肖麗君+陳小強(qiáng)+趙銘+王東元+覃美運(yùn)+王景太

摘要：麝香石斛（Dendrobium parishii Rchb. f.）是原種石斛，具有很高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值。試驗(yàn)利用組織培養(yǎng)技術(shù)篩選培養(yǎng)基合適的激素濃度，在最優(yōu)條件下觀察麝香石斛試管苗7～108 d的生長情況，分析麝香石斛不同生長階段植物多糖含量的變化情況和積累規(guī)律。結(jié)果顯示，麝香石斛多糖含量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而提高，0～40 d增長速率較為緩慢，40～80 d增長較快，之后的多糖含量又開始趨于平緩。

關(guān)鍵詞：麝香石斛（Dendrobium parishii Rchb. f.）；組織培養(yǎng)；生長效應(yīng)；多糖

中圖分類號：S567.9+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）06-1090-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.06.024

Abstract： Dendrobium parishii Rchb. f. is Dendrobium protospecies，which is of high ornamental and medicinal value. By using tissue culture techniques， the best concentration of 6-BA and NAA for the growth of plant tissues was selected. Under the optimal conditions， the plantlets was cultured and analyzed in different growth phases in 7 to 108 d， and the plant polysaccharides was also analyzed with time changes. The results show that the content of polysaccharides of D. parishii increased with the cultured time adding， and the growth rate is relatively slow in 0 to 40 d， rapidly in 40 to 80 d， and after then begins to flatten.

Key words： Dendrobium parishii Rchb. f.； tissue culture； growth effects； polysaccharide

蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium Sw.）目前有1 100多種，是蘭科中的第二大屬[1]。其中麝香石斛（Dendrobium parishii Rchb. f.）是原種石斛，不僅具有很高的觀賞價(jià)值，而且還有重要的藥用價(jià)值。麝香石解有效藥用成分主要是多糖、生物堿、類黃酮、菲類化合物等物質(zhì)。其中含量最多的是生物堿和多糖[2]。多糖是麝香石斛中最重要的藥用成分，也是自然界中最多的一種有機(jī)高分子化合物，不僅可以提高免疫功能，還可以抗病毒、降血糖、抗腫瘤等[3]。許多研究都證實(shí)了以組織培養(yǎng)物代替原植物做藥用的可行性，顧慧芬等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛組培苗和野生品的多糖類型與含量基本是相同的；高建平等[5]研究報(bào)道，鐵皮石斛組織培養(yǎng)物原球莖藥用作用與原藥材相似；何鐵光等[6]也證明，鐵皮石斛類原球莖的多糖含量與野生品相近，藥理作用相同。試驗(yàn)利用組織培養(yǎng)技術(shù)，通過調(diào)節(jié)不同植物激素濃度配比進(jìn)行培養(yǎng)基配方優(yōu)化，在最適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對麝香石斛進(jìn)行試管培養(yǎng)，并在其不同生長階段測定多糖含量，以期建立并優(yōu)化麝香石斛試管苗培養(yǎng)體系，研究其生長過程中多糖的積累規(guī)律，為提高多糖含量及大規(guī)模生產(chǎn)有效藥用成分提供技術(shù)參數(shù)，同時(shí)也為石斛多糖合成機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用繼代多次、具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長速率的麝香石斛試管苗為外植體，由天津農(nóng)學(xué)院植物細(xì)胞工程中心提供。試劑、儀器由天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 麝香石斛最適生長培養(yǎng)基篩選

在麝香石斛組織培養(yǎng)過程中，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂6.5 g/L、活性炭2 g/L，通過調(diào)整植物激素含量，篩選出最適合麝香石斛試管苗生長的培養(yǎng)基，激素濃度配比見表1。每處理做30次重復(fù)，觀察一段培養(yǎng)時(shí)間（分別是20、40、60、80、100 d）內(nèi)麝香石斛試管苗的變化情況，選取最適合麝香石斛試管苗生長的激素濃度配比。

