李紅彬，王 磊，董成賓，邱 斌，唐小龍，吳一凡，范振華，劉福全

(首都醫(yī)科大學(xué)北京世紀(jì)壇醫(yī)院介入治療科, 北京 100038)

門靜脈灌注80%乙醇建立豬肝硬化門靜脈高壓模型

李紅彬，王 磊，董成賓，邱 斌，唐小龍，吳一凡，范振華，劉福全*

(首都醫(yī)科大學(xué)北京世紀(jì)壇醫(yī)院介入治療科, 北京 100038)

目的 探討門靜脈灌注80%乙醇建立豬肝硬化門靜脈高壓動(dòng)物模型的可行性。方法 選取健康貴州小型香豬13只，隨機(jī)分為3組：實(shí)驗(yàn)1組(5只)、2組(5只)及對(duì)照組(3只)，實(shí)驗(yàn)1、2組門靜脈分別灌注80%乙醇5 ml及10 ml，對(duì)照組灌注生理鹽水10 ml，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)豬于灌注前、灌注后即刻、灌注后6周行直接門靜脈造影測(cè)量門靜脈壓力及直徑；灌注前及灌注后6 h內(nèi)、術(shù)后1～6周行肝組織活檢；灌注前及灌注后6周分別行增強(qiáng)CT；灌注后6周解剖所有實(shí)驗(yàn)豬，對(duì)肝臟各葉標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)檢查。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)1組及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)豬灌注前、后門靜脈直徑及壓力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)2組灌注后即刻、灌注后6周與灌注前比較，門靜脈直徑及壓力的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)1、2組灌注后所有實(shí)驗(yàn)豬均形成肝纖維化，灌注后6周實(shí)驗(yàn)1組2只、實(shí)驗(yàn)2組5只纖維化METAVIR評(píng)分達(dá)4級(jí)。結(jié)論 經(jīng)門靜脈灌注80%乙醇更適宜構(gòu)建肝硬化門靜脈高壓動(dòng)物模型。

乙醇；門靜脈灌注；肝硬化；高血壓門靜脈；動(dòng)物模型

應(yīng)用小動(dòng)物建立肝硬化模型已有較多報(bào)道[1-3]，建立大動(dòng)物特定肝硬化或門靜脈高壓模型亦有報(bào)道[4-5]，但通過肝動(dòng)脈或門靜脈栓塞建立肝硬化模型還處于探索階段[6-8]，尚不能完全模擬最常見的炎性及酒精性肝硬化發(fā)生發(fā)展的病理過程。本研究經(jīng)門靜脈灌注乙醇建立具有與人類相似的早期病理發(fā)展過程的豬肝硬化門靜脈高壓模型，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康貴州小型香豬13只，3月齡，體質(zhì)量31～35 kg，平均(32.5±1.9)kg，隨機(jī)分為3組：實(shí)驗(yàn)1組(5只)、實(shí)驗(yàn)2組(5只)及對(duì)照組(3只)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京世紀(jì)壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房購置于北京科興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠，本實(shí)驗(yàn)通過北京世紀(jì)壇醫(yī)院科學(xué)倫理委員會(huì)審查同意。

1.2動(dòng)物模型的建立 自豬耳緣靜脈穿刺建立靜脈通路，注射氯胺酮13 mg/kg體質(zhì)量、咪唑安定0.1 mg/kg體質(zhì)量、阿托品0.05 mg/kg體質(zhì)量復(fù)合液進(jìn)行基礎(chǔ)麻醉。應(yīng)用一步法經(jīng)皮肝穿刺門靜脈成功后，門靜脈內(nèi)留置6F端側(cè)孔豬尾導(dǎo)管，導(dǎo)管的體外部分固定于實(shí)驗(yàn)豬的側(cè)腹壁皮下。若穿刺門靜脈失敗，先經(jīng)脾動(dòng)脈間接門靜脈造影，標(biāo)記后再穿刺門靜脈。實(shí)驗(yàn)1、2組實(shí)驗(yàn)豬經(jīng)門靜脈主干分別以0.3 ml/s流速灌注80%乙醇5 ml及10 ml；對(duì)照組以相同流速灌注生理鹽水10 ml。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.1影像學(xué)檢查 ①門靜脈造影：采用Siemens Artis Zee AX2IOM血管造影系統(tǒng)。對(duì)比劑采用碘海醇，于灌注前、灌注后即刻及灌注6周后行門靜脈造影，測(cè)量門靜脈壓力及直徑。②腹部增強(qiáng)CT：灌注前及灌注后6周采用Dyna-CT于MIP模式下行腹部增強(qiáng)CT檢查，記錄肝、脾體積。

