王玉榮 陶 蓮 馬 濤 石長(zhǎng)青 許貴善 刁其玉*

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081)

不同酶及組合處理對(duì)青貯水稻秸稈微觀結(jié)構(gòu)的影響

王玉榮1，2陶 蓮2馬 濤2石長(zhǎng)青1許貴善1刁其玉1，2*

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081)

本試驗(yàn)以水稻秸稈為研究對(duì)象，采用高效降解纖維素酶進(jìn)行青貯發(fā)酵處理，分析其對(duì)水稻秸稈微觀結(jié)構(gòu)的影響，旨在實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物秸稈的高效降解，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。設(shè)青貯對(duì)照(S組)、復(fù)合酶制劑處理(C組)、果膠酶+漆酶處理(PL組)、復(fù)合酶制劑+果膠酶+漆酶處理(CPL組)和原料(M組)，各組采用袋裝真空青貯。室溫貯藏45 d后取樣，采用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法、苯酚硫酸法、4,4′二羧酸-2,2′-喹啉(BCA)法、近紅外光譜(FTIR)、X-射線衍射和伊紅美蘭法分析不同酶或酶組合處理的水稻秸稈青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)成分含量、發(fā)酵品質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：1)與S組相比，PL組、C組及CPL組的乳酸(LA)含量顯著增加(P<0.05)，pH、氨態(tài)氮/總氮及乙酸、纖維素含量均顯著降低(P<0.05)；CPL組、C組的粗蛋白質(zhì)含量顯著降低(P<0.05)。2)與S組相比，PL組青貯水稻秸稈的聚合度顯著降低(P<0.05)，降低幅度達(dá)30.26%，分子間氫鍵結(jié)合力減弱，結(jié)晶度與比表面積無(wú)顯著變化(P>0.05)；C組青貯水稻秸稈聚合度顯著降低(P<0.05)，降低幅度達(dá)27.11%，分子間氫鍵結(jié)合力減弱，結(jié)晶度與比表面積無(wú)顯著變化(P>0.05)；CPL組青貯水稻秸稈的聚合度顯著降低(P<0.05)，降低幅度達(dá)56.32%，分子間氫鍵結(jié)合力減弱，有降低結(jié)晶度和增加比表面積的趨勢(shì)(P>0.05)。綜上，CPL組降解纖維組分的效果最理想，能有效地破解細(xì)胞壁中木質(zhì)素-纖維素-半纖維素復(fù)合結(jié)構(gòu)，將纖維素降解為可利用的糖，提高水稻秸稈青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)含量，降低聚合度及結(jié)晶度，增大比表面積，從而提高秸稈的可消化性及利用率。

秸稈；木質(zhì)纖維素；微觀結(jié)構(gòu)；生物處理

農(nóng)作物秸稈是一種重要的飼料資源，但由于秸稈細(xì)胞壁中纖維素復(fù)雜的層次結(jié)構(gòu)、凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)以及包裹著纖維素的半纖維素和木質(zhì)素，使其作為飼料的利用率一般都較低[1-2]。木質(zhì)素與半纖維素以共價(jià)鍵形式結(jié)合，將纖維素分子包被在其中，形成一種自然屏障，使消化酶不易與纖維素分子接觸，導(dǎo)致其在動(dòng)物瘤胃中的分解受到限制[3]。大量的國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)秸稈的高效利用做了很多方面的研究，目前提高秸稈飼料化利用率的常用加工處理方法有物理處理、化學(xué)處理和生物處理。其中生物處理具有能耗低、污染小、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，依靠微生物和酶制劑的生物降解能力來(lái)破壞秸稈細(xì)胞壁作為草食家畜飼料，已引起廣泛重視[4-5]。纖維素具有的特定層次結(jié)構(gòu)特征，將其可分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)，并分別用聚合度、氫鍵、結(jié)晶度及比表面積進(jìn)行表征[1，6]。生物處理可通過(guò)改變纖維素組分的含量，改變不同層次纖維素的微觀結(jié)構(gòu)[7]。其纖維素空間結(jié)構(gòu)的破解程度可反映細(xì)胞壁破壁的有效性，故找到有效的酶組合破解農(nóng)作物秸稈細(xì)胞壁，改變秸稈的理化結(jié)構(gòu)，把秸稈中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等碳水化合物降解為可被動(dòng)物直接利用的單糖，將有效提高秸稈飼料化的利用率。因此，本試驗(yàn)以水稻秸稈為研究對(duì)象，選用復(fù)合酶制劑、果膠酶及漆酶不同組合后，進(jìn)行青貯發(fā)酵處理，并采用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法、苯酚硫酸法、4,4′二羧酸-2,2′-喹啉(BCA)法、近紅外光譜(fourier transform infared，F(xiàn)TIR)、X-射線衍射(X-ray diffraction sprctra,XRD)和伊紅美蘭法分析不同酶或酶組合處理的水稻秸稈青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)成分、發(fā)酵品質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)變化，旨在尋找能破解農(nóng)作物秸稈細(xì)胞壁空間結(jié)構(gòu)的酶制劑組合，以期為秸稈的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青貯原料為水稻秸稈，取自吉林省吉林市，品種為稻花香，于2015年9月收獲籽粒后收割。

