章諾貝，陳 新

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院:1.消化科;2.核醫(yī)學(xué)科 330006)

論著·基礎(chǔ)研究

O-GlcNAc糖基化修飾和Akt1對(duì)胃癌細(xì)胞體外增殖及侵襲力的影響

章諾貝1，陳 新2△

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院:1.消化科;2.核醫(yī)學(xué)科 330006)

目的 探討O-連接N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)糖基化修飾對(duì)胃癌細(xì)胞體外增殖及侵襲力的影響，并評(píng)價(jià)Akt1在O-GlcNAc糖基化促進(jìn)胃癌細(xì)胞體外增殖及侵襲過程中的作用。方法 通過使O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(OGT)過表達(dá)(過表達(dá)OGT組)或沉默表達(dá)(沉默OGT組)及使用O-GlcNAc水解酶(OGA)特異性抑制劑Thiamet-G(抑制劑組)下調(diào)O-GlcNAc水解酶活性(抑制劑組)等構(gòu)建O-GlcNAc糖基化水平升高或降低的細(xì)胞模型；采用MTT法檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞增殖活力；軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)觀察各組胃癌細(xì)胞集落形成；Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)各組胃癌細(xì)胞體外遷移和侵襲能力；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞Akt1活性；Thiamet-G處理Akt1表達(dá)沉默(沉默Akt1組)的胃癌細(xì)胞以評(píng)價(jià)Akt1在O-GlcNAc糖基化促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲中的作用；利用Thiamet-G處理Akt1過表達(dá)(過表達(dá)Akt1組)的胃癌細(xì)胞以進(jìn)一步驗(yàn)證Akt1在O-GlcNAc糖基化調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲性過程中的作用。結(jié)果 O-GlcNAc糖基化水平升高可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并顯著提高細(xì)胞集落形成、體外遷移和侵襲的能力；Akt1活性被由O-GlcNAc糖基化水平升高所介導(dǎo)的Ser473磷酸化上調(diào)而激活；Thiamet-G誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲性被Akt1 shRNA所抑制；Akt1高表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)由Thiamet-G誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)。結(jié)論 O-GlcNAc糖基化可部分通過Akt1途徑增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的體外增殖及侵襲力。

胃腫瘤；腫瘤侵潤；細(xì)胞增殖；O-GlcNAc糖基化；Akt1

O-連接N-乙酰氨基葡萄糖(O-Linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc)糖基化是細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基以O(shè)-GlcNAc修飾的一種高豐度可逆性翻譯后修飾方式，它被認(rèn)為能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能及活性[1]。調(diào)控O-GlcNAc轉(zhuǎn)換的酶只有兩種：催化靶標(biāo)蛋白分子添加GlcNAc基團(tuán)的O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)和去除蛋白質(zhì)分子中糖基的O-GlcNAc水解酶(O-GlcNAcase，OGA)。O-GlcNAc糖基化廣泛參與多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程，如轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等[1]。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族通過參與多個(gè)信號(hào)通路從而調(diào)控細(xì)胞功能。PI3K活化產(chǎn)生的脂質(zhì)產(chǎn)物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4)P2]和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3]作為第2信使結(jié)合并激活細(xì)胞內(nèi)的靶蛋白，形成信號(hào)級(jí)聯(lián)復(fù)合物，最終調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、生存和遷移[2]。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K的下游分子。Akt至少有3個(gè)家族成員：Akt1、Akt2和Akt3，每個(gè)成員均在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中發(fā)揮各自的作用。PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[2]。

胃癌是最常見的癌癥之一，也是癌癥相關(guān)性死亡的最常見原因之一。在過去的幾十年中，其發(fā)病率、診斷方法和治療手段均已發(fā)生了重要變化，但胃癌患者的預(yù)后仍然很差，尤其是在發(fā)病晚期[3]。因此，有必要進(jìn)一步探討與胃癌惡性程度相關(guān)的潛在機(jī)制。

為了確定O-GlcNAc糖基化是否參與調(diào)控胃癌的進(jìn)展，筆者利用使胃癌細(xì)胞的OGT過表達(dá)、OGA抑制或OGT表達(dá)沉默等策略來改變O-GlcNAc糖基化水平，并對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等與惡性表型相關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)功能進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株AGS(ATCC CRL-1739TM，美國)，人胃癌細(xì)胞株SGC-7901(凱基生物技術(shù)有限公司，江蘇南京)，Phoenix2TM-Ampho包裝細(xì)胞(Allele生物技術(shù)公司，美國)。

1.1.2 試劑 10%胎牛血清(Wisent公司，加拿大)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，F(xiàn)uGENE 6、蛋白酶抑制劑混合物Flag標(biāo)記的人核/質(zhì)OGT(ncOGT)表達(dá)載體pCMV-Flag-OGT(Sigma公司，美國)，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、遺傳霉素(Invitrogen公司，美國)，攜帶豆蔻酰化HA-標(biāo)記Akt1(MAH)的pLNCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Addgene公司，美國)，聚凝胺、Immobilon-P膜(Millipore公司，美國)，PUGNAc(研究化學(xué)用品公司，加拿大)，細(xì)胞裂解緩沖液(P0013，碧云天生物技術(shù)公司，江蘇)，O-GlcNAc單克隆抗體(RL2，親和生物試劑公司，美國)，Akt1單抗、磷酸化-Akt1單抗(細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司，美國)，OGT多克隆抗體α、GAPDH多抗(圣克魯斯公司，美國)，RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(國際Fermentas公司，立陶宛)，Transwell小室(6.5 mm，Corning公司，美國)，基質(zhì)膠(1 mg/mL；BD生物科學(xué)公司，美國)，總RNA提取試劑盒(A&A生物技術(shù)公司，波蘭)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒(Amersham生物科學(xué)公司，英格蘭)，蛋白A磁珠(通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，美國)。