1.3.2實(shí)驗(yàn)室檢查 灌注前及灌注后第6周均行血常規(guī)、血生化(肝功能)、凝血功能及血氨檢測(cè)。

1.3.3病理學(xué)檢查 ①活檢病理：術(shù)前及術(shù)后6 h內(nèi)、術(shù)后1～6周進(jìn)行肝組織多部位、多點(diǎn)活檢，行病理學(xué)檢查及METAVIR評(píng)分。②大體標(biāo)本病理：術(shù)后6周解剖所有實(shí)驗(yàn)豬。取出肝、脾、食管、胃、心、肺及腎臟，均行病理學(xué)檢查。對(duì)肝臟各葉進(jìn)行多點(diǎn)組織采樣及病理染色，應(yīng)用圖像分析軟件將肝組織纖維化的程度分為4級(jí)，0級(jí)為無纖維化；1級(jí)，纖維化比例<10%；2級(jí)，纖維化比例為10%～20%；3級(jí)，纖維化比例為21%～50%；4級(jí)，纖維化比例≥51%。

2 結(jié)果

所有實(shí)驗(yàn)豬術(shù)后均予抗感染、抗凝處理，無死亡，至術(shù)后6周體質(zhì)量增加3.9～5.8 kg，平均(4.9±0.8)kg。

2.1影像學(xué)結(jié)果

2.1.1門靜脈 實(shí)驗(yàn)1組3只動(dòng)物灌注后即刻出現(xiàn)門靜脈分支輕微減少(門靜脈4級(jí)以下血管減少)，門靜脈主干及大分支未見血栓形成，無肝內(nèi)門靜脈側(cè)支及肝外門—體側(cè)支循環(huán)形成；灌注前、灌注后即刻、灌注后6周門靜脈直徑及壓力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

實(shí)驗(yàn)2組灌注后即刻與灌注前相比較，全部動(dòng)物門靜脈分支明顯減少(門靜脈3級(jí)以下血管減少)，門靜脈主干及大分支見血栓形成(圖1A、1B)、門靜脈直徑增寬(t=11.200，P<0.001)、門靜脈壓力升高(t=7.129，P<0.001)。灌注后6周與灌注前相比較，肝內(nèi)門靜脈出現(xiàn)不同程度的側(cè)支血管(圖1C)，門靜脈主干直徑大于灌注前(t=5.108，P=0.001)，門靜脈壓力高于灌注前(t=4.603，P=0.002)。見表1。

表1 3組灌注前后門靜脈直徑和壓力變化±s)

注：*：與同組灌注前比較P<0.05

對(duì)照組：所有動(dòng)物灌注前后門靜脈直徑及壓力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.1.2肝脾體積 實(shí)驗(yàn)1組及對(duì)照組灌注前后肝脾體積無明顯變化(P均>0.05)。實(shí)驗(yàn)2組動(dòng)物灌注后6周肝脾體積較灌注前增大(肝臟：t=2.64，P=0.030；脾臟t=2.63，P=0.030；表2)，但密度均勻，邊緣整齊(圖2)。

2.2實(shí)驗(yàn)室檢查 實(shí)驗(yàn)1、2組及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌注前與灌注后6周氨基轉(zhuǎn)移酶的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表2)，余血常規(guī)、凝血功能及血氨檢查結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3病理學(xué)改變 灌注不同濃度乙醇6 h內(nèi)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)豬肝活檢組織病理變化見表3、圖3。實(shí)驗(yàn)1組2只、實(shí)驗(yàn)2組5只實(shí)驗(yàn)豬出現(xiàn)肝臟微小血管內(nèi)血栓形成、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肝細(xì)胞變性壞死及炎細(xì)胞浸潤等早期病理學(xué)變化。對(duì)照組均無明顯變化。

