胡宇豪，李戴陽，汪超，高冰，李冬生，徐寧，胡勇*

（湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068）

耐受乙醇巴氏醋桿菌ZJ-25培養(yǎng)基的優(yōu)化

胡宇豪，李戴陽，汪超，高冰，李冬生，徐寧，胡勇*

（湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430068）

以中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵醋醅中分離得到的1株耐受12%vol乙醇的巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）ZJ-25為出發(fā)菌株，以產(chǎn)酸量為評價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基組合為葡萄糖3%、酵母粉3%、乙醇5.5%、乙酸0.12%。在此最佳培養(yǎng)基條件下，菌株ZJ-25的產(chǎn)酸量由常規(guī)培養(yǎng)基條件下的32.5 g/L提高至44.3 g/L。

醋酸菌；耐乙醇；培養(yǎng)基；優(yōu)化

醋酸菌是釀醋工業(yè)的核心菌種。在釀醋工業(yè)中，最常用于釀醋的醋酸菌是醋桿菌屬（Acetobacter），其中菌株的優(yōu)劣直接影響成醋的產(chǎn)量、質(zhì)量及風(fēng)味[1-3]。巴氏醋酸菌能夠更為高效轉(zhuǎn)化酒精生成醋酸，同時(shí)其含有豐富的氧化酶系，不僅能夠?qū)⒕凭D(zhuǎn)化為醋酸，還能氧化形成琥珀酸、檸檬酸等有機(jī)酸，對醋的風(fēng)味形成有較大影響[4-5]。醋酸菌在食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)有著較為廣泛的應(yīng)用，在葡萄糖酸和二羥基丙酮的微生物合成中有著重要的作用，該類菌株還具有固氮作用，能用于細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)[6-8]。

醋酸菌是一類好氧的產(chǎn)酸細(xì)菌，乙醇是醋酸發(fā)酵的底物，并且為醋酸菌生長代謝提供能量，溫度和pH是影響醋酸菌生長和代謝的重要因素，是醋酸菌氧化酒精生成乙酸的重要條件[9-10]。大多數(shù)醋酸菌株可用六碳糖作為碳源，并且在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物CO2、醋酸、乳酸、丙酸以及丙酮等。關(guān)于培養(yǎng)基的相關(guān)研究已經(jīng)表明，醋酸桿菌發(fā)酵的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母粉[11-13]，此外，外源乙醇和乙酸也是發(fā)酵培養(yǎng)基中常添加的成分[14-15]。

本研究以中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵醋醅中分離得到的1株巴氏醋桿菌（Acetobacterpasteurianus）ZJ-25為出發(fā)菌株，碳源選用葡萄糖，氮源選用酵母粉，同時(shí)添加不同濃度的乙醇和乙酸，對培養(yǎng)基配方進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，這將為菌種的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)，為菌種的工業(yè)應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏醋桿菌（Acetobacterpasteurianus）ZJ-25：由本實(shí)驗(yàn)室分離自中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵的醋醅，可耐受體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇溶液。

1.1.2 試劑

無水乙醇、氯化鈉、葡萄糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：上?；瘜W(xué)試劑有限公司；碳酸鈣：德興市明緣化工材料有限公司；酚酞：天津市北辰方正試劑廠；酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司；瓊脂：華順生物技術(shù)有限公司；鹽酸：西隴化工股份有限公司。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR323C電子天平：奧豪斯儀器公司；DZ-101C磁力加熱攪拌器：鞏義市予華儀器有限公司；FE20數(shù)顯式酸度計(jì)、DZF-6050電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH4-電熱恒溫水浴鍋、DHG-9070A恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DXO 7771大龍移液槍：大龍新創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；I8雙光束紫外可見分光光度計(jì)：濟(jì)南海能儀器有限公司；HNY-2112B柜式全溫震蕩培養(yǎng)箱：天津歐諾儀器儀表公司；FY50高壓蒸汽滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；TGL-20臺(tái)式高速離心機(jī)：武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；SW-CJ凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高耐受性醋酸桿菌培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)

