李東嫻++杜春華++牛延菲++曹紅云++普冰清++游燕

【摘要】目的：研究大黃飲片微生物限度檢查的方法。方法：按《中國藥典》2015年版通則1105、1106、1107進行方法的建立和驗證。結(jié)果：大黃飲片對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢菌、乙型副傷寒沙門菌有一定的抑制作用，故需氧菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法進行檢測，霉菌和酵母菌計數(shù)、耐膽鹽革蘭氏陰性菌、大腸埃希菌使用常規(guī)法進行檢測，沙門菌檢測中使用300mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)。結(jié)論：該方法可以用于大黃的微生物限度檢查。

【關(guān)鍵詞】大黃；微生物限度；方法適應(yīng)性

【中圖分類號】R284【文獻標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）07-0046-03

Validation on Microbial Limit Test Method of Chinese Rhubarb

LI DongxianDU ChunhuaNIU YanfeiCAO HongyunPU BingqingYOU Yan*

Yunnan Baiyao Group Innovation and R&D Center /Yunnan Institute of Materia Medica/Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation， Kunming 650111， China

Abstract：Objective To research the microbial limit test ways for Chinese rhubarb. Methods A microbial limits method of Chinese Pharmacopeia （2015 edition） General rule 1105，1106 and 1107.Results The validation on microbial limit test method of Chinese rhubarb suggest that Staphylococcus aureus， bacillus subtilis and Salmonella paratyphi B inhibitory effect. Medium dilution method couldbe used for total aerobic bacteria count. The conventional method couldbe used for total combined Molds and yeasts count， test for Escherichia coli and test for Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria. TSB （300mL） should be used for test for salmonella.Conclusion Thismethod can eliminate the antimicrobial properties and it can be used for the microbial limit test for Chinese rhubarb.

Keywords：Chinese Rhubarb； Microbial Limit Test； Validation

中藥材的品質(zhì)關(guān)系著中成藥的質(zhì)量和使用中藥材患者的健康，《中國藥典》2015版已經(jīng)對中藥提取物和中藥飲片的微生物限度做出了規(guī)定[1]，但國內(nèi)關(guān)于中藥飲片微生物限度檢查的研究卻不多。

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L、唐古特大黃Rheum tanguticum Maximex Balf和藥用大黃Rheum officinale Baill的干燥根莖，主要功效為瀉下通便、清熱解毒、活血化瘀等[2]，并具有一定的抑菌作用[3-8]。文獻報道，大黃對幽門螺旋桿菌具有很強的抑菌活性[2]，大黃蒽醌衍生物也對葡萄球菌、鏈球菌有顯著抗菌功效，藥典中規(guī)定的方法適應(yīng)性驗證試驗菌株如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌也可以在大黃蒽醌衍生物的抗菌譜中找到[4]，同時大黃對肺炎克雷伯菌[5]、沙眼衣原體[6]、糞腸球菌[7]等也有體外抑菌活性。

對具有抑菌作用的藥品進行微生物限度檢查方法適應(yīng)性驗證，一直是微生物檢測工作中的難點，筆者對大黃飲片進行微生物檢查法進行方法學(xué)考察，可以為研究中藥材微生物限度檢查法提供相關(guān)理論基礎(chǔ)，并對含大黃的中成藥的微生物限度檢查具有一定的參考價值。

1實驗材料

11樣品大黃飲片（云南健之佳連鎖健康藥房，購買不同連鎖店共3批藥材，編號為1、2、3號樣，經(jīng)云南省藥物所究所天然藥物資源研究中心高級工程師邱斌鑒定來源于蓼科植物掌葉大黃Rheum palmalum L）。

12稀釋劑及培養(yǎng)基pH 70氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸道增菌肉湯、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

13菌種金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003 第3代〕、大腸埃希菌〔CMCC（B）44102 第4代〕、枯草芽孢桿菌〔CMCC（B）63501 第4代〕、銅綠假單胞菌〔CMCC（B）10104 第3代〕和白色念珠菌〔CMCC（F）10123 第3代〕均由云南省食品藥品檢驗所提供，黑曲霉[CMCC （ B） 98 003第3代]，由中國藥品生物制品檢定所提供。

2方法與結(jié)果

參照《中國藥典》2015年版第四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查（1105、1106、1107）。

21菌液制備接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24h。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20～25℃培養(yǎng)2～3d。取接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20～25℃培養(yǎng)5～7d。取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物用09%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，加入3～5mL含005%聚山梨酯80的09%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，之后用含005%聚山梨酯80的09%無菌氯化鈉溶液將孢子懸液稀釋成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。

22供試品的制備將購買的大黃飲片置于用酒精棉球擦拭過的萬用粉碎機中，粉碎，用滅菌的藥匙將大黃粉末移動至滅菌廣口瓶中待用。

23供試液的制備取大黃粉末10g，加pH 70氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL，制成1∶10供試液。依次稀釋為1∶50、1∶100稀釋液。

