袁美杰 邵晨曦 杜玉青 張亞男 高紹芳

(河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合學院2013級中西醫(yī)臨床醫(yī)學2班，河北 石家莊 050200)

實 驗 研 究

基于蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路觀察化濁解毒方對胃癌前病變大鼠腫瘤血管新生機制的影響※

袁美杰 邵晨曦 杜玉青 張亞男 高紹芳△

(河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合學院2013級中西醫(yī)臨床醫(yī)學2班，河北 石家莊 050200)

目的 基于胃黏膜組織蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)通路觀察化濁解毒方對胃癌前病變(PLGC)大鼠腫瘤血管新生機制的影響。方法 將48只雄性SD大鼠按隨機分組法分為正常組、模型組、維甲酸組、化濁解毒組，每組12只。采用胃癌前病變模型的建立法復制PLGC模型成功后，模型組、正常組給予0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg，維甲酸組予維甲酸藥液40 mg/kg、化濁解毒組予化濁解毒方水煎液10 g/kg，均每日1次灌服，連續(xù)16周。采用免疫組織化學法，檢測化濁解毒方對PLGC大鼠胃黏膜組織AKT、mTOR的影響。結(jié)果 給藥16周后，模型組AKT、mTOR表達高于正常組，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，化濁解毒組、維甲酸組AKT、mTOR的表達均有不同程度下降，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；化濁解毒組與維甲酸組比較，AKT、mTOR表達明顯降低，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 化濁解毒方可能是通過降低AKT、mTOR的表達，從而調(diào)控AKT/mTOR通路，達到抗腫瘤血管新生以逆轉(zhuǎn)PLGC的治療效果。

癌前狀態(tài)；胃腫瘤；新生血管化；病理性；蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶；解毒；中醫(yī)藥療法

胃癌前病變(precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)是指萎縮性胃炎并伴有腸上皮化生和(或)不典型增生[1]。在慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→胃癌的轉(zhuǎn)化過程中，由正常胃黏膜向胃癌進展的一個重要環(huán)節(jié)就是PLGC。所以，逆轉(zhuǎn)和阻斷PLGC的進展，對減少胃癌的發(fā)生有重要意義。目前，西醫(yī)仍然沒有公認的、療效確切的針對PLGC的治療方法，而近年來中醫(yī)藥對PLGC的防治取得了顯著成效。李佃貴教授“化濁解毒法”能刺激胃黏膜分泌功能[2]，改善胃液成分[3]，治療PLGC取得了滿意的臨床療效。

新生血管形成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)[4]，蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)在腫瘤中過度表達，與腫瘤血管新生密切相關(guān)。AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路的活化可通過多條途徑上調(diào)低氧誘導因子1α (HIF-1α)的表達，啟動血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)基因的轉(zhuǎn)錄，促進VEGF表達，遷移內(nèi)皮細胞后，形成新生血管，從而增加腫瘤細胞的血供[5]，引發(fā)腫瘤。以往研究顯示，化濁解毒方可通過抑制癌基因的激活和抑制基因的失活，降低HIF-1α和VEGF的表達而抑制新生血管生成[6]。為進一步探討化濁解毒方對PLGC腫瘤血管新生的作用機制，本研究采用免疫組織化學法，觀察化濁解毒方對PLGC大鼠AKT、mTOR的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 48只雄性SD健康大鼠，體質(zhì)量(130±10)g，購自河北醫(yī)科大學動物實驗中心，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003，合格證號：1508014。以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 實驗藥物 化濁解毒方藥物組成：藿香15 g，白花蛇舌草15 g，黃連15 g，半枝蓮15 g，半邊蓮15 g，佩蘭15 g，茵陳15 g，苦參15 g，全蝎9 g，瓜蔞15 g，清半夏10 g。以上藥材均購自河北省中醫(yī)院中藥房，由河北中醫(yī)學院制劑室制成含量2.35 g生藥/mL的藥液，質(zhì)量控制通過制劑室嚴格把關(guān)；維A酸片(山東良福制藥有限公司，國藥準字H20083494，批號：150302，規(guī)格：10 mg/片)。