復(fù)合酶制劑[纖維素酶(≥10 000 U/g)+木聚糖酶(≥120 000 U/g)+β-葡聚糖酶(≥40 000 U/g)]、果膠酶(≥10 000 U/g)、漆酶(≥10 000 U/g)，試驗(yàn)所用復(fù)合酶制劑及酶均購(gòu)自夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，粉末狀，常溫貯存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品編號(hào)見(jiàn)表1。水稻秸稈刈割后，截取7、8節(jié)點(diǎn)之間5 cm莖段，共取600株，用青貯切碎揉搓機(jī)切短至1～2 cm，將復(fù)合酶制劑、果膠酶、漆酶按表1的組合及添加劑量溶于蒸餾水，攪拌，均勻噴灑在粉碎的水稻秸稈及截取的莖段上，將水分調(diào)節(jié)至75%～80%。青貯對(duì)照組直接添加蒸餾水，不添加任何酶制劑，其余方法同上。取原料樣品后，另取樣品裝入聚乙烯袋(24 cm×40 cm)，每袋1 kg，莖段40株，用真空包裝機(jī)(DZ-280/2SD)抽真空并封口。原料樣品置于冰盒中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃貯藏，青貯發(fā)酵室溫條件下(25～37 ℃)進(jìn)行，發(fā)酵45 d后開(kāi)封取樣，立即于-20 ℃保存，待檢。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品編號(hào)

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

取水稻秸稈青貯飼料樣品20 g，加入180 mL蒸餾水，攪拌均勻，用組織搗碎機(jī)攪碎1 min，先后用4層紗布和定性濾紙過(guò)濾，濾出殘?jiān)玫浇鲆海儆胮H測(cè)定儀(Testo 205型號(hào)，德國(guó))測(cè)定青貯飼料浸出液的pH[8-9]。采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，NH3-N)含量[10]。使用GC128型氣相色譜分析乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic

acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)的含量，分析條件為：火焰離子化檢測(cè)器(FID)，柱2 m×4 mm，固定相Pora-pak Q(80目)，柱溫220 ℃，氣化室和檢測(cè)器溫度260 ℃，N2=65 mL/min，空氣=550 mL/min，H2=55 mL/min，靈敏度16×103，紙速5 mm/min。測(cè)定處理前后的水稻秸稈的營(yíng)養(yǎng)含量，包括干物質(zhì)(dry matter，DM)、纖維素(cellulose，C)、半纖維素(hemicellulose，HC)、木質(zhì)素(lignin，L)、粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)、總氮(total nitrogen，TN)含量[11]。

1.3.2 水稻秸稈微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

1.3.2.1 聚合度

莖段樣品過(guò)200目，采用苯酚-硫酸法[12]測(cè)定莖段樣品中的總糖濃度，BCA法[13]測(cè)定樣品中還原糖的濃度，總糖濃度與還原糖濃度的比值，即為樣品的聚合度，平均聚合度取整數(shù)[14]。

