朱 瓊，高順記，郭夢(mèng)嬌，高 原，劉 政*，謝 峰

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科，重慶 400037；2.內(nèi)布拉斯加大學(xué)醫(yī)學(xué)中心心內(nèi)科，內(nèi)布拉斯加 奧馬哈 68198)

·基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究·

血栓內(nèi)微泡聯(lián)合尿激酶介導(dǎo)的超聲溶栓體外實(shí)驗(yàn)

朱 瓊1，高順記1，郭夢(mèng)嬌1，高 原1，劉 政1*，謝 峰2

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科，重慶 400037；2.內(nèi)布拉斯加大學(xué)醫(yī)學(xué)中心心內(nèi)科，內(nèi)布拉斯加 奧馬哈 68198)

目的 探討血栓內(nèi)微泡聯(lián)合尿激酶介導(dǎo)的超聲溶栓對(duì)體外血栓的溶解效果。方法 取牛全血制作血栓樣本50個(gè)，隨機(jī)平均分為5組后于帶有側(cè)支循環(huán)的體外循環(huán)裝置中進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)1組為超聲微泡尿激酶組，實(shí)驗(yàn)2組為超聲微泡組，實(shí)驗(yàn)3組為超聲尿激酶組，實(shí)驗(yàn)4組為單純尿激酶組，實(shí)驗(yàn)5組為無處理組。計(jì)算并比較各組的溶栓率。并進(jìn)行HE染色及免疫熒光組織學(xué)觀察。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)1組溶栓率為(73.64±14.16)%，實(shí)驗(yàn)2組為(47.97±11.66)%，實(shí)驗(yàn)3組為(57.33±8.65)%，實(shí)驗(yàn)4組為(50.85±9.63)%，實(shí)驗(yàn)5組為(29.76±18.06)%。其中實(shí)驗(yàn)1組溶栓率高于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；該組HE染色組織學(xué)檢查可見明顯多灶狀血栓溶解，邊緣可見血栓崩裂，免疫熒光可見纖維蛋白網(wǎng)斷裂。結(jié)論 血栓內(nèi)微泡聯(lián)合尿激酶介導(dǎo)的超聲溶栓在體外實(shí)驗(yàn)中可提高血栓的溶解率。

血栓形成；微泡；超聲學(xué)；溶栓

圖1 體外溶栓實(shí)驗(yàn)循環(huán)裝置示意圖

經(jīng)靜脈溶栓是血栓的經(jīng)典治療方法，但溶栓時(shí)間窗短[1]，且溶栓效率不理想[2-4]。微泡介導(dǎo)的超聲溶栓技術(shù)是一種溶栓新方法[4-6]，其主要機(jī)制是微泡降低空化閾值，增加超聲空化強(qiáng)度，從而增強(qiáng)超聲溶栓效果[5，7-8]。但由于臨床多數(shù)為梗阻性血栓，經(jīng)靜脈注射微泡無法進(jìn)入血栓內(nèi)部，僅接觸梗阻性血栓兩端，造成血栓內(nèi)部的溶栓效應(yīng)不足，不利于超聲溶栓。本課題組前期設(shè)計(jì)了血栓內(nèi)微泡介導(dǎo)的超聲溶栓(intraclot microbubble mediated ultrasound thrombolysis， IMUT)方法，即經(jīng)導(dǎo)管向血栓內(nèi)注射尿激酶和微泡，使微泡和尿激酶同時(shí)聚集在血栓內(nèi)部，從而提高體外超聲溶栓的效果[9]。但I(xiàn)MUT法存在不足：①循環(huán)裝置無側(cè)支循環(huán)，不能將血栓模型做成梗阻性；②循環(huán)液為單純磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline， PBS)，缺乏纖溶酶原，尿激酶無法充分發(fā)揮溶栓作用。本研究采用更符合生理狀態(tài)的梗阻性血栓模型聯(lián)合帶有側(cè)支循環(huán)的實(shí)驗(yàn)裝置，并在循環(huán)液中加入血漿以補(bǔ)充纖溶酶原，進(jìn)行IMUT溶栓實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)溶栓效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1血栓制備 取抗凝牛全血(鄭州九龍生物制品有限公司)50份，每份1 ml，至預(yù)先加入5%氯化鈣溶液(33 μl)的平底EP管(內(nèi)徑0.9 cm)中，于37℃恒溫水浴鍋中溫育3 h后取出，以PBS沖洗3次，濾紙吸干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2體外循環(huán)裝置組裝 體外循環(huán)裝置由KY-100E/TH15微量蠕動(dòng)泵(重慶杰恒蠕動(dòng)泵有限公司)和自制模擬體循環(huán)的管道組成，循環(huán)液為含10%牛冰凍血漿(鄭州九龍生物制品有限公司)的PBS液，流速為5 ml/min。血栓放置處兩端有管道以模擬側(cè)支循環(huán)，血栓底部放置厚度為2 cm的吸聲海綿。整個(gè)循環(huán)裝置置于37℃恒溫水浴鍋中，見圖1。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 采用Excel隨機(jī)數(shù)字法將前期制備的50個(gè)血栓樣本隨機(jī)分為5組，每組10個(gè)樣本：實(shí)驗(yàn)1組(超聲微泡尿激酶組)、實(shí)驗(yàn)2組(超聲微泡組)、實(shí)驗(yàn)3組(超聲尿激酶組)、實(shí)驗(yàn)4組(單純尿激酶組)、實(shí)驗(yàn)5組(無處理組)。