實(shí)驗(yàn)1組灌注后所有實(shí)驗(yàn)豬均形成肝纖維化，隨著時(shí)間的延長，纖維化的級(jí)別不同，2只實(shí)驗(yàn)豬在不同時(shí)間形成肝硬化；實(shí)驗(yàn)2組所有實(shí)驗(yàn)豬肝纖維化均達(dá)到4級(jí)，并較早形成肝硬化；對(duì)照組所有實(shí)驗(yàn)豬均無纖維化改變(表4)。實(shí)驗(yàn)1組2只、實(shí)驗(yàn)2組5只實(shí)驗(yàn)豬肝大體標(biāo)本顯示早期肝硬化的基本特征：體積增大、組織變硬、彈性差(圖4A、4B)、肝臟表面出現(xiàn)均勻的再生小結(jié)節(jié)(圖4C)。發(fā)生肝硬化的7只實(shí)驗(yàn)豬脾臟均合并不同程度的脾淤血(圖4D)，其余實(shí)驗(yàn)豬的脾、心、肺、腎及胃組織學(xué)均正常。

表2 3組灌注前及灌注后6周肝脾體積及轉(zhuǎn)氨酶變化±s)

注：*：與同組灌注前比較，P<0.05；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶

圖1 實(shí)驗(yàn)2組門靜脈造影 A.灌注前直接門靜脈造影示門靜脈分支清晰； B.灌注后即刻造影示門靜脈分支明顯減少，主干增粗； C.灌注后6周肝內(nèi)門靜脈大量不規(guī)則側(cè)支循環(huán)形成 圖2 實(shí)驗(yàn)2組CT圖像 A.灌注前CT圖像； B.灌注后6周CT示肝臟體積明顯增大

表3 灌注乙醇6 h內(nèi)實(shí)驗(yàn)豬肝活檢組織病理變化(只，n=5)

表4 實(shí)驗(yàn)1、2組門靜脈灌注后肝臟METAVIR評(píng)分(只，n=5)

3 討論

建立肝硬化動(dòng)物模型的方法較多，主要有口服、吸入、皮下注射、腹腔內(nèi)注射制模藥物或外科手術(shù)等[9-11]，制模藥物經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟或外科手術(shù)明顯改變解剖關(guān)系，引起肝損害的同時(shí)，也會(huì)對(duì)其他組織器官產(chǎn)生損傷，甚至導(dǎo)致死亡。小型動(dòng)物建模不宜同時(shí)做多項(xiàng)血液指標(biāo)測(cè)定及影像學(xué)檢查，難以測(cè)定門靜脈變化，更不利于外科手術(shù)及活檢等操作，無法連續(xù)觀察模型肝病理變化[12-13]。盡管有學(xué)者[4-5]對(duì)犬、狒狒等大型動(dòng)物建立特定的肝硬化或門靜脈高壓模型，但其與人類常見的肝炎性或酒精性肝硬化門靜脈高壓病理過程相差甚遠(yuǎn)。另外，

圖3 實(shí)驗(yàn)2組病理圖 A.灌注后3周假小葉形成，血竇擴(kuò)張，未見血栓及明顯變性壞死(HE，×100)； B.灌注后4周假小葉形成，周圍散在炎性細(xì)胞，肝細(xì)胞未見明顯變性壞死(HE，×200)； C.灌注后6周肝細(xì)胞內(nèi)纖維組織增生，假小葉形成，周圍炎細(xì)胞浸潤，并可見大片壞死(HE，×100)

圖4 實(shí)驗(yàn)2組大體標(biāo)本 A、B.灌注后6周肝臟膈面及腹面，示肝臟組織較硬、彈性差、各葉均勻增大； C.局部放大圖像顯示肝臟表面均勻的再生小結(jié)節(jié)； D.灌注后6周脾臟質(zhì)硬、顏色不均勻，呈淤血狀態(tài)

有研究[9,14]報(bào)道形成肝硬化的時(shí)間一般長達(dá)8周以上。本研究于實(shí)驗(yàn)豬門靜脈內(nèi)緩慢灌注80%乙醇，其隨血流均勻進(jìn)入肝臟微循環(huán)系統(tǒng)，作為永久性末梢栓塞劑，于微循環(huán)水平進(jìn)行栓塞，致使門靜脈小分支、肝竇、肝靜脈小分支閉塞、血栓形成及內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步引起肝細(xì)胞變性、壞死、再生、纖維化、門靜脈增寬、壓力增高及肝內(nèi)門靜脈側(cè)支形成等典型的早期肝硬化病理變化，與人類肝炎性及酒精性肝硬化早期病理過程特點(diǎn)相似。另外，本方法用時(shí)短，實(shí)驗(yàn)2組灌注80%乙醇10 ml，3周后即均成功建立肝硬化門靜脈高壓模型，成模時(shí)間適中，且無死亡動(dòng)物。