1.3.2.2 FTIR圖譜

[15]，使用VERTEX 70V型傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker公司，德國(guó))對(duì)不同組的水稻秸稈青貯飼料進(jìn)行掃描電鏡觀察，并得出FTIR圖譜。試驗(yàn)處理：莖段粉碎1 min，過(guò)200目；60 ℃，干燥12 h后，稱取1 mg樣品與50 mg KBr研磨，壓強(qiáng)1 MPa，壓成直徑約13 mm直徑的薄片。試驗(yàn)條件：掃描范圍在1 000 cm-1～4 000 cm-1區(qū)間，光譜分辨率2 cm-1。

1.3.2.3 XRD圖譜

參照文獻(xiàn)[16]，使用D8-Advance型XRD儀(Bruker公司，德國(guó))，對(duì)經(jīng)不同處理的水稻秸稈青貯飼料進(jìn)行XRD掃描，得出XRD圖。試驗(yàn)處理：莖段樣品均粉碎1 min，過(guò)200目。試驗(yàn)條件：Cu-Ka，40 kV×40 mA，掃描速度1 ℃/min，步長(zhǎng)0.04°，2θ角掃描范圍3°～40°。觀察不同處理后的樣品結(jié)晶度變化，并根據(jù)Meyer等[16]提出的公式計(jì)算結(jié)晶度：

CrI(%)=[(I002-Iam)/I002]×100。

式中：CrI表示結(jié)晶度；I002表示纖維素Ⅰ在2θ為22°～23°時(shí)結(jié)晶強(qiáng)度的最大值(對(duì)于纖維素Ⅱ，2θ為18°～22°)；Iam表示纖維素I在2θ為18°～19°時(shí)結(jié)晶強(qiáng)度的最小值(對(duì)于纖維素Ⅱ，2θ為13°～15°)。

1.3.2.4 比表面積

采用伊紅美蘭法測(cè)定樣品的比表面積[7]。莖段樣品過(guò)200目，取0.2 g懸浮25 mL美蘭溶液中，恒溫25 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min，振蕩吸附12 h，每種3組平行。取出靜置15 min，10 000 r/min離心15 min，取得上清液，在660 nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，測(cè)得溶液中美蘭的含量，單位質(zhì)量秸稈吸附劑吸附美蘭的量可引據(jù)下列公式計(jì)算出：

q=[(C0-Ct)×V]/m。

式中：q表示單位質(zhì)量秸稈樣吸附美蘭的量(mg/g)；C0表示美蘭的初始濃度(mg/L)；Ct表示t時(shí)刻美蘭的濃度(mg/L)；V表示美蘭溶液的體積(L)；M表示秸稈樣的質(zhì)量(g)。

S=q×a。

式中：S表示比表面積(m2/g)；q表示單位質(zhì)量秸稈樣吸附美蘭的量(mg/g)；a為1 mg美蘭覆蓋固體的面積，對(duì)秸稈物質(zhì)為2.45 m2。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Excel 2010初步整理后，采用SPSS 19.0軟件的單因素方差分析檢驗(yàn)程序進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料的營(yíng)養(yǎng)成分

由表2可知，青貯原料的纖維素含量為338.84 g/kg DM，青貯原料的DM含量為229.07 g/kg FM。

表2 青貯原料的營(yíng)養(yǎng)成分

2.2 水稻秸稈青貯處理后發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分

由表3可知，水稻秸稈經(jīng)不同青貯處理后，與S組相比，pH均顯著降低(P<0.05)，乳酸含量均顯著增加(P<0.05)，其中CPL組乳酸含量最高。各組之間的DM含量差異不顯著(P>0.05)，PL組、C組和CPL組纖維素含量均顯著低于S組(P<0.05)，各組的木質(zhì)素含量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

2.3 水稻秸稈不同青貯處理后的微觀結(jié)構(gòu)

2.3.1 聚合度

由表4可知，與水稻稻秸原料(M組)相比，不同處理青貯后的水稻秸稈聚合度均發(fā)生了不同程度的減少，且差異顯著(P<0.05)。與S組相比，PL組、C組及CPL組聚合度顯著降低(P<0.05)，其中，CPL組聚合度最低。