對(duì)實(shí)驗(yàn)1組采用帶側(cè)孔的乙醇注射針(日本八光醫(yī)療)向血栓內(nèi)注入稀釋后的自制微泡(全氟丙烷脂質(zhì)微泡“脂氟顯”)0.02 ml(相當(dāng)于0.9×107～1.7×107MB)和尿激酶0.1 ml(2萬U)[10]，對(duì)實(shí)驗(yàn)2組以同樣方法注射0.02 ml微泡，對(duì)實(shí)驗(yàn)3組和實(shí)驗(yàn)4組注射0.1 ml尿激酶，對(duì)實(shí)驗(yàn)5組不做處理。以濾紙吸干血栓表面后以YP3102型電子天平(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)稱量血栓的初始質(zhì)量(W0)，而后植入循環(huán)管道內(nèi)備用。根據(jù)分組情況，對(duì)實(shí)驗(yàn)1～3組采用SL-10型超聲空化治療儀(深圳市威爾德醫(yī)療電子有限公司)，在距離血栓正上方5 cm處給予超聲輻照，超聲頻率2 MHz，聲壓708 kPa，工作占空比5%，輻照時(shí)間10 min。對(duì)實(shí)驗(yàn)4組和實(shí)驗(yàn)5組不予超聲輻照。

處理10 min后，取出血栓，以PBS沖洗3次后用濾紙吸干表面液體，再次應(yīng)用電子天平稱量溶栓后血栓質(zhì)量(W1)。而后根據(jù)公式計(jì)算血栓溶栓率，溶栓率=(W0-W1)/W0×100%。

將血栓置于4%多聚甲醛中固定，制做石蠟切片，并進(jìn)行HE染色和免疫熒光觀察。于Leica TCS SP5熒光顯微鏡下觀察處理后各組血栓中細(xì)胞及纖維分布情況。于Olympus BX63激光共聚焦顯微鏡下觀察牛纖維蛋白原抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)標(biāo)記的纖維蛋白骨架結(jié)構(gòu)。

表1 各組溶栓前后血栓質(zhì)量和溶栓率

2 結(jié)果

2.1溶栓率 處理前各組血栓質(zhì)量W0差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.16，P=0.39)。實(shí)驗(yàn)1組溶栓率為(73.64±14.16)%，實(shí)驗(yàn)2組為(47.97±11.66)%，實(shí)驗(yàn)3組為(57.33±8.65)%，實(shí)驗(yàn)4組為(50.85±9.63)%，實(shí)驗(yàn)5組為(29.76±18.06)%。各組溶栓率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.23，P<0.01)，且實(shí)驗(yàn)1組與其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2組與實(shí)驗(yàn)3組間、實(shí)驗(yàn)5組與其余各組間溶栓率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2組與實(shí)驗(yàn)4組間、實(shí)驗(yàn)3組與實(shí)驗(yàn)4組間溶栓率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.2組織學(xué)表現(xiàn)

2.2.1HE染色 實(shí)驗(yàn)1組較其余各組血栓內(nèi)紅細(xì)胞分布更稀疏，血栓內(nèi)可見較多島狀溶解灶，其內(nèi)未見紅細(xì)胞，且血栓邊緣可見多處血栓裂解。實(shí)驗(yàn)3組可見

