朱曼利，郭會(huì)明，孫宏韜，李偉，洪厚勝，3*

火龍果酵素中原花青素含量測(cè)定方法的建立

朱曼利1，郭會(huì)明1，孫宏韜2，李偉2，洪厚勝2，3*

（1.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇南京211800；2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800；

3.南京匯科生物工程設(shè)備有限公司，江蘇南京210009）

采用香草醛-鹽酸法對(duì)火龍果酵素中原花青素含量進(jìn)行測(cè)定，考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、香草醛質(zhì)量濃度對(duì)溶液吸光度值的影響，并確定火龍果酵素中原花青素含量測(cè)定的方法。結(jié)果表明，原花青素含量的最適檢測(cè)條件為1 mL火龍果酵素稀釋液，5 mL 5 g/100 mL的香草醛甲醇溶液，4 mL 10%鹽酸甲醇溶液，混勻后，35℃條件下顯色反應(yīng)20 min，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度值。精密度和重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值分別為1.23%和1.47%；平均回收率為99.5%～104.4%，RSD值為1.21%～2.11%。表明該法操作簡(jiǎn)便，精密度和重現(xiàn)性良好，準(zhǔn)確性高，適用于火龍果酵素中原花青素含量的測(cè)定。

火龍果酵素；原花青素；香草醛鹽酸法；測(cè)定

原花青素（proantho cyanidins）屬于單聚體多酚物質(zhì)[1]，廣泛存在于植物的花、果實(shí)、根莖中，常被用作功能性成分添加到保健品中[2]。據(jù)研究，這種類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)是國(guó)際公認(rèn)的天然植物抗氧化劑[3]，其作用大，用途廣。醫(yī)學(xué)上，原花青素用來(lái)促進(jìn)血液循環(huán)、保護(hù)視力，甚至能改善夜盲癥患者的視力[4]；與維生素C結(jié)合后有利于降低膽固醇含量[5]；對(duì)皮膚病患者有抗過(guò)敏、滋潤(rùn)呵護(hù)的作用[6-7]。

火龍果（Hylocereus undulatusBritt）屬于仙人掌科量天尺屬植物，是一種富含維生素和水溶性膳食纖維的亞熱帶低能量多肉水果[8-9]。火龍果酵素是以火龍果為主要原料發(fā)酵而成的營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵液，是一類(lèi)具有生物催化活性的物質(zhì)總稱(chēng)，含天然植物發(fā)酵后的營(yíng)養(yǎng)元素、益生菌等活性成分，其中豐富的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），脂肪酶、維生素等對(duì)人體機(jī)能修復(fù)、保健作用十分重要[10]。國(guó)內(nèi)火龍果酵素工藝日趨成熟，塑形減肥產(chǎn)品、增強(qiáng)免疫保健產(chǎn)品等均為熱門(mén)市售酵素產(chǎn)品[11]。由于原花青素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及測(cè)試方法的多樣性，國(guó)內(nèi)外并沒(méi)有制定統(tǒng)一的對(duì)酵素產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)定量的檢測(cè)方法[12]。目前原花青素含量測(cè)試方法主要有正丁醇-鹽酸法、香草醛法、鐵鹽催化法、Folin-Ciocaheau與高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）結(jié)合法、高鐵鹽-鐵氰化鉀分光光度法等。正丁醇-鹽酸法應(yīng)用較多，但易受酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，使測(cè)定結(jié)果偏低[13]；鐵鹽催化法操作簡(jiǎn)便，特征明顯，但是對(duì)反應(yīng)體系中的含水量和鐵離子濃度要求比較嚴(yán)格，因此重現(xiàn)性差[14]；Folin-Ciocaheau與HPLC結(jié)合法結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，但得到的是原花青素的相對(duì)含量，不能作為定量分析的方法[15]；高鐵鹽-鐵氰化鉀分光光度法是在鐵鹽催化反應(yīng)的基礎(chǔ)上確定原花青素含量與吸光度的關(guān)系，測(cè)試結(jié)果易受雜質(zhì)的影響[16]。香草醛法操作方式較多，差別較大[17]。

本實(shí)驗(yàn)為探索香草醛-鹽酸法檢測(cè)火龍果酵素中原花青素含量的最佳測(cè)試條件，考察了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、香草醛質(zhì)量濃度等對(duì)火龍果酵素中原花青素的影響，并確定適合火龍果酵素中原花青素含量的檢測(cè)條件，以期為進(jìn)一步測(cè)定保健飲品中原花青素含量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火龍果酵素原液：實(shí)驗(yàn)室自制；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、香草醛、甲醇、乙醇、鹽酸（均為分析純）：天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.5%）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；3K15高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；手提式壓力蒸汽滅菌器：上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 火龍果酵素溶液的制備