表3 水稻秸稈青貯處理后發(fā)酵品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分

表4 水稻秸稈聚合度

2.3.2 FTIR圖譜

水稻秸稈經(jīng)不同處理青貯后，F(xiàn)TIR圖譜圖存在一定差異(圖1)。青貯前水稻秸稈的FTIR圖譜中木質(zhì)纖維素特征吸收峰均有出現(xiàn)。將經(jīng)不同青貯處理后水稻秸稈的FTIR圖譜進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，2 921 cm-1處甲基和亞甲基吸收峰，1 162和1 051 cm-1處以及1 735 cm-1處的振動(dòng)峰強(qiáng)度明顯減弱，說(shuō)明C—O—C鍵發(fā)生斷裂，秸稈中纖維素和半纖維素被部分降解。而在1 656 cm-1處的苯環(huán)吸收峰也明顯減弱，證明木質(zhì)素除被解聚之外，還發(fā)生了部分苯環(huán)降解。

2.3.3 結(jié)晶度

經(jīng)不同酶或酶組合處理之后的水稻秸稈青貯飼料與未處理的水稻秸稈相比，XRD峰的位置基本沒(méi)有改變，只是峰的強(qiáng)度產(chǎn)生一定的變化。由圖2可知，PL組、C組、CPL組的101和002處結(jié)晶衍射峰強(qiáng)度明顯低于S、M組，峰形更平緩。各組004處的衍射峰強(qiáng)度都較弱。

1.水稻秸稈(M)；2.青貯對(duì)照(S)；3.果膠酶+漆酶(PL)；4.復(fù)合酶制劑(C)；5.復(fù)合酶制劑+果膠酶+漆酶(CPL)。下圖同。

1. rice straw (M); 2. silage control (S); 3. pectinase+laccase (PL); 4. compound enzyme preparation (C); 5. compound enzyme preparation+pectinase+laccase (CPL). The same as below.

圖1 水稻秸稈FTIR圖譜

Fig.1 FTIR spectra of rice straw

圖2 水稻秸稈X射線衍射圖譜

由表5可知，水稻秸稈經(jīng)不同青貯處理后，與S組相比，結(jié)晶度具有降低的趨勢(shì)，但是差異不顯著(P>0.05)，CPL組結(jié)晶度降低的最明顯。

2.3.4 比表面積

由表6可知，水稻秸稈經(jīng)不同青貯處理后，與S組相比，各組的比表面積值沒(méi)有顯著變化(P>0.05)，變化范圍不大(1.12～1.20m2/g)，其中CPL組的比表面積增加的最多。

3 討 論

3.1 不同酶制劑及組合處理對(duì)水稻秸稈青貯飼料營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)的影響

趙政等[17]研究發(fā)現(xiàn)，稻秸青貯飼料經(jīng)酶處理后，對(duì)DM含量沒(méi)有顯著影響，本試驗(yàn)結(jié)果與其相符，說(shuō)明水稻秸稈飼料經(jīng)酶處理后，較大程度地保留了飼料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與青貯對(duì)照組相比，稻秸青貯飼料經(jīng)過(guò)復(fù)合酶制劑、果膠酶+漆酶、復(fù)合酶制劑+果膠酶+漆酶處理后，纖維素的含量不同程度降低，可能是由于在青貯過(guò)程中，纖維素被酶降解為單糖或雙塘，為乳酸菌發(fā)酵提供底物，這與趙國(guó)琦等[18]研究結(jié)果一致。然而，在本試驗(yàn)中復(fù)合酶制劑及復(fù)合酶制劑+果膠酶+漆酶處理的粗蛋白質(zhì)含量明顯低于青貯對(duì)照組，這與趙政等[17]和趙國(guó)琦等[18]結(jié)果不符。陶蓮等[8]研究認(rèn)為，秸稈青貯后氨態(tài)氮含量的提高可能會(huì)引起粗蛋白質(zhì)的消耗，本試驗(yàn)結(jié)果與其相似。