1.1.3 實驗試劑 AKT抗體，Santa Cruz(圣克魯斯)，sc-8312；mTOR抗體，Santa Cruz，sc-8319；免疫組化試劑盒，VECTOR LABORATORIES，INC(矢量實驗室公司，PK-4001)；3，3'-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(ZLI-9108)。

1.1.4 實驗儀器 MG5513S微波爐(LG集團)；YHW-1101S電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；WD-9405A脫色搖床(北京市六一儀器廠)；DP73數(shù)碼顯微鏡，Olympus(奧林巴斯)；HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)(武漢同濟醫(yī)科大學)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 48只雄性SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后，按隨機分組法分為模型組、正常組、維甲酸組、化濁解毒組，每組各12只。

1.2.2 造模方法 除正常組以外，其他3組均參照李春英等[7]方法建立PLGC大鼠模型，將馬兜鈴酸Ⅰ(AAⅠ)以5 mg/kg劑量隔日8：00灌胃，同時進食2 d、禁食1 d，并于每日夾鼠尾1 h，對其進行情志刺激，持續(xù)10周后，每組隨機抽取2只大鼠，確認實驗動物成功造模后進行給藥。

1.2.3 給藥方法 模型組及正常組大鼠給予0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg灌服，每日1次，連續(xù)16周；維甲酸組予維甲酸藥液40 mg/kg、化濁解毒組予化濁解毒方水煎液10 g/kg灌服(相當于成人每日用量，每次2 mL)，每日1次，連續(xù)16周。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 大鼠一般情況 密切監(jiān)測實驗期間各組大鼠的攝食量、體質(zhì)量、活動情況、情緒狀態(tài)、毛發(fā)的光澤和蓬松程度及大便等一般情況。

1.3.2 胃黏膜組織病理學觀察 給藥16周后處死各組大鼠，剖腹取胃，沿胃大彎剪開，肉眼觀察；使用200 ℃干烤的器械于手術(shù)臺上于胃竇部切取1.5 cm×1.0 cm胃黏膜組織，10%甲醛固定48 h，脫水、包埋、切片，常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡(100倍)下觀察胃黏膜組織病理變化。

1.3.3 免疫組織化學法檢測AKT、mTOR 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用檸檬酸緩沖液熱抗原修復20 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3 min×3次；80%甲醇3%雙氧水浸泡20 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗3 min×3次；5%牛血清白蛋白封閉20 min；棄封閉液，不用洗，加各自稀釋一抗(AKT 1∶100，mTOR 1∶75)，4 ℃過夜，PBS洗3 min×3次；加對應(yīng)的生物素標記二抗(1∶200稀釋)，37 ℃ 30 min，PBS洗3 min×3次；加親和素―生物素―過氧化物酶復合物(ABC)反應(yīng)試劑，37 ℃ 30 min，PBS洗3 min×3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，封片。每個指標每組內(nèi)每張切片隨機挑選至少3個200倍視野進行拍照。應(yīng)用HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)，選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的平均光度值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 實驗過程中，正常組大鼠始終形體較肥胖，食量較多，活動靈敏，被毛光澤，大便正常；模型組大鼠形體消瘦，活動減少，被毛無光澤，食量下降，大便稀溏；維甲酸組大鼠食欲較模型組好，體質(zhì)量稍增加，但毛發(fā)缺少光澤，大便偏??；化濁解毒組大鼠活動增加，食量增大，體質(zhì)量上升快，大便正常，較模型組、維甲酸組一般情況大大好轉(zhuǎn)。

2.2 4組大鼠胃黏膜組織病理觀察結(jié)果 正常組大鼠胃黏膜厚度正常，上皮細胞排列整齊，腺體大小形態(tài)規(guī)則，胞漿透明，黏膜肌層未見增生。模型組大鼠胃黏膜腺體大小不等，黏膜變薄，間質(zhì)內(nèi)有炎性細胞浸潤，淋巴濾泡形成，可見杯狀細胞以及上皮不同程度的異型增生。維甲酸組大鼠胃黏膜上皮排列不規(guī)整，黏膜層仍有較多炎性細胞浸潤，固有腺體保持完整，腸上皮化生和異型增生發(fā)生較模型組輕?；瘽峤舛窘M大鼠胃黏膜上皮排列整齊，腺體大小、形態(tài)一致，無明顯變性、壞死，仍有少量炎性細胞浸潤，表現(xiàn)為輕度淺表性胃炎或接近正常胃黏膜。見圖1。