（1）葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響：取500mL三角瓶，設(shè)置5個(gè)處理，葡萄糖添加量分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，其他成分為酵母粉3%、乙醇6%、乙酸0.1%，用少量水溶解，并加水定容至150 mL，移至三角瓶中，121℃滅菌15 min；在以下條件下進(jìn)行揺瓶發(fā)酵，將4%醋酸菌液體菌種接種已滅菌的三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度38℃、pH 5.0、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵時(shí)間6 d[16]的條件下每個(gè)處理組重復(fù)3次，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量。

（2）酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響：取500 mL三角瓶，設(shè)置5個(gè)處理，酵母粉添加量分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，其他成分為葡萄糖3.0%、乙醇6.0%、乙酸0.1%，加水配制成150 mL的培養(yǎng)基，滅菌后接種，按照1.3.1（1）的條件進(jìn)行揺瓶發(fā)酵。

（3）乙醇添加量對產(chǎn)酸量的影響：取500 mL三角瓶，設(shè)置5個(gè)處理，乙醇添加量分別為4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%，其他成分為葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙酸0.1%，配制成150 mL的培養(yǎng)基，滅菌后接種，按照1.3.1（1）的條件進(jìn)行揺瓶發(fā)酵。

（4）乙酸添加量對產(chǎn)酸量的影響：取500 mL三角瓶，設(shè)置5個(gè)處理，乙酸添加量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，其他成分為葡萄糖添加量3.0%、酵母粉添加量3.0%、乙酸添加量0.1%，配制成150 mL的培養(yǎng)基，滅菌后接種，按照1.3.1（1）的條件進(jìn)行揺瓶發(fā)酵。

1.3.2 高耐乙醇醋酸桿菌培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取葡萄糖、酵母粉、乙醇和乙酸的添加量等4個(gè)因素，采用4因素3水平的正交試驗(yàn)對巴氏醋桿菌ZJ-25的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。以發(fā)酵結(jié)束后的產(chǎn)酸量為評價(jià)指標(biāo)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

表1 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium formula optimization

1.3.3 菌株產(chǎn)酸量的測定

精密量取3.0 mL樣品于250 mL錐形瓶中，加50 mL水，滴加1～2滴酚酞試劑，放入磁力攪拌子并置于磁力攪拌器上攪拌，邊攪拌邊滴入氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定。當(dāng)溶液由無色變?yōu)榉凵珪r(shí)停止滴加，讀取氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液消耗的體積。具體測定方法參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高耐受性醋酸桿菌培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)

2.1.1 葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響見圖1。由圖1可知，當(dāng)葡萄糖添加量為2.0%～3.0%時(shí)，隨著葡萄糖添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量逐步升高，其中葡萄糖添加量為3.0%時(shí)，產(chǎn)酸量最高，為36.9 g/L；葡萄糖添加量＞3.0%時(shí)，隨著葡萄糖添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量呈明顯下降趨勢；當(dāng)葡萄糖添加量過少時(shí)，碳源不足，醋酸菌的數(shù)量少，產(chǎn)酸量偏低，當(dāng)葡萄糖的添加量過多時(shí)，消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)酸量過低。因此，葡萄糖的最宜添加量為3.0%。

圖1 葡萄糖添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.1 Effect of glucose addition on acid yield of strains

2.1.2 酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

圖2 酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.2 Effect of yeast powder addition on acid yield of strains

酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響見圖2。由圖2可知，當(dāng)酵母粉添加量為2.0%～3.0%時(shí)，隨著酵母粉添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量逐步升高，其中酵母粉添加量為3.0%時(shí)，產(chǎn)酸量最高，為37.3 g/L；酵母粉添加量＞3.0%時(shí)，隨著酵母粉添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量呈明顯下降趨勢。當(dāng)酵母粉添加量過少時(shí)，氮源不足，醋酸菌的數(shù)量少，產(chǎn)酸量偏低，當(dāng)酵母粉的添加量過多時(shí)，消耗了大量的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致產(chǎn)酸量過低。因此，酵母粉的最宜添加量為3.0%。

2.1.3 乙醇添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

乙醇添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)乙醇添加量為4.5%～5.5%時(shí)，隨著乙醇添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量逐步升高，其中乙醇添加量為5.5%時(shí)，產(chǎn)酸量最高，為42.5 g/L；乙醇添加量＞5.5%時(shí)，隨著乙醇添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量呈明顯下降趨勢。乙醇會(huì)氧化為乙酸，當(dāng)乙醇添加量過少時(shí)，乙酸產(chǎn)量偏低；乙醇添加量過大時(shí)，會(huì)抑制醋酸菌產(chǎn)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性，導(dǎo)致乙酸產(chǎn)量的減少。因此，乙醇的最宜添加量為5.5%。

