南昌330006)

目的探討miR-320a在人結腸癌細胞中的生物學行為，并初步闡明miR-320a對癌基因FOXQ1的靶向調控機制。方法采用qRT-PCR檢測結腸癌細胞中miR-320a和FOXQ1的表達；用miR-320a mimics轉染結腸癌細胞株HTC-116；采用CCK-8法、克隆形成試驗檢測miR-320a對結腸癌細胞增殖的影響，采用Transwell小室分析miR-320a對結腸癌細胞侵襲能力的影響；雙熒光素酶報告基因和Western Bloting驗證miR-320a對FOXQ1的靶向調控作用。結果QRT-PCR結果顯示miR-320a mimics明顯上調miR-320a在HCT-116細胞中的表達；CCK-8法和克隆形成試驗顯示上調miR-320a表達顯著抑制結腸癌細胞增殖；Transwell試驗表明上調miR-320a可抑制HCT-116結腸癌細胞侵襲；蛋白印跡實驗顯示上調miR-320a降低FOXQ1蛋白在結腸癌細胞中的表達，雙熒光素酶報告基因試驗進一步確認miR-320a可以調控FOXQ1的表達。結論過表達miR-320a可以抑制結腸癌細胞增殖、侵襲，這種抑制作用是通過靶向調控FOXQ1來實現(xiàn)的。

miR-320a；結腸癌；FOXQ1

結腸癌屬常見的消化道惡性腫瘤，其在我國的發(fā)生率仍然呈明顯的增高趨勢[1]。過去30年來，結腸癌患者的5年生存率有所提高[2]，據(jù)統(tǒng)計，結腸癌5年生存率為74%，根治手術率為85%[3]。然而，至今為止，結腸癌的發(fā)病機制尚不明確，影響結腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制仍有待闡明。

miRNAs是19~24核苷酸長度的小片段非編碼RNA，通過直接靶向作用mRNA的3’UTR端抑制靶基因的轉錄或促進靶基因的降解[4]。許多研究表明，多種miRNAs在大腸癌中異常表達[5-8]，參與調節(jié)大腸癌細胞的生物學行為[9，10]，這其中包括miR-320家族成員[11]。miR-320a是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA，其在結腸癌中的表達及其調控的靶基因罕見報道。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-320a在結腸癌組織和結腸癌細胞系中表達下調[12]，通過上調miR-320a的表達可以抑制結腸癌細胞的增殖和轉移[13，14]，但其作用的機制尚不清楚。

FOXQ1屬于叉頭框轉錄因子家族的成員，在細胞生長、代謝、凋亡及癌變等生物學過程中發(fā)揮重要作用[15，16]。研究顯示，F(xiàn)OXQ1與人類腫瘤關系密切，在結直腸癌[17，18]、乳腺癌[19]、卵巢癌[20]、肺癌[21]、肝癌[22]等不同腫瘤中都出現(xiàn)高表達，并增強腫瘤的生長、遷移[17，19，20，23].在結直腸癌細胞實驗中發(fā)現(xiàn)可能存在幾種不同的調控FOXQ1表達的方式，例如Wnt信號通路[18，24]、TGF-β[24]、miR-342[25]，F(xiàn)OXQ1的激活進一步影響其下游靶基因如Fra-1[26]、p21[27]、Twist1[28]，從而促進腫瘤血管生成、腫瘤再生、腫瘤微環(huán)境改變以及上皮-間質轉化。上述研究表明，F(xiàn)OXQ1在結直腸癌中受到多種因子的調控，但是在結腸癌中，miR-320a是否是FOXQ1另一個調控因子，尚不清楚。

生物信息學軟件提示，miR-320a在FOXQ1 3’端非翻譯區(qū)存在潛在結合位點。因此，我們首次提出miR-320a在結腸癌中下調FOXQ1表達的假設，并通過實驗驗證了這一假設。

1 材料與方法

1.1 材料McCoy’s 5A培養(yǎng)基（武漢博士德公司），胎牛血清（北京全式金公司），Lipo2000脂質體轉染試劑（美國Invitrogen公司），雙熒光素酶報告系統(tǒng)（美國Promega公司），Transwell小室（美國Corning公司），結晶紫（上海高創(chuàng)公司），F(xiàn)OXQ1（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 HCT116結腸癌細胞株的培養(yǎng)及傳代實驗選用人HCT116細胞株，人HCT116細胞株為南昌大學第一附屬醫(yī)院科研中心提供。HCT116細胞株用含10%胎牛血清及1%青霉素和1%鏈霉素雙抗的McCoys’5A培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度約80%-90%時，用EDTA胰酶進行消化，適時加入血清終止消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)，實驗時選對數(shù)期生長的細胞。

1.2.2 細胞轉染人miR-320a mimics及陰性對照小干擾RNA購于上海吉馬公司。按照脂質體2000試劑使用說明操作，將miR-320a mimics轉染miR-320a低表達的HCT116細胞，并設立NC轉染的細胞為對照組，轉染后6h更換為完全培養(yǎng)基。