24計數(shù)方法適用性試驗

241需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗試驗組取1∶10、1∶50、1∶100供試液99ML于滅菌試管中，加入制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液01mL，使其終濃度為每1mL含菌落數(shù)不大于100cfu的菌液，從試管中吸取1mL注入滅菌平皿中，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30～35℃培養(yǎng)48h。每個菌種平行制備2個平皿，測定試驗組的菌落數(shù)。

供試品對照組取1∶10、1∶50、1∶100供試液99mL于滅菌試管中，加pH 70氯化鈉-蛋白胨緩沖液01mL，其余按試驗組操作，測定供試品對照組的菌落數(shù)。

菌液對照組取pH 70氯化鈉-蛋白胨緩沖液99mL于滅菌試管中，加入制備好的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液01mL，使其終濃度為每1mL不大于100cfu的菌液，其余按試驗組操作，測定菌液對照組的菌落數(shù)。

陰性對照組取pH 70氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL，加入霉菌平皿中，其余按試驗組操作，平行做兩個皿。

按[回收率=（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)]計算回收率。

可知，使用100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)的方法不適用于大黃飲片沙門菌的檢查，故采用薄膜過濾和增加增菌培養(yǎng)培養(yǎng)基體積的方法再次進行適用性試驗。

244增加增菌培養(yǎng)培養(yǎng)基體積方法的適用性試驗在薄膜過濾法中，供試液無法通過045微米孔徑濾膜，該方法不適用于大黃的沙門菌檢測，已是采用增加增菌培養(yǎng)培養(yǎng)基體積方法。

增菌培養(yǎng)使用200mL（300mL）胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。取大黃粉末10g，及乙型副傷寒沙門菌菌懸液1mL加入200mL（300mL）胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，按藥典相應(yīng)控制菌項下的檢查法進行適用性試驗。結(jié)果顯示，增菌時使用體積為300mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，可以用于大黃的沙門菌檢查。

3討論

藥理研究[4]表明，大黃具有瀉下、抑菌、抗腫瘤、雙向調(diào)節(jié)血壓等作用，本實驗結(jié)果進一步證明了大黃的體外抑菌作用?，F(xiàn)分別對大黃微生物限度檢查方法的建立和對不同菌株的抑菌作用討論如下。

31方法適應(yīng)性驗證結(jié)果分析實驗結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢菌用1∶10普通平皿法進行方法適用性驗證，回收率無法達到要求，需稀釋至1∶50回收率才能達到2015版《中國藥典》05～20的要求。沙門菌以100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)無法檢出，需增加培養(yǎng)基至300mL方能檢出。故大黃飲片的需氧菌總數(shù)應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法，取1∶10稀釋液1mL，每皿加05mL，作為1組，1∶10稀釋級共做2組，1∶100及更高稀釋劑按普通平皿法進行檢測。霉菌和酵母菌總數(shù)使用普通平皿法進行檢測；耐膽鹽革蘭陰性菌，可用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基稀釋成1∶10進行預(yù)培養(yǎng)；大腸埃希菌和沙門菌分別使用100mL和300mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)。

32大黃飲片的抑菌作用大黃飲片對兩種革蘭氏陽性菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢菌有一定的抑制作用。文獻報道，大黃對葡萄球菌有抑制作用[5]，與本實驗結(jié)果相符。而大黃對于枯草芽孢菌的抑制作用，在此之前未見文獻報道。文獻關(guān)于大黃對副傷寒沙門菌的抑菌作用[6]，本實驗也得到了相同的結(jié)論。另外，關(guān)于大黃對大腸埃希菌及銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性菌的抑制作用，文獻中有不同說法[7-8]，本實驗中并未發(fā)現(xiàn)大黃對大腸埃希菌及銅綠假單胞菌有抑制作用，但由于按2015版《中國藥典》中控制菌檢測相關(guān)規(guī)定，大腸埃希菌檢查時加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中及耐膽鹽革蘭陰性菌檢查時加入腸道增菌肉湯中培養(yǎng)的樣品量均為1g，而沙門菌檢測加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中的樣品量為10g?？赡苡捎诖竽c埃希菌和銅綠假單孢菌實驗中加入的樣品量較少，而沒有表現(xiàn)出大黃對這兩種菌株的抑制作用。

國內(nèi)原料藥材和飲片的微生物限度檢查工作尚處于起步階段，筆者對具有抑菌性的大黃飲片微生物限度方法學(xué)適用性驗證進行研究，有助于促進中藥材及中藥飲片微生物限度標(biāo)準的進一步完善。

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（收稿日期：2017-02-13編輯：穆麗華）