表5 水稻秸稈結(jié)晶度

表6 水稻秸稈比表面積

大量研究表明，水稻秸稈青貯飼料經(jīng)酶處理后，可促進(jìn)青貯乳酸發(fā)酵，改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)[15，19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與青貯對(duì)照組相比，經(jīng)不同的酶制劑及組合處理后，氨態(tài)氮/總氮顯著降低，pH顯著降低，說(shuō)明不同的酶制劑及組合在一定程度上改善了水稻秸稈青貯的品質(zhì)，此結(jié)果與王興剛[20]的試驗(yàn)結(jié)果相符。青貯飼料中添加酶制劑的主要目的是把纖維素、半纖維素等結(jié)構(gòu)性的碳水化合物降解為可溶性的糖，以獲得更多的發(fā)酵底物，促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵[21]。本試驗(yàn)青貯飼料經(jīng)不同的酶或酶組合處理后，與青貯對(duì)照組組比，乳酸含量顯著提高，乙酸含量降低，說(shuō)明不同酶及酶組合處理的水稻秸稈青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中，同型發(fā)酵乳酸菌占據(jù)主導(dǎo)地位，促進(jìn)了乳酸菌發(fā)酵，產(chǎn)生了大量的乳酸，提高了發(fā)酵品質(zhì),這與呂文龍等[22]、Nkosi等[23]及李龍興[24]的研究結(jié)果基本一致。青貯對(duì)照組丙酸含量與其他酶及不同酶組合處理差異顯著，青貯對(duì)照組丙酸含量最高。在果膠酶+漆酶及復(fù)合酶制劑處理中檢測(cè)到了微量的丁酸，說(shuō)明這2組與其他處理相比青貯效果不佳，與王力生等[25]的結(jié)果相似，可能與保存方式有關(guān)，尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.2 不同酶制劑及組合處理對(duì)青貯水稻秸稈微觀結(jié)構(gòu)的影響

聚合度的大小決定纖維素碳鏈的長(zhǎng)度，是纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的重要表征[26]。馮沖凌等[27]利用PCA分析方法發(fā)現(xiàn)，添加酶可促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程中微生物對(duì)聚合物碳源的代謝能力，本試驗(yàn)研究結(jié)果與其基本相符。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，青貯稻秸經(jīng)復(fù)合酶制劑、果膠酶+漆酶、復(fù)合酶制劑+果膠酶+漆酶組處理后，與青貯對(duì)照組相比，聚合度降低的幅度分別為30.26%、27.71%、56.32%，表明處理后纖維素碳鏈縮短，被酶降解為可利用的發(fā)酵糖，與Zhang等[26]試驗(yàn)結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶制劑+果膠酶+漆酶處理聚合度降低幅度明顯高于復(fù)合酶制劑、果膠酶+漆酶處理，原因可能是所用酶制劑中含β-葡聚糖酶，其作為內(nèi)切葡聚糖酶可作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解纖維素中的糖苷鍵，把纖維素長(zhǎng)碳鏈切斷，轉(zhuǎn)化成不同聚合度的纖維素短碳鏈，最終纖維素聚合度降低，并使外切酶作用的纖維素碳鏈末端數(shù)增加。但β-葡聚糖酶并不能單一完成降解，需要多種酶共同協(xié)作才能完成[24]。

纖維素碳鏈形成的片層因排列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分為結(jié)晶區(qū)纖維素與無(wú)定形纖維素，其中結(jié)晶性纖維素難被動(dòng)物機(jī)體利用吸收，由于其易結(jié)晶的特點(diǎn)，結(jié)晶度作為反映纖維素聚集時(shí)形成結(jié)晶的程度表征[1,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酶處理的青貯飼料的結(jié)晶度與青貯對(duì)照組相比，無(wú)顯著性變化。Wang等[31]研究結(jié)果表明，黃孢原毛平革菌具有產(chǎn)細(xì)胞壁降解酶的特性，處理秸稈后，其纖維素結(jié)晶度大大提高，本試驗(yàn)結(jié)果與其不符，原因可能是本試驗(yàn)用酶結(jié)合青貯方法處理秸稈，在發(fā)酵過(guò)程中，酶無(wú)法集中作用于結(jié)晶區(qū)纖維素[30]。本研究中，結(jié)晶度在處理前后未發(fā)生顯著變化，與Lee等[32]研究結(jié)果一致，原因可能是多種纖維素酶協(xié)同作用，才可對(duì)結(jié)晶度產(chǎn)生效果，其中纖維素二糖水解酶占主導(dǎo)作用[33]。同時(shí)，水稻秸稈由于產(chǎn)地等原因，成分及結(jié)構(gòu)都會(huì)產(chǎn)生差異，其降解所需要的酶的組分之間，以及各酶之間活性的最適比例都不盡相同。

