陶文靖

自然界中廣泛存在著各種微生物，這些微生物在食品生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)中都可能會(huì)對(duì)食品造成污染。陶老師是微生物控制領(lǐng)域具有深厚影響力的學(xué)者，為了更加深入的了解微生物快速檢測(cè)方法，陶老師整理了關(guān)于食品中的微生物快速檢測(cè)的一些問題，并就這些問題一一作出了解答。

1 如何定義食品中微生物快速

檢測(cè)方法？

食品快速檢測(cè)的廣泛定義是簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的分析方法，能夠?qū)μ幚砗玫臉悠吩诤芏痰臅r(shí)間內(nèi)檢測(cè)出結(jié)果。如今，大部分理化項(xiàng)目快速檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)在幾小時(shí)甚至幾分鐘內(nèi)檢測(cè)出結(jié)果。

快速檢測(cè)方法具有如下一個(gè)或者幾個(gè)特點(diǎn)：

（1）檢測(cè)時(shí)間比標(biāo)準(zhǔn)方法短；

（2）操作簡(jiǎn)單，流程簡(jiǎn)單，判斷明確；

（3）靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確；

（4）實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

但是，對(duì)于食品中微生物檢測(cè)而言，必須經(jīng)歷培養(yǎng)、增菌等階段，無法實(shí)現(xiàn)在1～2個(gè)小時(shí)內(nèi)出結(jié)果。

2 食品中微生物快速檢測(cè)方法

具備的特點(diǎn)？

食品中微生物快速檢測(cè)方法具有如下一個(gè)或者幾個(gè)特點(diǎn)：

（1）操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，檢測(cè)時(shí)間短；

（2）靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更為精確；

（3）自動(dòng)化程度高，減少人為參與，降低人工成本；

（4）對(duì)檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)依賴程度低，操作簡(jiǎn)單，易于標(biāo)準(zhǔn)化；

（5）產(chǎn)品更小、更輕、更便攜，更適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

3 目前常用的食品微生物快速

檢測(cè)方法有哪些？

常用的食品微生物快速檢測(cè)技術(shù)從大類上主要有：傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良方法，免疫學(xué)方法，分子生物學(xué)方法。

（1）傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良方法是在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的計(jì)數(shù)方法，克服傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、誤差大等缺點(diǎn)，包括培養(yǎng)基改良法、濾膜法、紙片法。

（2）免疫方法是以抗原抗體的特異反應(yīng)為基礎(chǔ)，利用不同微生物特異抗原激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異抗體，從其特異性檢測(cè)相應(yīng)的致病微生物。常用的免疫學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)、上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)和乳膠凝集法等。

（3）分子生物學(xué)方法，其中PCR技術(shù)是應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)方法，主要應(yīng)用為普通PCR，熒光定量PCR和等溫?cái)U(kuò)增等。

除以上常見快檢方法外，近些年發(fā)展的飛行時(shí)間質(zhì)譜、微流控技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、新一代測(cè)序技術(shù)等新興技術(shù)也正在或?qū)⒁獞?yīng)用于食源性致病微生物的快速檢測(cè)。

4 幾種食品微生物快速檢測(cè)

方法的差異主要有哪些？

改良的計(jì)數(shù)方法，克服傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、誤差大等缺點(diǎn)，操作接近國標(biāo)方法，目前使用最廣泛，可定量，可定性。免疫學(xué)方法優(yōu)勢(shì)是特異性高，操作時(shí)間短、檢測(cè)結(jié)果可靠，適合批量檢測(cè)和自動(dòng)化檢測(cè)（VIDAS），劣勢(shì)是高質(zhì)量抗體獲得困難、產(chǎn)品開發(fā)周期長(zhǎng)、檢測(cè)靈敏度受靶標(biāo)蛋白的影響大。分子學(xué)方法優(yōu)勢(shì)是靶標(biāo)明確，操作時(shí)間短、檢測(cè)結(jié)果可靠，但核酸提取效率和系統(tǒng)穩(wěn)定性是一大挑戰(zhàn)。

