林嬋春++何冬梅++李佳穗++柳敏++嚴(yán)鑄云

摘要：為了了解川芎內(nèi)生放線菌抑制常見致病菌的能力，從中篩選活性較強(qiáng)的放線菌資源，采用紙片擴(kuò)散法測定發(fā)酵提取液對5種指示菌的抑菌活性，結(jié)合經(jīng)典分類法和分子生物學(xué)法鑒定活性菌種。結(jié)果表明，對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）和白色念球菌（Canidia albicans）表現(xiàn)抑制活性的菌株占川芎內(nèi)生放線菌的百分比分別為83.33%、76.67%、23.33%、3000%、13.33%；從中選出4株活性較強(qiáng)的放線菌，Blast比對結(jié)果表明，菌株F3、F19、F-L-5、F-L-7的16S rDNA序列與GenBank已知序列鏈霉菌屬金色類群[Streptomyces sp.（KF126314.1）]、暗灰鏈霉菌[Streptomyces canus（AB7184118.1）]、腫痂鏈霉菌[Streptomyces turgidiscabies（FJ883749.1）]、暗色產(chǎn)色鏈霉菌[Streptomyces phaeochromogenes（KP718589.1）]高度相似，同源性分別為99%、100%、99%、99%。綜合鑒定，F(xiàn)3為鏈霉菌屬金色類群，F(xiàn)19為暗灰鏈霉菌，F(xiàn)-L-5為腫痂鏈霉菌，F(xiàn)-L-7為暗色產(chǎn)色鏈霉菌。表明川芎內(nèi)生放線菌中具有應(yīng)用潛力的高活性菌株，并鑒定出4株活性菌。

關(guān)鍵詞：川芎；內(nèi)生放線菌；抑菌活性；菌種鑒定；鏈霉菌

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）03-0076-04

收稿日期：2016-07-17[HJ1.4mm]

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81001610）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（編號：20135132110004）；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金（編號：ZRQN1546）。

作者簡介：林嬋春（1989—），女，碩士研究生，主要從事藥用植物微生態(tài)研究。E-mail：1297107706@qq.com。

通信作者：嚴(yán)鑄云，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事道地藥材品質(zhì)形成與調(diào)控研究。Tel：（028）61800231；E-mail：cdutcmyan@126.com。[HJ]

放線菌是尋找和發(fā)現(xiàn)天然活性物質(zhì)的生物資源之一，也是人們不懈研究的熱點(diǎn)[1]。目前，發(fā)現(xiàn)新放線菌及新活性物質(zhì)變得越來越困難，人們開始從特殊生境中尋找有用的放線菌[2]。植物內(nèi)生放線菌生長環(huán)境獨(dú)特，常產(chǎn)生多種類型的代謝產(chǎn)物[3]。筆者所在課題組前期篩選出了對川芎根腐病病原菌有拮抗活性的川芎內(nèi)生放線菌[4]。本研究選取代表性細(xì)菌及真菌作為指示菌，篩選具有抑菌作用的放線菌資源，為開發(fā)利用植物內(nèi)生放線菌提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種川芎內(nèi)生放線菌由課題組從健康川芎根莖中進(jìn)一步分離并保存。

1.1.2指示菌[5-6]革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）；革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；酵母狀真菌：白色念球菌（Canidia albicans）；絲狀真菌：黑曲霉（Aspergillus niger）。以上菌株均由成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院贈予。

1.1.3培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基采用高氏1號液體培養(yǎng)基。形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化測定所用培養(yǎng)基的成分和制備方法均參考《鏈霉菌鑒定手冊》[6]和《放線菌系統(tǒng)學(xué)》[7]?；罨囵B(yǎng)細(xì)菌、黑曲霉及白色念球菌的培養(yǎng)基分別采用肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基，成分和制備方法參照文獻(xiàn)[8-9]。

1.2方法

1.2.1[JP2]發(fā)酵粗提液的制備將供試菌株在高氏1號培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)5 d，接種1枚直徑5 mm的菌餅于250 mL發(fā)酵瓶中，每瓶發(fā)酵液50 mL。28 ℃、2 000 r/min搖瓶培養(yǎng)，6 d后取出發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min，取上清液，等體積乙酸乙酯萃取2次，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得漿狀物2～3 mL，35 ℃下?lián)]發(fā)干，最后用無水乙醇定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，保存?zhèn)溆肹10]。[JP]