比表面積作為表征纖維素微纖絲與降解纖維素酶分子之間可接觸面積大小的指標(biāo)，其對(duì)纖維素在反芻動(dòng)物機(jī)體內(nèi)吸收效果程度有重要意義[1,6]。Castoldi等[15]和Wang等[31]研究結(jié)果都表明，利用生物處理方法處理秸稈，不僅會(huì)改變纖維素的含量，分解部分木質(zhì)素及半纖維素，還增加了纖維素比表面積。本試驗(yàn)中經(jīng)復(fù)合酶制劑+果膠酶+漆酶處理的青貯水稻秸稈比表面積增加的最多，從1.12 m2/g增加至1.20 m2/g，聚合度降低了56.32%，纖維素含量也顯著降低，與其結(jié)果一致。原因可能是果膠酶可分解細(xì)胞間的粘貼物質(zhì)果膠，使秸稈組織疏松，細(xì)胞離間，為其他崩潰細(xì)胞壁的纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶疏通進(jìn)入秸稈組織的通道和細(xì)胞接觸面，并利于秸稈木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的暴露[16,30-31]。本研究將高效纖維素降解酶與其他木質(zhì)素降解酶進(jìn)行組合，發(fā)現(xiàn)單一的木質(zhì)素類(lèi)降解酶組分并不能達(dá)到破解秸稈細(xì)胞壁的效果，需要多種酶類(lèi)組分共同作用才能完成秸稈細(xì)胞壁的降解。

4 結(jié) 論

① 經(jīng)不同酶或酶組合處理后，青貯發(fā)酵45 d后的水稻秸稈青貯飼料均呈黃綠色，質(zhì)地較好，呈酸香味，發(fā)酵末期pH降低，產(chǎn)生大量乳酸，DM及纖維素含量降低，具有良好的發(fā)酵品質(zhì)。

② 復(fù)合酶制劑+果膠酶+漆酶處理能有效地破解細(xì)胞壁中木質(zhì)素-纖維素-半纖維素復(fù)合結(jié)構(gòu)，將纖維素降解為可利用的糖，提高水稻秸稈青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)含量，降低了秸稈聚合度及結(jié)晶度，增大了比表面積。

③ 酶制劑處理不僅能改變水稻秸稈的化學(xué)成分、物理特性，同時(shí)通過(guò)改變纖維素層次性的空間結(jié)構(gòu)，提高秸稈可消化性，從而提高了秸稈的利用率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 裴繼誠(chéng).植物纖維化學(xué)[M].4版.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2012.

[2] 劉盧生,索朗次仁,玉永雄,等.氨化劑和氨化條件對(duì)水稻秸稈氨化的影響[J].飼料工業(yè),2012,33(3):51-54.

[3] DING S Y,LIU Y S,ZENG Y N,et al.How does plant cell wall nanoscale architecture correlate with enzymatic digestibility[J].Science,2012,338(6110):1055-1060.

[4] SARITHA M,ARORA A,LATA.Biological Pretreatment of lignocellulosic substrates for enhanced delignification and enzymatic digestibility[J].Indian Journal of Microbiology,2012,52(2):122-130.

[5] 張立霞,刁其玉,李艷玲,等.利用生物制劑破解秸稈抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè),2013,34(5):21-26.

[6] 王玉榮,陶蓮,許貴善,等.秸稈木質(zhì)纖維素微觀結(jié)構(gòu)及其裂解方法[J].中國(guó)飼料,2016(12):38-41.

[7] 崔美,黃仁亮,蘇榮欣,等.木質(zhì)纖維素新型預(yù)處理與頑抗特性[J].化工學(xué)報(bào),2012,63(3):677-687.