少量的溶解灶，其余各組血栓仍較致密，未見明顯血栓溶解區(qū)。見圖2。

2.2.2免疫熒光 實(shí)驗(yàn)1組中網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，大量纖維蛋白網(wǎng)斷裂，僅見少量綠色熒光標(biāo)記的纖維蛋白，綠色熒光強(qiáng)度弱，表明大量纖維蛋白溶解。其余各組纖維蛋白結(jié)構(gòu)仍較致密，無明顯斷裂溶解區(qū)域。見圖3。

3 討論

經(jīng)血管介入的導(dǎo)管溶栓方法是臨床常用的介入溶栓方法，廣泛應(yīng)用于下肢深靜脈血栓[11]、冠狀動(dòng)脈血栓[12]和腦血栓的治療[8]。該方法將溶栓藥直接注射入血栓的同時(shí)，也為超聲微泡注入血栓內(nèi)部提供通道，從而解決超聲溶栓治療中微泡無法進(jìn)入梗阻性血栓內(nèi)部的局限性。本課題組在前期研究中采用單通道閉合循環(huán)裝置，如采用梗阻血栓模型則可能因循環(huán)壓力不斷增高而導(dǎo)致爆管或沖走血栓[9-10]，因而只能選擇非梗阻性血栓以防止循環(huán)液壓力過高；此外，前期研究中循環(huán)液為單純PBS，使尿激酶激活纖溶酶原形成纖溶酶的反應(yīng)中的底物纖溶酶原較少，可能未充分發(fā)揮尿激酶在溶栓過程中的作用[13]。

圖2 血栓體外實(shí)驗(yàn)HE染色組織學(xué)表現(xiàn) A、B.實(shí)驗(yàn)1組，200倍(A)及400倍(B)鏡下血栓內(nèi)見大量腔隙樣血栓溶解，邊緣血栓崩解(箭)； C.實(shí)驗(yàn)2組，200倍鏡下血栓內(nèi)未見明顯溶解； D.實(shí)驗(yàn)3組，200倍鏡下可見少量灶狀溶解； E.實(shí)驗(yàn)4組，200倍鏡下未見明顯溶解灶； F.實(shí)驗(yàn)5組，200倍鏡下未見明顯溶解灶，血栓結(jié)構(gòu)較其余各組均更致密 (右下方圖像為400倍鏡下圖像)

圖3 血栓體外實(shí)驗(yàn)免疫熒光組織學(xué)表現(xiàn) A、B.實(shí)驗(yàn)1組，800萬倍(A)及1 600萬倍(B)鏡下纖維蛋白網(wǎng)結(jié)構(gòu)最疏松，可見大量島狀無纖維蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域，熒光強(qiáng)度較弱； C.實(shí)驗(yàn)2組，800萬倍鏡下未見明顯纖維蛋白網(wǎng)斷裂，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)； D.實(shí)驗(yàn)3組，800萬倍鏡下可見部分纖維蛋白網(wǎng)斷裂，熒光強(qiáng)度較弱； E.實(shí)驗(yàn)4組，800萬倍鏡下未見明顯纖維蛋白網(wǎng)斷裂，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)； F.實(shí)驗(yàn)5組，800萬倍鏡下未見明顯纖維蛋白網(wǎng)斷裂，熒光強(qiáng)度較強(qiáng) (綠色代表熒光標(biāo)記的纖維蛋白；藍(lán)色代表紅細(xì)胞)

本實(shí)驗(yàn)的循環(huán)裝置新增加了側(cè)支循環(huán)，模擬在體血栓發(fā)生后開放的側(cè)支循環(huán)，降低了血流對(duì)血栓的沖擊，可更好地模擬臨床梗阻性血栓，也更符合在體溶栓時(shí)的生理情況；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)將循環(huán)液更換為含有10%血漿的PBS液，提高了循環(huán)液中的纖溶酶原含量，進(jìn)而在尿激酶催化作用下，可有更多的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，從而有望加速纖維蛋白的降解，加快血栓溶解。本研究采用前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的超聲輻照參數(shù)，即聲壓708 kPa，占空比大于2%[10]。該參數(shù)下的能量低，輸出功率為0.75 W/cm2，接近診斷超聲能量水平。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1組的溶栓率高達(dá) (73.64±14.16)%，明顯高于其余各組(P均<0.05)；且HE染色和免疫熒光組織學(xué)檢查結(jié)果也與溶栓率結(jié)果相符，實(shí)驗(yàn)1組HE染色可見大量不規(guī)則島狀血栓溶解灶，血栓邊緣崩解明顯，免疫熒光見少量綠色熒光蛋白，表明尿激酶在超聲和微泡的作用下使大量纖維蛋白結(jié)構(gòu)降解。本研究結(jié)果提示超聲輻照聯(lián)合微泡對(duì)尿激酶溶栓具有增強(qiáng)作用，超聲輻照、微泡、尿激酶3個(gè)治療因素的聯(lián)合，較任意2個(gè)因素或單因素產(chǎn)生的溶栓作用更大。