1.2.2抑菌活性測定采用紙片法[10]測定內(nèi)生放線菌發(fā)酵液的抑菌活性，即將60 μL發(fā)酵粗提液分次加到9 mm無菌濾紙片上，待乙醇揮發(fā)干后接于含指示菌的平板上。細(xì)菌用5 mg/mL 的雙抗溶液10 μL為對照（CK1），真菌用5 mg/mL氟康唑溶液20 μL為對照（CK2），設(shè)3組重復(fù)，24～48 h后測量抑菌圈的直徑，以平均抑菌圈直徑大小作為抑菌活性強(qiáng)弱的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3形態(tài)及生理生化特征菌株的形態(tài)特征采用插片法在光學(xué)顯微鏡下觀察。培養(yǎng)特征及生理生化特性采用常規(guī)放線菌鑒定方法，并參照文獻(xiàn)[11]及《鏈霉菌鑒定手冊》[6]中推薦的培養(yǎng)基。

1.2.4分子水平鑒定采用高氏1號液體富集培養(yǎng)方式，獲取菌絲，用液氮充分研磨破壁后，結(jié)合試劑盒TIANamp Bacteria DNA Kit（TIANGEN）提取基因組DNA[12]。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)DNA提取效果。采用放線菌通用引物27F和1 492R對放線菌的16S rDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板2 μL，10 pmol/μL上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix[天根生化科技（北京）有限公司]12 μL，ddH2O[天根生化科技（北京）有限公司]10 μL，參照文獻(xiàn)[12]中的程序擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。將測定的序列進(jìn)行Blast比對，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載同源性極高的序列，采用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1川芎內(nèi)生放線菌的活性菌株

通過紙片法考察了30株川芎內(nèi)生放線菌的抑菌活性（表1）。結(jié)果表明，不同內(nèi)生放線菌對5種致病菌分別表現(xiàn)出不同的抑制活性。有83.33%的內(nèi)生放線菌對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)抑制活性，有76.67%的內(nèi)生放線菌對枯草芽孢桿菌表現(xiàn)抑制活性，而對大腸桿菌、黑曲霉和白色念球菌表現(xiàn)抑制活性的內(nèi)生放線菌比例較低，分別為23.33%、30.00%、1667%。其中有3株放線菌對5種指示菌有抑制作用，有1株放線菌對4種指示菌有抑制作用。

對照組（CK1）對3種細(xì)菌的平均抑菌直徑均在13～14 mm 范圍內(nèi)，抑菌圈內(nèi)清晰。F3、F19、F-L-5和F-L-7對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯，前3株菌的平均抑菌直徑大于13 mm，活性與CK1相仿。這4株菌均對大腸桿菌表現(xiàn)出抑制活性。對照組（CK2）對黑曲霉和白色念球菌的抑菌作用不明顯，平均抑菌直徑小于10.9 mm，且抑菌圈邊緣模糊。F19和F-L-7對黑曲霉表現(xiàn)出抑制活性，平均抑菌直徑為11.0～11.9 mm。F19和F-L-5對白色念球菌的平均抑菌直徑在12 mm以上，抑菌圈較CK2清晰。F3和F-L-7對白色念球菌及F3和F-L-5對黑曲霉無抑菌作用。擬將此4株菌作為具有應(yīng)用潛力的高活性菌株，并進(jìn)行菌種鑒定。

2.2川芎內(nèi)生放線菌活性菌株的形態(tài)特征

將4株具有抑菌活性的菌株進(jìn)行插片培養(yǎng)后，鏡檢菌絲、孢子鏈、孢子形態(tài)（圖1）。F3孢子絲直、斷裂、孢子單個(gè)或成對；F19孢子絲多圈松螺旋形，孢子卵圓形或球形；F-L-5 孢子鏈呈直或柔曲狀，孢子橢圓或球形；F-L-7孢子絲直或柔曲，孢子球形或長橢圓。在不同培養(yǎng)基上各菌株表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征，詳細(xì)結(jié)果見表2。

2.3川芎內(nèi)生放線菌活性菌株的生理生化特征

測試4株活性菌對9種碳源——阿拉伯糖（L-arabinose）、棉籽糖（raffinose）、甘露醇（D-mannit01）、木糖（D-xylose）、果糖（D-fructose）、鼠李糖（rhanmose）、葡萄糖（D-glucose）、[JP2]蔗糖（sucrose）、肌醇（meso-inositol）的利用情況，結(jié)果見表3?？疾炝?株活性菌的明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、纖維素上生長及H2S生成等一系列生理生化指標(biāo)（表4）?？梢钥闯鯢3能使牛奶胨化，呈淡黃色，能液化明膠，不能水解淀粉與纖維素，不產(chǎn)生H2S。