5 如何評(píng)價(jià)一個(gè)食品微生物

快速檢測(cè)體系？

食品中的微生物尤其是致病菌具有檢出率高但是含量低的特點(diǎn)，故檢測(cè)方法的靈敏度和限量要求之間有著很大的差異。因此，一個(gè)好的檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)該包括一個(gè)好的增菌培養(yǎng)方法和一個(gè)好的檢測(cè)方法，二者要綜合起來一起評(píng)價(jià)。一個(gè)好的增菌培養(yǎng)方法要滿足以下條件：微生物的復(fù)蘇能力要強(qiáng)，生長(zhǎng)速度要快，選擇性要好，產(chǎn)量要高；而一個(gè)好的檢測(cè)方法需要具備速度快、準(zhǔn)確度高，結(jié)果準(zhǔn)確明晰等特點(diǎn)。

6 目前有國家標(biāo)準(zhǔn)的食品微生

物快速檢測(cè)方法有哪些？

從GB 4789中可以看出，顯色培養(yǎng)基、微生物鑒定系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用，沙門氏菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、副溶血弧菌可采用全自動(dòng)微生物檢測(cè)鑒定系統(tǒng)，除此之外，還有以下方法也被國標(biāo)應(yīng)用：

（1）GB 4789.6-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)中提到，取生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落進(jìn)行PCR確認(rèn)試驗(yàn)。

（2）GB 4789.10-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)中關(guān)于金葡腸毒素檢測(cè)，可用A、B、C、D、E型金黃色葡萄球菌腸毒素分型酶聯(lián)免疫吸附試劑盒完成。

（3）GB 4789.12-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗(yàn)毒素基因檢測(cè)采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。

（4）GB 4789.36-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn)，可用免疫磁珠捕獲法檢測(cè)，此外，毒力基因檢測(cè)采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。

（5）GB 4789.42-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)諾如病毒檢驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

（6）GB 14934-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)消毒餐（飲）具可采用餐具大腸菌群紙片法進(jìn)行檢測(cè)。

7 國外微生物快速檢測(cè)方法的

應(yīng)用情況如何？

目前，就技術(shù)應(yīng)用而言，歐盟使用傳統(tǒng)方法和快速方法的比例各占50%；美國主要以快速方法（包括基于免疫學(xué)技術(shù)的側(cè)向?qū)游鲈嚰埡虴LISA試劑盒）和分子生物學(xué)方法（如PCR）為主，我國仍沿用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，這已經(jīng)難以滿足食品安全監(jiān)管及企業(yè)/行業(yè)對(duì)檢驗(yàn)時(shí)效性的需求。

8 目前大部分快速檢測(cè)方法

沒有標(biāo)準(zhǔn)，企業(yè)可以用嗎？

國家標(biāo)準(zhǔn)方法是不可替代的，在產(chǎn)品出廠檢測(cè)、政府執(zhí)法、第三方出具報(bào)告等方面必須采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測(cè)。目前微生物的國標(biāo)檢測(cè)方法普遍為培養(yǎng)法，因此在談到微生物檢測(cè)的國標(biāo)時(shí)，通常指的是培養(yǎng)法，但是隨著技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的新技術(shù)及其方法將進(jìn)入國家標(biāo)準(zhǔn)。

在企業(yè)質(zhì)量?jī)?nèi)控，如：原輔料檢測(cè)、生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)測(cè)、過程產(chǎn)品監(jiān)測(cè)等歡迎都可以采用快速檢測(cè)方法，但前提是，所選的方法/產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)室必須要跟國標(biāo)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性就行測(cè)試后方可采用。

9 企業(yè)如何選擇適合自己的

微生物快速檢測(cè)方法？

沒有最好的方法，只有最適合的方法，企業(yè)在選擇快速檢測(cè)方法時(shí)要從產(chǎn)品、檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)量、預(yù)算等多個(gè)方面進(jìn)行考慮。選擇快速檢測(cè)產(chǎn)品時(shí)，要從產(chǎn)品的準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、操作便捷、成本等方面考慮。

（1）檢測(cè)樣品決定選用方法。檢測(cè)方法均具有一定的適用范圍，例如，諾如病毒的ELISA試劑盒適用范圍為糞便，如果制定為檢測(cè)蔬菜的行標(biāo)就不合適；在沙門氏菌檢驗(yàn)中低菌量樣品可以一步增菌。

（2）檢測(cè)項(xiàng)目決定選用方法。例如：定量檢測(cè)的項(xiàng)目，采用測(cè)試片、顯色培養(yǎng)基等方面；致瀉性大腸桿菌，采用PCR方法檢驗(yàn)；金葡腸毒素，采用免疫方法檢測(cè)。