A為正常組，B為模型組，C為維甲酸組，D為化濁解毒組圖1 4組大鼠胃黏膜組織病理觀察結(jié)果(HE，×100)

2.3 4組大鼠胃黏膜AKT、mTOR平均光度值比較 見表1。

表1 4組大鼠胃黏膜AKT、mTOR 平均光度值比較 ±s

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05，與維甲酸組比較，#P<0.05

由表1可見，模型組AKT、mTOR平均光度值均較正常組增高，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，化濁解毒組、維甲酸組AKT、mTOR的平均光度值均有不同程度降低，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與維甲酸組比較，化濁解毒組AKT、mTOR的平均光度值均明顯降低，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

PLGC是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要階段。腫瘤血管新生是腫瘤生成的重要因素，直接調(diào)控著腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等病理過程。豐富的血管生成可持續(xù)不斷地向腫瘤提供營養(yǎng)和清除代謝產(chǎn)物，為其生長及浸潤、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[3]。腫瘤血管生成的主要機制主要涉及內(nèi)皮細胞移行通道形成及內(nèi)皮細胞的遷移增殖。AKT、mTOR表達增高在喉癌[8]、乳腺癌[9]等多種腫瘤中均有報道。AKT/mTOR是腫瘤血管新生的經(jīng)典信號通路，AKT、mTOR因子在整個信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中扮演著極其重要的角色[10]。該信號通路通過多種途徑被激活后，可通過上調(diào)HIF-1α的表達，啟動VEGF基因的轉(zhuǎn)錄，促進VEGF表達，使內(nèi)皮細胞活化后，形成新生血管，活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)，促進新生血管形成；可激活核轉(zhuǎn)錄因子B(NF-B)，導致血管生成因子的表達增加；活化的AKT引起IκB磷酸化，使NF-B水平提高以上調(diào)VEGF，使內(nèi)皮細胞遷移形成新生血管[11]。王霞[12]研究表明，在PLGC的進展過程中AKT、mTOR的陽性表達率呈遞增現(xiàn)象，認為隨著胃癌的惡變AKT、mTOR的表達也增強，進而認為AKT/mTOR信號通路可能與胃癌的惡化有相關(guān)性。

中醫(yī)學將PLGC歸于胃痞、胃痛、痞滿、嘈雜等范疇。臨床主要表現(xiàn)為上腹脹滿不適、隱痛、噯氣、反酸、食欲不振等癥狀，舌黯紅或紫黯，苔薄黃膩或黃厚膩，脈弦滑或弦滑細。關(guān)于其病因病機，鄧鐵濤教授認為PLGC實為本虛標實的虛損病[13]。黃玨[14]探討了幽門螺旋桿菌感染與PLGC的關(guān)系。而李佃貴教授依據(jù)濁毒理論認為，素體虧虛，脾胃虛弱，后天之本生化不足，胃失所養(yǎng)，濁毒之邪瘀滯中焦為其病機關(guān)鍵。憂思郁怒，肝失疏泄，氣機郁滯，木旺克土，脾氣虛弱，濕邪黏滯，漸化成濁，濁氣郁內(nèi)，漸成為熱，熱邪壅盛，化為毒邪，濁毒之邪深伏胃脈血分，是導致PLGC的病理結(jié)果。病位在脾胃，涉及肝、膽、腎等多臟腑?；瘽峤舛痉揭曰瘽峤舛緸橹?，和胃健脾為輔，疏肝健脾，活血止痛，使肝氣條達，脾胃健運而使?jié)嵝暗没?，毒邪祛除，胃絡(luò)暢通，瘀化血活，療效明顯。方中藿香、佩蘭、茵陳芳香化濕，理氣和胃；瓜蔞、清半夏燥濕化痰，降逆止嘔；黃連、苦參苦燥瀉降，清熱解毒；白花蛇舌草、半枝蓮、半邊蓮清熱利濕，消痞散結(jié)；全蝎祛風止痙，解毒通絡(luò)。諸藥配伍，相輔相成，正本清源，標本同治，恢復脾氣運化升清、胃氣和降之功，使?jié)駶嶂畾馀懦鲶w外。現(xiàn)代藥理研究表明，黃連可殺滅幽門螺桿菌，具有抗癌、抗?jié)兊茸饔茫瑫r黃連中的黃連堿有很強的胃黏膜保護作用[15]；全蝎粗提物既對癌細胞有直接殺傷作用，又能增強胸腺功能，既使停止使用在一定時間內(nèi)仍可減緩腫瘤的生長速度[16]；白花蛇舌草總黃酮對BGC-823胃癌細胞的生長增殖有明顯抑制作用[17]。