F19不能使牛奶凝固、胨化，能液化明膠，能水解淀粉，不能水解纖維素，不產(chǎn)生H2S。F-L-5 產(chǎn)酸使牛奶凝固、變紅、后胨化，能水解淀粉，不能水解纖維素，不產(chǎn)H2S。F-L-7能使牛奶凝固，變淡黃色，能水解淀粉，不能在纖維素上生長，能產(chǎn)H2S，使培養(yǎng)基呈類黑色。

2.416S rDNA序列測定及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用試劑盒法提取活性放線菌 F3、F19、F-L-5及F-L-7 的基因組DNA，利用16S rDNA 通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度為1 300～1 500 bp的清晰[JP3]條帶（圖2）。經(jīng)測序獲得長度分別為1 373、1 364、1 308、1 379 bp[JP]的序列，GenBank登錄號分別為KU975441、KU975442、KU975443、KU975444。將所測序列與GenBank中已知序列進(jìn)行Blast比對，F(xiàn)3與鏈霉菌屬金色類群[Streptomyces sp. （KP126314.1）]及[Streptomycesroseogriseus（2DQ02665.1）]相似度為99%，F(xiàn)19與暗灰鏈霉菌[Streptomyces canus（AB7184118.1）]相似度為100%，F(xiàn)-L-5與腫痂鏈霉菌[Streptomyces turgidiscabies（FJ883749.1）]相似度為99%，F(xiàn)-L-7與暗色產(chǎn)色鏈霉菌[Streptomyces phaeochromogenes（KP718589.1）]相似度為99%。用MEGA5.1軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。由圖3可知，F(xiàn)3在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與鏈霉菌屬相近，這與形態(tài)特征相符，但與高相似度的種存在一定的差異，而且單獨(dú)聚為1 支，故暫定為鏈霉菌屬金色類群，其具體分類地位有待進(jìn)一步確定。F19與暗灰鏈霉菌在自舉值99%水平聚為1支；F-L-5與腫痂鏈霉菌在自舉值98%水平聚為1支，F(xiàn)-L-7與暗色產(chǎn)色鏈霉菌在自舉值98%水平聚為1支。結(jié)合菌株的形態(tài)及生理生化特征，確定F19為暗灰鏈霉菌，F(xiàn)-L-5為腫痂鏈霉菌，F(xiàn)-L-7 為暗色產(chǎn)色鏈霉菌。

3結(jié)論與討論

[JP2]川芎內(nèi)生放線菌的抑菌活性考察結(jié)果表明，主要抑制對象為革蘭氏陽性菌，而抑制革蘭氏陰性菌及真菌的作用較弱。從中選出了4株具有應(yīng)用潛力的高活性菌株，菌種鑒定結(jié)果：鏈霉菌F3初步[JP]鑒定為鏈霉菌屬的金色類群；確定F19為暗灰[JP]鏈霉菌，F(xiàn)-L-5為腫痂鏈霉菌，F(xiàn)-L-7為暗色產(chǎn)色鏈霉菌。

暗色產(chǎn)色鏈霉菌和暗灰鏈霉菌均能產(chǎn)生多種抗生素及酶[13-16]，使暗色產(chǎn)色鏈霉菌和暗灰鏈霉菌具有重要的研發(fā)價(jià)值。腫痂鏈霉菌被報(bào)道為馬鈴薯瘡痂病的致病菌之一[17]，而滕青杉報(bào)道其能產(chǎn)生肉桂酰胺[18]。川芎內(nèi)生菌腫痂鏈霉菌具有抑菌活性，其是否對川芎致病及能否產(chǎn)生肉桂酰胺類物質(zhì)有待后續(xù)研究。

目前，尚未見有關(guān)川芎內(nèi)生放線菌的研究，僅筆者所在課題組將分離自川芎的內(nèi)生放線菌作為川芎根腐病生防菌的擬開發(fā)對象[4]。本試驗(yàn)首次開展川芎內(nèi)生放線菌的抑菌活性研究，可以為開發(fā)新的抗生素提供放線菌資源。然而其最優(yōu)發(fā)酵條件、抑菌機(jī)制及活性成分等均有待進(jìn)一步研究，期望在抗菌化合物方面開發(fā)具有應(yīng)用前景的產(chǎn)品。

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