圖3 乙醇添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of ethanol addition on acid yield of strain

2.1.4 乙酸添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響

圖4 乙酸添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of acetic acid addition on acid yield of strain

乙酸添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響見圖4。由圖4可知，當(dāng)乙酸添加量為0.05%～0.10%時(shí)，隨著乙酸添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量逐步升高，其中乙酸添加量為0.10%時(shí)，產(chǎn)酸量最高，為42.9 g/L；乙酸添加量＞0.10%時(shí)，隨著乙酸添加量的增加，菌株產(chǎn)酸量呈明顯下降趨勢。乙酸會(huì)刺激醋酸菌產(chǎn)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶，添加適宜量的乙酸會(huì)增加菌株的產(chǎn)酸量。因此，乙酸的最宜添加量為0.10%。

2.2 高耐受性醋酸桿菌培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

醋酸菌培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for medium formula optimization

由表2可知，從正交試驗(yàn)各項(xiàng)因素的極差和離差平方和可以看出各因素對醋酸積累的影響強(qiáng)度依次為葡萄糖＞酵母粉＞乙醇＞乙酸。根據(jù)直觀分析可得到的優(yōu)化的菌發(fā)酵培養(yǎng)基組合為A2B2C3D1，此時(shí)產(chǎn)酸量為43.8g/L。通過極差分析得到最佳的試驗(yàn)組合為A2B2C2D3，將得到培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，產(chǎn)酸量為44.5 g/L，通過產(chǎn)酸量的比較，得到最佳的試驗(yàn)組合是A2B2C2D3，即培養(yǎng)基組分為葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙醇5.5%、乙酸0.12%，將得到的培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均產(chǎn)酸量為44.3g/L。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

表3的方差分析表明，葡萄糖和酵母粉添加量對菌株產(chǎn)酸量的影響極顯著（P＜0.01），乙醇添加量對產(chǎn)酸量影響顯著（P＜0.05），添加乙酸添加量對產(chǎn)酸量的影響不顯著。

3 結(jié)論

本研究對中國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵醋醅中分離得到的1株高耐受性巴氏醋桿菌ZJ-25的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。通過對培養(yǎng)基中的葡萄糖、酵母粉、乙醇、乙酸的添加量采取正交試驗(yàn)優(yōu)化，得出該菌的最優(yōu)培養(yǎng)基成分為葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙醇5.5%、乙酸0.12%。在發(fā)酵溫度32℃、轉(zhuǎn)速180r/min、發(fā)酵天數(shù)6d、初始pH6.0的發(fā)酵條件下，巴氏醋桿菌ZJ-25的產(chǎn)酸量由常規(guī)條件下的32.5 g/L提高至44.3 g/L。為巴氏醋桿菌ZJ-25的進(jìn)一步研究及工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)：

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Optimization of culture medium for ethanol-tolerantAcetobacter pasteurianusZJ-25

HU Yuhao,LI Daiyang,WANG Chao,GAO Bing,LI Dongsheng,XU Ning,HU Yong*
(Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

UsingAcetobacter pasteurianusisolated from vinegar grains of traditional Chinese solid-state fermentation with 12%vol ethanol tolerance as original strain,using acid yield as evaluation index,the medium formula forA.pasteurianusZJ-25 culture for acid production was optimized by single factor and orthogonal experiments.Results showed that the optimal medium formula was as follows:glucose 3%,yeast powder 3%,ethanol 5.5%,acetic acid 0.12%.Under these conditions,the acid yield of strain ZJ-25 increased from 32.5 g/L to 44.3 g/L.

acetic acid bacteria;ethanol tolerant;culture medium;optimization

TS264.2

0254-5071（2017）04-0118-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.025

2016-11-10

湖北省自然科學(xué)基金（2015CFB678）；湖北省級(jí)教育部門青年人才項(xiàng)目（Q20151412）

胡宇豪（1993-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锖桶l(fā)酵工程。

*通訊作者：胡勇（1980-），男，講師，博士，研究方向?yàn)榧?xì)胞工程。