本研究結(jié)果顯示，與正常組相比較，模型組AKT、mTOR的表達顯著增強，推測AKT、mTOR在PLGC中呈高表達。與模型組和維甲酸組比較，化濁解毒組AKT、mTOR的表達顯著下降，胃黏膜病理表現(xiàn)為輕度淺表性胃炎或接近正常胃黏膜。推測化濁解毒方能降低胃黏膜病變組織AKT、mTOR的表達，抑制AKT/mTOR通路的激活，減少腫瘤血管新生，進而減緩甚至阻斷PLGC，減少進一步惡化的危險?；瘽峤舛痉椒乐蜳LGC腫瘤血管新生的機制有待于進行更加深入的研究。

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(本文編輯：曹志娟)

Influence of Eliminate turbid fluid and remove toxic formula on tumor neovascularization in PLGC rats based on AKT /mTOR pathway

YUANMeijie,SHAOChenxi,DUYuqing,etal.

TraditionalChineseMedicineIntegratedwithWesternMedicineClass2of2013,InstituteofTraditionalChineseandWesternMedicine,HebeiUniversityofChineseMedicine,Hebei,Shijiazhuang050200

Objective observe the influence of Eliminate turbid fluid and remove toxic formula on tumor neovascularization in precancerous lesions of gastric cancer (PLGC) rats based on AKT /mTOR pathway. Methods 48 male PLGC rats were randomly divided into normal group, model group, retinoic acid remedy group and Eliminate turbid fluid and remove toxic formula group, 12 rats in each group. PLGC model was duplicated by the method of establishment of precancerous lesions of gastric cancer rats. After modeling, the model and normal groups were given 0.9% sodium chloride injection 10 mL/kg, the retinoic acid remedy group received retinoic acid 40 mg/kg, and the Eliminate turbid fluid and remove toxic formula group received Eliminate turbid fluid and remove toxic formula decoction 10 g/kg, successive perfusion 1 time per day for 16 weeks. The protein kinase B (AKT) and mammalian target of rapamycin (mTOR) of PLGC rats' gastric mucosa was observed by immunohistochemical assay. Results After 16 weeks administration, the expressions of AKT and mTOR in model group were higher than those in normal group, with statistical differences (P<0.05).As compared with model group, the expressions of AKT and mTOR in Eliminate turbid fluid and remove toxic group and retinotic acid remedy group were decreased in varying degree,with statistical differences (P<0.05). The expressions of AKT and mTOR in Eliminate turbid fluid and remove toxic formula group were obviously lower than retinoic acid remedy group, with statistical differences (P<0.05). Conclusion Eliminate turbid fluid and remove toxic formula can reverse PLGC through down-regulate expression of AKT and mTOR, regulating the AKT/mTOR pathway and resisting tumor neovascularization.

Precancerous state; Stomach neoplasm; Neovascularization; Pathologic; Protein-serine-threonine kinases; Detoxify; Traditional Chinese medicine therapy

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.02.025

※ 項目來源：2015年河北省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(編號：201514432029)

袁美杰(1994—)，女，本科在讀。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床消化內(nèi)科。

R-332；R287；R730.21；R735.205.31；R977.3

A

1002-2619(2017)02-0260-05

2016-10-09)

△ 通訊作者：河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合兒科教研室，河北 石家莊 050200