[8] 陶蓮,刁其玉.青貯發(fā)酵對(duì)玉米秸稈品質(zhì)及菌群構(gòu)成的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,28(1):198-207.

[9] HAN K J,COLLINS M,VANZANT E S,et al.Bale density and moisture effects on alfalfa round bale silage[J].Crop Science,2004,44(3):914-919.

[10] BRODERICK G A,KANG J H.Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid andinvitromedia[J].Journal of Dairy Science,1980,63(1):64-75.

[11] 張麗英.飼料分析及質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2002:53-56,70-74.

[12] MASUKO T,MINAMI A,IWASAKI N,et al.Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format[J].Analytical Biochemistry,2005,339(1):69-72.

[13] 肖瓊,肖安風(fēng),姚德恒,等.瓊膠酶水解工藝條件的優(yōu)化及產(chǎn)物分析[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2015,15(12):99-106.

[14] AN Q D,ZHANG G L,WU H T,et al.Alginate-deriving oligosaccharide production by alginase from newly isolatedFlavobacteriumsp. LXA and its potential application in protection against pathogens[J].Journal of Applied Microbiology,2009,106(1):161-170.

[15] CASTOLDI R,BRACHT A,MORAIS G R D,et al.Biological pretreatment ofEucalyptusgrandissawdust with white-rot fungi:study of degradation patterns and saccharification kinetics[J].Chemical Engineering Journal,2014,258:240-246.

[16] MEYER L,JACQUET N,VANDERGHEM C,et al.Effect of steam explosion pre-treatment on enzymatic saccharification of lignocellulosic material[C]//Cost FP0602 final Meeting/Italic 6.Viterbo:COST,2011.

[17] 趙政,李旭.乳酸菌和纖維素酶對(duì)早秈稻秸稈青貯飼料品質(zhì)的試驗(yàn)[J].飼料工業(yè),2010,31(17):22-25.

[18] 趙國(guó)琦,丁健,賈亞紅,等.纖維素酶對(duì)大黍青貯飼料品質(zhì)的影響[J].中國(guó)畜牧雜志,2003,39(2):9-11.

[19] 李富國(guó),張永根,夏科,等.綠汁發(fā)酵液和脫氫乙酸鈉對(duì)水稻秸青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響[J].中國(guó)飼料,2011(22):20-23.

[20] 王興剛.添加乳酸菌與酶制劑對(duì)稻秸青貯品質(zhì)的影響[D].碩士學(xué)位論文.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[21] VAN KUIJK S J A,SONNENBERG A S M,BAARS J J P,et al.Fungal treated lignocellulosic biomass as ruminant feed ingredient:a review[J].Biotechnology Advances,2015,33(1):191-202.

[22] 呂文龍,刁其玉,閆貴龍.不同添加劑對(duì)不帶穗玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(3):22-26.

[23] NKOSI B D,MEESKE R,PALIC D,et al.Laboratory evaluation of an inoculant for ensiling whole crop maize in South Africa[J].Animal Feed Science and Technology,2009,150(1/2):144-150.

[24] 李龍興.西藏主要農(nóng)作物秸稈與牧草混合青貯的研究[D].碩士學(xué)位論文.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[25] 王力生,齊永玲,陳芳,等.不同添加劑對(duì)筍殼青貯品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2013,22(5):326-332.

[26] ZHANG M F,QIN Y H,MA J Y,et al.Depolymerization of microcrystalline cellulose by the combination of ultrasound and Fenton reagent[J].Ultrasonics Sonochemistry,2016,31:404-408.

[27] 馮沖凌.黃孢原毛平革菌及其關(guān)鍵功能酶對(duì)木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化特性的研究[D].博士學(xué)位論文.長(zhǎng)沙:湖南大學(xué),2011.

[28] 柳珊,吳樹(shù)彪,張萬(wàn)欽,等.白腐真菌預(yù)處理對(duì)玉米秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷影響實(shí)驗(yàn)[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào),2013,44(增刊2):124-129,142.