肝動(dòng)脈或門靜脈栓塞建立肝硬化模型仍處于探索階段，Pavcinik等[6]采用經(jīng)皮肝穿技術(shù)向?qū)嶒?yàn)豬門靜脈內(nèi)注射聚乙烯醇顆粒以栓塞門靜脈分支構(gòu)建門靜脈高壓，但實(shí)驗(yàn)后1周門靜脈壓力回降至正常水平，亦未形成肝硬化；Madoff等[7]于門靜脈注入聚乙烯醇顆粒及線圈栓塞肝左葉及左中葉，栓塞后28天組織病理學(xué)顯示栓塞節(jié)段門靜脈區(qū)及小葉間隔萎縮，而纖維化不明顯。有研究[8]表明豬肝動(dòng)脈內(nèi)注射碘化油和乙醇比例為3∶1的栓塞劑，術(shù)后6～8周肝組織病理可見纖維間隔和假小葉形成，但形成的肝硬化比較局限，分布不均勻，各部位纖維化分級(jí)亦不一致。本研究實(shí)驗(yàn)2組的實(shí)驗(yàn)豬于灌注后6周均形成肝硬化，3只伴門靜脈高壓，肝纖維化均達(dá)到4級(jí)；肝臟各葉表面均觀察到較均勻的硬化結(jié)節(jié)，且門靜脈主干及大分支未見血栓形成。表明于門靜脈灌注80%乙醇對(duì)肝臟的損傷作用均勻、有效。

總之，門靜脈內(nèi)灌注80%乙醇可建立豬肝硬化或門靜脈高壓模型，并有典型的早期人類肝炎性或酒精性肝硬化病理發(fā)展過程，對(duì)其他臟器和組織損傷輕微或無損傷，為肝硬化門靜脈高壓的基礎(chǔ)研究提供了一種安全可靠的造模方法。本實(shí)驗(yàn)中門靜脈內(nèi)灌注80%乙醇10 ml較適宜，更合適的乙醇濃度及用量仍需進(jìn)一步深入研究。

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Establishes model of liver cirrhosis with portal hypertension by portal infusion of 80% alcohol in swines

LIHongbin,WANGLei,DONGChengbin,QIUBin,TANGXiaolong,WUYifan,FANZhenhua,LIUFuquan*

(DepartmentofInterventionalTherapy,BeijingShijitanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100038,China)

Objective To explore the feasibility of establishing a swine model of liver cirrhosis with portal hypertension by portal infusion of 80% alcohol. Methods A total of 13 Guizhou miniature pigs were randomly divided into three groups, experiment group 1 (n=5), experiment group 2 (n=5) and control group (n=3). Experiment groups of pigs received portal infusion of 80% alcohol in volumes of 5 ml in group 1, and 10 ml in group 2, and the pigs in control group received portal perfusion of saline in volumes of 10 ml. All animals were performed direct portal angiography, the portal vein pressures and diameter were also detected before, immediately and 6 weeks after the infusion. All animals underwent liver biopsies before and 6 hours, 1—6 weeks after operation. And contrast-enhanced abdominal CT was performed before and 6 weeks after operation. All animals were dissected 6 weeks after operation, and each leaf of liver specimens were performed histological examination. Results There was no statistically significant difference of the portal venous pressure and diameter before infusion and 6 weeks after infusion in the experiment group 1 and control group (allP>0.05). In the experiment group 2, compared with pre infusion, the portal vein pressure and diameter were higher than those of immediately and 6 weeks after infusion (allP<0.05). In both experiment group 1 and group 2, all pigs had developed into liver fibrosis, the METAVIR score of 2 pigs in group 1 and 5 pigs in group 2 respectively were up to grade 4. Conclusion Portal infusion of 80% alcohol is more suitable for establishing a swine model of liver cirrhosis with portal hypertension.

Alcohol; Portal infusion; Cirrhosis; Hypertension, portal; Animal model

李紅彬(1989—)，男，河南安陽人，在讀碩士，醫(yī)師。研究方向：腫瘤介入治療。E-mail： lihongbin2012@foxmail.com

劉福全，首都醫(yī)科大學(xué)北京世紀(jì)壇醫(yī)院介入治療科，100038。E-mail： lfuquan@yahoo.com.cn

2016-09-08

2017-01-18

R445; R-332

A

1672-8475(2017)04-0247-05

10.13929/j.1672-8475.201609015