取1 mL火龍果酵素原液5 000 r/min離心5 min，取上清液以蒸餾水稀釋30倍，稀釋后的酵素溶液備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的選擇及檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的兒茶素和原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，準(zhǔn)確吸取1 mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液（或原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液）至試管中，分別加入5 mL 5 g/100 mL香草醛甲醇溶液，4 mL 10%鹽酸甲醇溶液，并于刻度試管中搖勻，于35℃水浴中反應(yīng)20 min，以甲醇為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)350～750 nm范圍進(jìn)行全波段掃描，并確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取1.0mg/mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.05mL、0.10mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.45 mL、0.50 mL于刻度試管中，以甲醇定容至1 mL，配制成質(zhì)量濃度分別為0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2mg/mL、0.25mg/mL、0.3mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL、0.45mg/mL、0.50mg/mL的系列梯度溶液，搖勻后加入5 mL 5g/100mL香草醛甲醇溶液，4mL10%鹽酸甲醇溶液，混勻，以甲醇為空白對(duì)照，35℃恒溫反應(yīng)20 min后于波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度值，以?xún)翰杷貥?biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中原花青素含量。

1.3.4 火龍果酵素與香草醛—鹽酸反應(yīng)的影響因素

反應(yīng)溫度的影響：取1mL火龍果酵素稀釋液于試管中，加入5 mL 5 g/100 mL香草醛甲醇溶液，4 mL 10%鹽酸甲醇溶液，搖勻，以甲醇為空白對(duì)照，分別在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下反應(yīng)20 min，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度值?？疾旆磻?yīng)溫度對(duì)火龍果酵素與香草醛—鹽酸反應(yīng)后溶液吸光度值的影響[18]。

香草醛質(zhì)量濃度的影響：當(dāng)香草醛甲醇溶液質(zhì)量濃度分別為1 g/100 mL、2 g/100 mL、3 g/100 mL、4 g/100 mL、5 g/100 mL、6 g/100 mL時(shí)，考察香草醛質(zhì)量濃度對(duì)火龍果酵素與香草醛—鹽酸反應(yīng)后溶液吸光度值的影響。

反應(yīng)時(shí)間的影響：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min時(shí)，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)火龍果酵素與香草醛—鹽酸反應(yīng)后溶液吸光度值的影響。

1.3.5 測(cè)定方法的評(píng)價(jià)[19-21]

通過(guò)精密度、重復(fù)性、加標(biāo)回收率試驗(yàn)，判斷所建立的火龍果酵素中原花青素檢測(cè)方法是否穩(wěn)定、可靠和準(zhǔn)確。回收率計(jì)算公式如下：

式中：A為樣品所含被測(cè)成分的質(zhì)量濃度，mg/mL；B為加入

標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度，mg/mL；C為實(shí)測(cè)值，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的選擇及最大吸收波長(zhǎng)的確定

兒茶素和原花青素標(biāo)準(zhǔn)品在波長(zhǎng)350～750 nm范圍進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 兒茶素及原花青素標(biāo)準(zhǔn)品紫外掃描圖Fig.1 UV scanning graph of catechin and proanthocyanidins standard substance

由圖1可知，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品和原花青素標(biāo)準(zhǔn)品顯色反應(yīng)后，溶液的最大吸收波長(zhǎng)均為500 nm，以?xún)翰杷貫闃?biāo)準(zhǔn)品時(shí)，吸光度值比原花青素標(biāo)準(zhǔn)品高很多，靈敏度也高，且經(jīng)濟(jì)成本較低，故選擇兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品較為合適，且測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為500 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按照1.3.3實(shí)驗(yàn)步驟，以?xún)翰杷貥?biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)500nm（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=2.034 3X+ 0.046 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3，結(jié)果表明在0.1～0.45 mg/mL范圍內(nèi)，兒茶素質(zhì)量濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

圖2 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of catechin

2.3 火龍果酵素與香草醛—鹽酸反應(yīng)的影響因素

2.3.1 反應(yīng)溫度的影響

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)原花青素吸光度值的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on absorbance value of proanthocyanidins

由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，火龍果酵素與香草醛顯色反應(yīng)溶液的吸光度值呈先增加后減小的趨勢(shì)，溫度的升高使香草醛—鹽酸與火龍果酵素稀釋液中原花青素顯色反應(yīng)強(qiáng)烈，吸光度值變高，當(dāng)反應(yīng)溫度為35℃時(shí)，反應(yīng)溶液吸光度值達(dá)到最大；當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)35℃后，吸光度值快速減小，因此確定最適宜反應(yīng)溫度為35℃。

2.3.2 香草醛質(zhì)量濃度的影響

圖4 香草醛質(zhì)量濃度對(duì)原花青素吸光度值的影響Fig.4 Effect of vanillin concentration on absorbance value of proanthocyanidins

由圖4可知，隨著香草醛質(zhì)量濃度的增加，吸光度值先迅速增加后趨于平緩，當(dāng)香草醛質(zhì)量濃度為5 g/100 mL時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，繼續(xù)增加香草醛質(zhì)量濃度，吸光度值變化不大，為避免香草醛濃度過(guò)高而引起自身縮合發(fā)生變色的情況，最佳香草醛質(zhì)量濃度采用5 g/100 mL。

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)原花青素吸光度值的影響Fig.5 Effect of reaction time on absorbance value of proanthocyanidins