1.3 多糖測定

各個(gè)待測材料的鮮樣先用去離子水洗凈，再用濾紙吸干水分，稱重得鮮重。在烘箱里以105 ℃對麝香石斛材料殺青15 min，再將其置于80 ℃恒溫烘箱中烘至恒重；接著用研缽研碎，稱重得干重，然后分別裝入樣品袋，貼上相應(yīng)的標(biāo)簽，放入干燥器中保存。采用苯酚-濃硫酸法對多糖含量進(jìn)行測定。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照李滿飛等[7]的方法完成麝香石斛多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。先把在105 ℃烘箱中干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品稱取0.1 g，用去離子水定容于1 000 mL的容量瓶中。得到0.1 mg/mL葡萄糖溶液，再分別精確吸取0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.60、0.80 mL樣品加到試管中，都加入去離子水到2.0 mL刻度。然后各加入苯酚試劑（10 g苯酚定容在150 mL的容量瓶中）1.0 mL，搖勻；迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置5 min，置沸水浴中加熱15 min后，冷水迅速冷卻到室溫。另外，用去離子水2.0 mL進(jìn)行同法操作，作為空白對照。在紫外分光光度計(jì)的波長490 nm處測各葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，以吸光度值對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.3.2 多糖的測定 每個(gè)樣品取2 g，研磨后加入20 mL去離子水，將研磨液加熱1 h后，進(jìn)行二級提取，將提取液通過3 000 r/min離心5 min，取上清液0.1 mL，分別稀釋10、20、30倍。取稀釋液1 mL加入5%苯酚5 mL、濃硫酸5 mL，靜置5 min，接下來放到沸水浴中15 min，然后用冷水冷卻到室溫。將樣品加入到比色皿中，在490 mm處測定吸光度；空白為1 mL去離子水加5 mL苯酚和5 mL濃硫酸。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各樣品的多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度配比下麝香石斛試管苗生長變化

試驗(yàn)各個(gè)時(shí)期麝香石斛試管苗的生長情況見表2。在表2中，優(yōu)：表示在所有試驗(yàn)處理中生長發(fā)育狀況最好，其生長狀況要明顯優(yōu)于對照；良：表示生長發(fā)育狀況次于優(yōu)水平，重量約是優(yōu)水平的80%左右；中：表示生長發(fā)育狀況次于良水平，重量約是良水平的60%～80%左右；差：表示生長發(fā)育狀況較差，或者死亡。將不同激素濃度下的麝香石斛試管苗生長情況進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。從表2和圖1可見，對照由于沒有添加激素，其生長是最慢的；S4處理可能是由于操作過程不當(dāng)，導(dǎo)致其被細(xì)菌感染而逐漸死亡；其余的處理如S1和S2在培養(yǎng)的后期，其生物量明顯要高于其他處理，說明此時(shí)激素的濃度配比較合適，S6相對于其他處理生長量是最大的，說明最適合植物生長的激素組合為6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。根據(jù)觀察，S6處理的試管苗生長較為茂盛，因此接下來的試驗(yàn)中，將采用S6處理的激素組合對麝香石斛試管苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

2.2 麝香石斛試管苗多糖測定

把S6處理（最優(yōu)條件）放入培養(yǎng)基，則培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L+瓊脂6.5 g/L，用其對麝香石斛試管苗進(jìn)行組織培養(yǎng)。然后分別在培養(yǎng)開始的7、14、22、29、36、54、72、108 d取麝香石斛在培養(yǎng)過程不同生長階段的試管苗，測定不同階段麝香石斛試管苗的多糖含量，確定麝香石斛試管苗多糖含量最高的時(shí)期。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)測得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，

OD=2.607 4C，R2=0.999 1，

式中，OD為吸光值，C為待測液體的濃度，單位是mg/mL。通過線性回歸方程，擬合出多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體見圖2。通過測定麝香石斛試管苗中的多糖在490 nm波長下的吸光值，根據(jù)公式計(jì)算得到樣品的多糖濃度，比較并摸索多糖濃度隨著時(shí)間變化的增長規(guī)律，后續(xù)需要調(diào)整濃度范圍，從而確定每一個(gè)樣品中的多糖含量。

2.2.2 不同培養(yǎng)階段麝香石斛試管苗多糖含量測定 通過圖2擬合出的曲線，在紫外分光光度計(jì)上測定不同培養(yǎng)階段麝香石斛試管苗中的多糖含量，結(jié)果見表3。將不同培養(yǎng)階段多糖含量作圖，得到圖3。從圖3可以看出，麝香石斛試管苗多糖的含量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而提高，在0～40 d增長速率較為緩慢，40～80 d增長情況較快，說明此階段是植物組織培養(yǎng)階段中植物多糖增長最快的時(shí)期，之后植物多糖含量增長的速率開始趨緩。