（3）樣品數(shù)量。樣品數(shù)量大、建議采用免疫學(xué)方法，例如ELISA。

（4）實(shí)驗(yàn)室預(yù)算。預(yù)算少，可以采用不需要儀器紙片法、免疫學(xué)方法，預(yù)算多，可選用全自動(dòng)微生物檢測(cè)鑒定儀、PCR等。

10 企業(yè)如何通過實(shí)驗(yàn)判定某個(gè)

微生物快速檢測(cè)產(chǎn)品是否符

合需求？

首先，判定標(biāo)準(zhǔn)要從準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、操作是否方便等方面進(jìn)行測(cè)試。其次，實(shí)驗(yàn)又分定量實(shí)驗(yàn)和定性試驗(yàn)兩種。定量實(shí)驗(yàn)，跟國標(biāo)方法比對(duì)準(zhǔn)確率和使用便捷性，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)菌實(shí)驗(yàn)和樣品實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行計(jì)數(shù)比對(duì)，交叉反應(yīng)比對(duì)，判定生長(zhǎng)率、特異性及穩(wěn)定性。定性試驗(yàn)，主要是致病菌檢測(cè)，比度假陽性/陰性率及使用便捷性，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)菌實(shí)驗(yàn)和樣品添加實(shí)驗(yàn)，來判斷產(chǎn)品的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。此外，從驗(yàn)證頻率上，建議每半年進(jìn)行一次比對(duì)驗(yàn)證，確定產(chǎn)品的穩(wěn)定性；同時(shí)，建議同類產(chǎn)品選擇兩個(gè)以上品牌產(chǎn)品進(jìn)行使用。

11 熒光定量PCR、等溫PCR、

普通PCR的區(qū)別？

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，并對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。普通PCR是借助DNA電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。等溫PCR又稱環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能在等溫（60～65℃）條件下，短時(shí)間（通常是一小時(shí)內(nèi)）內(nèi)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，是一種“簡(jiǎn)便、快速、精確、低價(jià)”的基因擴(kuò)增方法（具體區(qū)別見表1）。

12 食品中致病菌快速檢測(cè)是否

需要前增菌？是否必須增菌？

食品中致病菌檢測(cè)是否需要增菌要從檢測(cè)要求來看，定量檢測(cè)的如金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌等，可以均質(zhì)后直接進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于不得檢出的致病菌必須進(jìn)行增菌。國標(biāo)對(duì)食品檢測(cè)樣本的要求：1CFU/25g，25g樣品中不允許1CFU，樣品前處理后，1CFU/25g+ 225mL，培養(yǎng)基=0.004CFU/mL。再看幾種檢測(cè)方法的靈敏度：培養(yǎng)方法靈敏度均在103以上，免疫方法靈敏度均在105以上，PCR方法靈敏度也要求在102以上。食品樣本相對(duì)很干凈，不增菌，是無法到達(dá)檢測(cè)靈敏度的。

13 目前提高食品中致病菌增菌

效率的方法有哪些？

增菌是檢測(cè)的前提，增菌效果如何，關(guān)系到靈敏度，對(duì)檢測(cè)至關(guān)重要。如國標(biāo)方法，沙門氏菌增菌需要至少兩天的時(shí)間，增菌時(shí)間長(zhǎng)，主要是菌體的復(fù)蘇、生長(zhǎng)和選擇性的問題。目前主要的增菌富集技術(shù)有：

（1）改良培養(yǎng)基成分和增菌方式，通過改良培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)溫度，讓菌體可以快速復(fù)式、生長(zhǎng)，提高選擇性，可以在24小時(shí)之內(nèi)完成兩步增菌。

（2）免疫磁珠富集，磁珠上的抗體與相應(yīng)的目標(biāo)致病菌的抗原物質(zhì)結(jié)合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，而達(dá)到分離、濃縮、純化目標(biāo)致病菌的目的。

（3）噬菌體技術(shù)，利用噬菌體的專一性，通過噬菌體裂解殺死干擾菌，從而是目標(biāo)菌株實(shí)現(xiàn)快速的增殖。例如，在沙門氏菌的增菌過程中，通過噬菌體特異性的裂解干擾的大腸桿菌，從而實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的快速、高濃度增殖。

（4）膜過濾和層析技術(shù)，過濾法富集微生物是將適當(dāng)孔徑的濾膜放入濾器，過濾樣品。由于濾膜的作用而將微生物滯留在膜表面，使微生物與樣品溶液分開，達(dá)到微生物富集目的。