1.2.3 QRT-PCR檢測標本中miR-320a表達常規(guī)TRIzol試劑抽提總RNA，使用cDNA合成試劑盒進行逆轉錄反應。使用qPCR SuperMix進行實時定量PCR反應，U6和GAPDH分別作為檢測miR-320a和FOXQ1的指標。用目的基因表達量=2-△△Ct公式計算各樣本中miR-320a和FOXQ1的相對表達量。

1.2.4 Western blot檢測miRNA轉染后靶基因蛋白表達分別提取處理后各組細胞的總蛋白，并用10%SDS-PAGE電泳進行蛋白分離。通過濕法轉印將蛋白轉移到硝化纖維膜上，接著用5%的脫脂奶粉將膜封閉。按試劑盒說明書配置FOXQ1的一抗和二抗，先加入一抗4℃水平搖床過夜，然后加入二抗水平搖床反應60min。用化學發(fā)光試劑盒行化學發(fā)光顯色。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖轉染24h后，取HCT116細胞接種于96孔板。每孔加入溶液，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，用CCK-8法測細胞活力。

1.2.6 平板克隆形成實驗取對數(shù)生長期HCT116細胞，制備成單細胞懸液后計數(shù)，調整成103個細胞接種于6cm2培養(yǎng)皿中，約2周后用甲醇固定并用1g/L結晶紫染色，計數(shù)肉眼可見的克隆形成數(shù)，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。

1.2.7 Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力轉染后的細胞培養(yǎng)24h后，常規(guī)消化細胞制成單細胞懸液。將細胞接種于Transwell小室中，上室加入200μl無血清的McCoy’5A培養(yǎng)基，下室加入含10%FBS的McCoy’5A培養(yǎng)基500μl，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，結晶紫染色，在顯微鏡下觀察穿膜細胞，并計數(shù)取平均值。

1.2.8 熒光素酶報告基因試驗利用引物和聚合酶鏈式反應擴增與miR-320a有潛在結合位點的FOXQ1 3’非翻譯區(qū)序列。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收PCR產物，后將FOXQ1 3’UTR片段植入psiCHECK-2質粒中構建構建psiCHECK-2-FOXQ1-3’UTR表達載體，并驗證重組克隆片段的序列信息。將細胞均勻接種于96孔板中（每1個孔2×104個細胞/100μl），第2d分別轉染miR-320a mimics及陰性對照。轉染48h后，細胞經(jīng)雙蒸水稀釋后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入80μl的細胞裂解液，振蕩裂解細胞1h，12，000r/min離心1min沉淀雜質。吸出上清液，加入不透明96孔板中，并依次加入螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶底物。使用酶標儀檢測熒光強度，記錄并分析數(shù)據(jù)。

1.2.9 統(tǒng)計學分析實驗所得數(shù)據(jù)采用均值±標準差（x±s）表示，使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 miR－320a對結腸癌細胞增殖的影響轉染24h后，采用qRT－PCR檢測miR－320a表達，結果提示miR－320a mimics顯著提升了HCT116細胞中miR－320a的水平，見圖1a。CCK－8法和克隆形成實驗，結果分別顯示轉染miR－320a mimics后的HCT116細胞活力明顯下降，且其細胞克隆數(shù)較陰性對照組也明顯減少，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．5）。以上實驗結果提示，miR－320a mimics抑制了結腸癌細胞增殖。綜上，實驗結果表明上調miR－320a的表達顯著抑制結腸癌細胞增殖。

圖1 上調miR-320a顯著抑制結腸癌細胞HCT116的增殖

2．2 miR－320a對結腸癌細胞侵襲能力的影響轉染后48h，Transwell小室檢測細胞侵襲能力。結果顯示，上調miR－320a的水平HCT116細胞穿膜細胞數(shù)在侵襲實驗中明顯降低，見圖2。上述結果差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

圖2 過表達miR-320a抑制結腸癌細胞HCT116的侵襲（熒光× 200）

2．3 miR－320a在結腸癌細胞中與FOXQ1之間的相互關系為了驗證FOXQ1是否是miR－320a的直接靶基因，行雙熒光素酶報告基因實驗。實驗結果顯示，與對照組相比，miR－320a mimics組熒光酶活性降低，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見圖3a。進一步，Western blot實驗表明miR－320a可在轉錄后水平調控FOXQ1的表達，見圖3b。上述結果提示，在結腸癌細胞中，F(xiàn)OXQ1是miR－320a的直接靶標。