3 討論

3.1 不同激素濃度配比對麝香石斛試管苗生長的影響

植物激素具有促進(jìn)植物分裂生長的作用，其作用機(jī)制一般是通過使細(xì)胞壁松弛，從而使細(xì)胞壁增長；在許多植物中，還可以使RNA和蛋白質(zhì)的含量增加[8]。不同激素濃度配比對植物的再生有很大影響[9]，控制細(xì)胞分裂素類和生長素類兩者的濃度，可以控制試管苗的增殖與生根，生長素/細(xì)胞分裂素的比值小時(shí)，有利于分化和增殖，比值大時(shí)則有利于生根[10]。陳兆貴等[11]對鐵皮石斛組織培養(yǎng)過程中不同激素影響做了相應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)原球莖增殖以MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L為最佳條件。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同激素對植物的生長效應(yīng)確實(shí)是不同的，而最適合麝香石斛試管苗生長的激素濃度為6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。分析認(rèn)為，植物激素能使麝香石斛試管苗加快生長，因此，推測其體內(nèi)多糖含量也隨之增加。

3.2 不同培養(yǎng)階段麝香石斛試管苗多糖含量的變化

植物多糖是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的聚合度較大的物質(zhì)，屬于植物的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，是植物生長過程中必不可少的提供能量的營養(yǎng)物，如淀粉、糖原等都是重要的植物多糖。多糖為石斛類植物最主要的有效成分，因此麝香石斛試管苗中多糖含量成為評定試管苗生長效應(yīng)的重要因素。試驗(yàn)在麝香石斛組織培養(yǎng)過程中，隨著不同時(shí)間的變化，比較了多糖的增長情況，發(fā)現(xiàn)麝香石斛組織培養(yǎng)增殖期間，在0～40 d左右時(shí)試管苗多糖的增加量并不是很大，約在200～1 400 μg/g，說明植物組織培養(yǎng)初期對于合成多糖的能力相對較弱，可能是由于植物的光合系統(tǒng)還沒有完全形成造成的，因?yàn)楣夂舷到y(tǒng)是產(chǎn)生多糖的最關(guān)鍵系統(tǒng)，植物可以通過三羧酸循環(huán)將CO2轉(zhuǎn)化為非結(jié)構(gòu)性碳水化合物，而在組織培養(yǎng)過程的初期，其多糖是通過植物吸收營養(yǎng)得來的。通過分析，可以得到多糖的含量在植物組織培養(yǎng)初期后40～80 d左右時(shí)迅速增加，可能是此時(shí)植物的光合系統(tǒng)逐漸趨于完善的緣故，其在60、80 d的多糖含量分別快速增加到4 143、6 423 μg/g。80 d后，其多糖含量趨于平緩。

試驗(yàn)結(jié)果表明，最適合麝香石斛試管苗生長的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+活性炭2 g/L+瓊脂6.5 g/L，在此條件下麝香石斛試管苗多糖含量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而提高，其中在試管苗培養(yǎng)時(shí)間0～40 d的多糖含量增長較為緩慢，40～80 d多糖含量增長較快，之后開始趨于平緩。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吉占和.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1999.

[2] 林 萍，畢志明，徐 紅，等.石斛屬植物藥理活性研究進(jìn)展[J].中草藥，2003，34（11）：附19-附22.

[3] 時(shí)瀟麗，姚春霞，林 曉，等.多糖藥物應(yīng)用與研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2014，23（9）：1057-1062.

[4] 顧慧芬，忻曉君，周文婷，等.鐵皮石斛試管苗快速生長與栽培研究及多糖含量測定[J].中成藥，1999，21（12）：658-659.

[5] 高建平，金若敏，吳耀平，等.鐵皮石斛原球莖與原藥材免疫調(diào)節(jié)作用的比較研究[J].中藥材，2002，25（7）：487-489.

[6] 何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等.鐵皮石斛原球莖多糖DCPP1a-1對氧自由基和脂質(zhì)過氧化的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007， 19（3）：410-414.

[7] 李滿飛，徐國鈞，平田義正，等.中藥石斛類多糖的含量測定[J].中草藥，1990，21（10）：10-12.

[8] 劉天寶.不同葉序植物內(nèi)源細(xì)胞分裂素和生長素差異分析[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[9] 陳振光.園藝植物離體培養(yǎng)學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.84-85.

[10] 王 忠.植物生理學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[11] 陳兆貴，譚 俊.不同激素配比對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響研究[J].惠州學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，26（3）：11-14.