由圖5可知，吸光度值隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增后減，當(dāng)反應(yīng)20 min時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，反應(yīng)20 min后，光照及顯色反應(yīng)過(guò)程中香草醛自身縮合引起吸光度值不斷減小，最終趨于平緩。此時(shí)香草醛和火龍果中原花青素的顯色得到充分反應(yīng)，因此，確定最佳反應(yīng)時(shí)間為20 min。

2.4 測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

2.4.1 精密度試驗(yàn)

精確吸取1 mL火龍果酵素稀釋液，按照優(yōu)化后的測(cè)定方法，平行測(cè)定6次，計(jì)算原花青素的質(zhì)量濃度及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，檢測(cè)結(jié)果RSD值為1.23%，表明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision tests

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

為驗(yàn)證方法的重現(xiàn)性，精密吸取1 mL火龍果酵素稀釋液6份，此測(cè)定由不同測(cè)試人員在同一臺(tái)儀器上完成，按照優(yōu)化后測(cè)定方法，測(cè)定火龍果酵素中原花青素的吸光度值，計(jì)算原花青素的質(zhì)量濃度，結(jié)果如表2所示。由表2可知，重復(fù)測(cè)定6次檢測(cè)結(jié)果的RSD值為1.47%，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

表2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of reproducibility tests

2.4.3 回收率試驗(yàn)

取火龍果酵素稀釋溶液1mL，加入質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL、2.5 mg/mL、3.7 mg/mL的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后測(cè)定方法，測(cè)定火龍果酵素中原花青素的吸光度值，計(jì)算原花青素的含量，每組試驗(yàn)平行測(cè)定6次，并計(jì)算其回收率，結(jié)果如表3所示。由表3可知，原花青素的平均回收率為99.5%～104.4%，RSD為1.21%～2.11%。表明該方法準(zhǔn)確度高，符合檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，可用于火龍果酵素中原花青素的檢測(cè)。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery rate tests

2.5 火龍果酵素中原花青素含量的測(cè)定

表4 不同火龍果酵素樣品中原花青素含量的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of proanthocyanidins content in different pitaya enzyme

由表4可知，市售5種不同的火龍果酵素中原花青素含量有所差異，其中廣州康瀅生物科技有限公司生產(chǎn)的火龍果酵素產(chǎn)品中原花青素含量最高，為3.42 mg/mL。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用香草醛-鹽酸法建立火龍果酵素中原花青素含量的測(cè)定方法，同時(shí)考察了反應(yīng)溫度、時(shí)間、香草醛質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)溶液吸光度值的影響，最終確定適合火龍果酵素中原花青素含量測(cè)定的方法。結(jié)果表明，香草醛-鹽酸法測(cè)定火龍果酵素中原花青素含量的最適條件為：1 mL火龍果酵素溶液，5mL5g/100mL的香草醛甲醇溶液，4mL 10%鹽酸甲醇溶液，混勻后35℃條件下顯色反應(yīng)20 min后在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)得吸光度值。在此條件下，該法操作簡(jiǎn)便，精密度和重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果的RSD值分別為1.23%和1.47%，平均回收率為99.5%～104.4%，RSD為1.21%～2.11%，表明該法具有較好的精密度、重現(xiàn)性，且回收率較高，適用于火龍果酵素中原花青素含量的測(cè)定。為火龍果酵素中原花青素含量提供有效的檢測(cè)方法。

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Establishment of determination method of proanthocyanidins content in pitaya enzyme

ZHU Manli1,GUO Huiming1,SUN Hongtao2,LI Wei2,HONG Housheng2,3*
(1.College of Chemistry and Molecular Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China; 2.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China; 3.Nanjing Highke Biotechnology Equipment Co.,Ltd.,Nanjing 210009,China)

The content of proanthocyanidins in pitaya enzyme was determined by vanillin-HCl method.The effects of reaction temperature,time and vanilline content on solution absorbance values were investigated,and the determination method of proanthocyanidins content in pitaya enzyme was established.The results showed that the optimum detection conditions were pitaya enzyme dilute solution 1 ml,5 g/100 ml vanillin methanol solution 5 ml,10%HCl methanol solution 4 ml,after blending,the reaction was carried out at 35℃for coloration 20 min and then absorbance value was detected at the wavelength of 500 nm.The relative standard deviation(RSD)of precision and reproducibility tests results were 1.23%and 1.47%, respectively.The average recovery rate 99.5%-104.4%,RSD was 1.21%-2.11%,which indicated that the method was easy and simple,and had good precision and reproducibility and high accuracy,and was suitable for the determination of proanthocyanidins content in pitaya enzyme.

pitaya enzyme;proanthocyanidins;vanillin-HCl method;determination

TS261.7；TS218；TQ920

0254-5071（2017）04-0184-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.038

2016-12-19

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’（2012AA021201）

朱曼利（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楦纳颇c胃中藥酵素的制備工藝及其功能特性。

*通訊作者：洪厚勝（1965-），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯镞^(guò)程裝備。