圖3 miR-320a靶向調控FOXQ1的表達

3 討論

研究顯示miR－320a在包括結腸癌在內的多種癌癥中表達下調[26]，也有一些實驗探究了miR－320a在結腸癌中的潛在功能。例如，Zhang Y等[27]發(fā)現(xiàn)發(fā)生肝轉移的結腸癌患者中miR－320a的表達水平明顯降低，miR－320a通過直接結合于神經(jīng)菌毛素1的3’UTR抑制結腸癌細胞肝轉移的遷移和侵襲能力。Hur K等[13]人多次實驗驗證后，也認為miR－320a可以作為檢測結腸癌患者癌細胞遠處轉移的生物學指標。Sun JY等[28]人報道了miR－320a還可以靶向作用β－catenin抑制結腸癌細胞的增殖。這些研究顯示，miR－320a可以多通路多角度地抑制結腸癌的發(fā)展進程。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)過表達miR－320a可以抑制HCT116結腸癌細胞的增殖和侵襲。實驗結果與前人的研究結果一致，進一步證實了miR－320a在結腸癌中的生物學功能。但是在miR－320a調控機制上，本研究結果首次顯示miR－320a通過靶向癌基因FOXQ1抑制結腸癌的發(fā)生發(fā)展。

FOXQ1基因定位在6p25．3，作為一類轉錄調控因子，可通過識別并結合相關下游靶基因的近端或遠端順式作用元件，實現(xiàn)對眾多下游靶基因表達水平的正向或負向調控。研究人員已經(jīng)證明，F(xiàn)OXQ1可能在人類腫瘤發(fā)生中起作用，尤其是在消化道腫瘤中的作用已成為近年研究的熱點。Kaneda H等[17]發(fā)現(xiàn)FOXQ1在結直腸癌中高表達，促進腫瘤形成、生成、血管生成和抗凋亡。Peng X等[24]也證實，F(xiàn)OXQ1在結直腸癌中過表達，并與結直腸癌臨床分期和淋巴結轉移密切相關。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)FOXQ1作為下游靶基因被多種分子調控。在結直腸癌中，F(xiàn)OXQ1被發(fā)現(xiàn)是Wnt信號通路的新靶基因[18]，也可以靶向作用TGF-β信號因子[24]。此外，有研究報道提示某些miRNA可以直接靶向FOXQ1影響腫瘤細胞的生物學過程。最近的一項研究顯示，在結直腸癌中，miR-342是FOXQ1的調控因子，過表達或抑制miR-342水平能調控FOXQ1基因的表達，促進結直腸癌細胞表型的變化[29]。生物學信息分析提示，miR-320a與FOXQ1存在潛在的結合位點，因此，我們篩選出miR-320a做進一步的研究。本研究中，通過雙熒光素酶報告基因實驗證明，miR-320a直接與FOXQ1的3’非編碼區(qū)結合抑制FOXQ1的轉錄，通過蛋白印劑實驗證明，miR-320a可以抑制FOXQ1的蛋白表達。我們的研究結果顯示miR-320a通過靶向FOXQ1抑制結腸癌細胞增殖和侵襲，為miR-320a在腸癌中的作用增添了新的機制。

總之，本實驗發(fā)現(xiàn)miR-320a可以抑制結腸癌細胞的增殖和侵襲，其抑制作用是通過靶向癌基因FOXQ1來實現(xiàn)的，闡明了miR-320a通過FOXQ1介導抑制結腸癌發(fā)生發(fā)展，為結腸癌發(fā)病機制和診斷治療的研究提供了新的思路和實驗基礎。

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miR-320a inhibits cell proliferation and invasion in colon cancer by targeting FOXQ1

TANG Zengqiu，XIONG Xiaoliang. Department of Pathology and Pathophysiology，Medical College of Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Objective To investigate the effect of miR-320a on colon cancer biological process，and clarify whether FOXQ1 is a direct target of miR-320a in HCT116 cells.Methods The expression of miR-320a and FOXQ1 was detected by Real-time PCR in colon cancer cells.The HTC-116 colon cancer cell line was transfected with miR-320a mimics.The CCK8 and colony formation assay were used to evaluate the cell proliferation.Transwell chamber was utilized to analyze the effects of miR-320a on invasion of HCT116 cells.Western blot and dual luciferase reporter experiments were employed to examine the regulation of miR-320a on FOXQ1.Results The result of Real-time PCR analysis indicated that miR-320a mimics significantly increased miR-320a levels in HCT-116 cells.The CCK8 and colony formation assay results showed miR-320a inhibited the HCT-116 cell proliferation.Up-regulation of miR-320a impaired the invasive abilities of HCT-116 cells.The Western blot results showed miR-320a reduced FOXQ1 protein level and double-luciferase reporter experiments，confirming that miR-320a could directly regulate FOXQ1 expression in colon cancer cells further.Conclusion miR-320a inhibited cell proliferation，migration and invasion by directly targeting FOXQ1.

miR-320a；FOXQ1；Colon cancer

R735.3+5，Q522

A

1674-1129(2017)02-0167-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.009

2017-02-13；

2017-02-14)

湯增秋，男，1988年生，南昌大學醫(yī)學院病理學與病理生理學在讀研究生，主要研究法醫(yī)病理學與法醫(yī)DNA。

熊小亮，男，1970年生，副教授，碩士研究生導師，主要研究病理學與病理生理學。