盡管本課題組前期研究[10]采用聲壓708 kPa和占空比10%的超聲參數(shù)實(shí)施超聲聯(lián)合微泡和尿激酶溶栓，其占空比(即超聲能量發(fā)射密度)較本實(shí)驗(yàn)高一倍(本實(shí)驗(yàn)占空比為5%)，其溶栓率僅為46.19%，而本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)1組的溶栓率卻高達(dá)(73.64±14.16)%。本實(shí)驗(yàn)中不利于溶栓率提高的因素有兩個(gè)方面：①循環(huán)裝置增設(shè)了側(cè)支循環(huán)，血流對(duì)血栓的直接沖擊力較無側(cè)支循環(huán)時(shí)減??；②選用血栓為梗阻性血栓，與前期研究中所用的不完全梗阻性血栓[10]相比，其與循環(huán)液的接觸面積更小。而最終本研究可獲得較高的溶栓率，這主要得益于在循環(huán)液中加入血漿，增加了纖溶酶原，使尿激酶的作用發(fā)揮更充分。但由于本實(shí)驗(yàn)采用抗凝牛血制備血栓，而本課題組的前期研究[10]采用健康志愿者血液制備血栓，溶栓率不同是否是由于動(dòng)物源性血栓和人源性血栓成分和結(jié)構(gòu)不同所致，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了循環(huán)裝置和循環(huán)液成分，結(jié)果表明血栓內(nèi)微泡聯(lián)合尿激酶介導(dǎo)的超聲溶栓可有效提高溶栓率，獲得較好的溶栓效果。本研究為IMUT技術(shù)的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)?；诒緦?shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者設(shè)想，借助臨床常用的導(dǎo)管，將微泡注入血栓內(nèi)部，同時(shí)體外給予超聲輻照，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的IMUT，是否有望提高溶栓效率，從而實(shí)現(xiàn)血管的快速再通，今后本課題組將進(jìn)一步在在體實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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Intraclot microbubble combined with urokinase mediated ultrasound thrombolysis: Experiment in vitro

ZHUQiong1,GAOShunji1,GUOMengjiao1,GAOYuan1,LIUZheng1*,XIEFeng2

(1.DepartmentofUltrasound,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China； 2.CardiologySectionofInternalMedicine,MedicalCenterofNebraskaUniversity,Omaha68198,USA)

Objective To investigate the efficiency of intraclot microbubbles (MB) combined with urokinase (UK) mediated ultrasound (US) thrombolysis. Methods Fifty clots prepared by bovine whole blood were equally divided into 5 groups and were treated in a circulation system with collateral circulation tube. The clots were treated by US, MB and UK in group 1， by US and MB in group 2， by US and UK in group 3 and by UK in group 4. The group 5 was the control group without any treatment. The thrombolysis rate of each group was measured and compared. Residual clots were histologically observed with hematoxylin-eosin staining and immunofluorescence. Results The thrombolysis rate of group 1 ([73.64±14.16]%) was significantly higher than group 2 ([47.97±11.66]%), group 3 ([57.33±8.65]%), group 4 ([50.85±9.63]%), and group 5 ([29.76±18.06]%, allP<0.05). Histological examination of the clots in group 1 showed multiple thrombolysis foci with clots collapse, and the degradation of fibrin network was further confirmed by immunofluorescence. Conclusion The intraclot MB mediated US thrombolysis combined with UK can enhance the rate of thrombolysis in vitro experiment.

Thrombosis; Microbubbles; Ultrasonics; Thrombolysis

國(guó)家自然科學(xué)基金科學(xué)儀器專項(xiàng)(82227004)。

朱瓊(1990—)，女，重慶人，在讀碩士。研究方向：超聲空化溶栓治療。E-mail: zhuzhu9056@sina.com

劉政，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院超聲科，400037。E-mail: liuzhengs@163.com

2016-11-30

2017-03-01

R445.1; R-332

A

1672-8475(2017)04-0242-05

10.13929/j.1672-8475.201611037