[29] 唐洪濤,王鋒,李偉明,等.γ射線輻照與NaOH溶液協(xié)同預(yù)處理對(duì)玉米秸稈酶解產(chǎn)糖率及微觀結(jié)構(gòu)的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2012,26(3):535-542.

[30] DAI Y Z,SI M Y,CHEN Y H,et al.Combination of biological pretreatment with NaOH/Urea pretreatment at cold temperature to enhance enzymatic hydrolysis of rice straw[J].Bioresource Technology,2015,198:725-731.

[31] WANG F Q,XIE H,CHEN W,et al.Biological pretreatment of corn stover with ligninolytic enzyme for high efficient enzymatic hydrolysis[J].Bioresource Technology,2013,144:572-578.

[32] LEE J W,GWAK K S,PARK J Y,et al.Biological pretreatment of softwoodPinusdensifloraby three white rot fungi[J].Journal of Microbiology,2007,45(6):485-491.

[33] PANDEY K K,PITMAN A J.Examination of the lignin content in a softwood and a hardwood decayed by a brown-rot fungus with the acetyl bromide method and Fourier transform infrared spectroscopy[J].Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry,2004,42(10):2340-2346.

*Corresponding author, professor, E-mail: diaoqiyu@caas.cn

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effect of Different Enzymes and Their Combinations on Microstructure of Rice Straw Silage

WANG Yurong1,2TAO Lian2MA Tao2SHI Changqing1XU Guishan1DIAO Qiyu1,2*

(1.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar843300,China; 2.KeyLaboratoryofFeedBiotechnologyofMinistryofAgriculture,FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China)

In order to achieve the high-efficiency degradation of crop straw and improve its nutritional value, high efficient degrading enzymes for silage fermentation were used to investigate their effects of microstructure of rice straw silage. Silage control (S group), compound enzyme preparation treated (C group), pectinase+laccase treated (PL group), compound enzyme preparation+pectinase+laccase treated (CPL group) and raw material (M group) were used and samples were packaged by vacuum packager in polyethylene bags. After storing at room temperature for 45 d, changes of the silage quality and nutrients content were analyzed using laboratory testing methods, and changes of microstructure were analyzed using phehol-suffufic acid colorimetry, bicinchoninic acid disodium salt (BCA) method, fourier transform infared spectroscopy (FTIR), X-ray diffraction analysis and eosin-methylene blue method. The results showed as follows: 1) compared with the S group, the lactic acid (LA) content in PL, C and CPL groups was significantly increased (P<0.05), the pH, ratio of ammonia nitrogen to total nitrogen and content of acetic acid and cellulose were significantly decreased (P<0.05); the crude protein (CP) content in C and CPL groups was significantly decreased (P<0.05). 2) Compared with the S group, the polymerization degree of rice straw silage in PL group was significantly decreased (P<0.05), which was lowered by 30.26%, the intermolecular hydrogen bond binding force was faded, and specific surface area and crystallinity did not change (P>0.05); the polymerization degree of rice straw silage in C group was significantly decreased (P<0.05), which was lowered by 27.11%, the intermolecular hydrogen bond binding force was faded, and specific surface area and crystallinity did not change (P>0.05); the polymerization degree of rice straw silage in CPL group was significantly decreased (P<0.05), which was lowered by 56.32%, the intermolecular hydrogen bond binding force was faded, and specific surface area and crystallinity trend increased (P>0.05). In conclusion, CPL group has the best effect, it can effectively break the lignin-cellulose-hemicellulose composite structure and cellulose degraded into available sugar, improve the nutrient content of rice straw silage fodder, reduce the degree of polymerization and the crystallinity, increase the specific surface area, so as to improve the digestibility and utilization of the straw.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1401-1408]

straw; lignocellulose; microstructure; biological treatment

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.039

2016-09-03

秸稈飼料生物轉(zhuǎn)化技術(shù)研究與示范項(xiàng)目(20120304202)；國(guó)家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-39)

王玉榮(1992—)，女，新疆昌吉人，碩士研究生，從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail： wangyurong@live.com

*通信作者:刁其玉，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail： diaoqiyu@caas.cn

S816.33

A

1006-267X(2017)04-1401-08