1.1.3 儀器 TaqMan?基因表達(dá)分析系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國)，Rainbow酶標(biāo)儀(Tecan公司，奧地利)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 人胃癌細(xì)胞株AGS和SGC-7901在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞都在飽和濕度的37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞用5 μmol/L的Thiamet-G處理48 h或指定時(shí)間用于蛋白免疫印跡法(Western blot)或計(jì)數(shù)并傳代用于侵襲性試驗(yàn)。

1.2.2 OGT或Akt1過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建 Flag標(biāo)記的人ncOGT表達(dá)載體pCMV-Flag-OGT，用于構(gòu)建 OGT過表達(dá)細(xì)胞株(過表達(dá)OGT組)。使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000按照制造商的說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。攜帶豆蔻?；疕A-標(biāo)記Akt1(MAH)的pLNCX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于豆蔻?；疕A-標(biāo)記Akt1過表達(dá)細(xì)胞株(過表達(dá)Akt1組)的構(gòu)建。Phoenix2TM-Ampho包裝細(xì)胞被用作病毒載體。選用FuGENE 6作為MAH細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑。胃癌細(xì)胞用含10 μg/mL聚凝胺的Phoenix2TM-Ampho包裝細(xì)胞的過濾培養(yǎng)基(病毒上清液)感染3次。選用遺傳霉素作為MAH細(xì)胞的選擇劑。

1.2.3 OGT或Akt1組RNA干擾細(xì)胞株的構(gòu)建 將以人OGT mRNA編碼序列為靶標(biāo)的小干擾RNA(siRNA)用于抑制AGS和SGC-7901細(xì)胞中OGT的表達(dá)(沉默OGT組)。shOGT靶向序列是5′-GGA TGC TTA TAT CAA TTT AGG-3′。用一段shRNA寡核苷酸作為對(duì)照，靶向序列為:5′-ACG TGA CAC GTT CGG AGA ATT-3′。設(shè)計(jì)靶向人Akt1 mRNA序列編碼區(qū)的siRNA并用于抑制AGS和SGC-7901細(xì)胞中Akt1的表達(dá)。靶向序列：干擾Akt1-1，5′-GCT ACT TCC TCC TCA AGA ACG-3′；干擾Akt1-2，5′-GGA CGG GCA CAT CAA GAT AAC-3′；對(duì)照為5′-ACG TGA CAC GTT CGG AGA ATT-3′。將合成的寡核苷酸退火并克隆到AgeⅠ/EcoRⅠ雙酶切的pLKO.1-puro慢病毒載體?；赑LKO.1-puro載體的慢病毒通過將△8.2和VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞包裝生成。被感染的細(xì)胞用8 μg/mL的嘌呤霉素選擇2周。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) 用總RNA提取試劑盒按照制造商的說明書提取細(xì)胞總RNA。取1 μg細(xì)胞總RNA使用RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNAs。使用TaqMan?基因表達(dá)分析系統(tǒng)按照制造商的說明書進(jìn)行cDNA實(shí)時(shí)擴(kuò)增。采用熒光FAM標(biāo)記的探針及編碼Akt1和內(nèi)參 GAPDH基因的序列特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)GAPDH表達(dá)水平歸一化的Akt1表達(dá)的倍數(shù)差異用公式2△△Ct進(jìn)行計(jì)算。siRNA處理細(xì)胞的mRNA相對(duì)量以未經(jīng)處理細(xì)胞mRNA量的百分比表示。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 用噻唑藍(lán)(MTT)染料轉(zhuǎn)化來評(píng)估細(xì)胞增殖。按1×104/孔將細(xì)胞接種至96孔板。讓細(xì)胞生長24或48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL的PBS溶液)。在37 ℃經(jīng)過4 h的孵育后，加入200 μL二甲基亞砜裂解細(xì)胞。使用Rainbow酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm吸光度(A)值。

1.2.6 集落形成能力試驗(yàn) 將細(xì)胞5×103重懸于1 mL的頂層瓊脂培養(yǎng)基(添加0.4%瓊脂的細(xì)胞培養(yǎng)基)。然后將細(xì)胞懸液覆蓋到6孔板中1.5 mL底層瓊脂培養(yǎng)基 (添加0.8%瓊脂的細(xì)胞培養(yǎng)基)上，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。每4天向板中加入新鮮的培養(yǎng)基用作飼養(yǎng)層。2周后，在40倍光鏡下選擇6個(gè)視野進(jìn)行集落計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn) 細(xì)胞遷移試驗(yàn)用帶8 μm微孔膜的Transwell小室完成。將小室插入Transwell儀器。進(jìn)行細(xì)胞侵襲試驗(yàn)時(shí)，將小室用基質(zhì)膠包被。下室用600 μL含或不含OGA抑制劑的細(xì)胞條件培養(yǎng)液填充。將細(xì)胞5×104用100 μL含1%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后置于有或無OGA抑制劑的上室。20 h后，在100倍光鏡下選取6個(gè)視野，對(duì)碳酸酯膜底面上出現(xiàn)結(jié)晶紫染色的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。侵襲試驗(yàn)中的孵化時(shí)間延長至24 h。

1.2.8 Western blot分析 用含有蛋白酶抑制劑混合物和5 μmmol/L PUGNAc(一種OGA抑制劑)的細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞后獲取細(xì)胞總蛋白，用于Western blot分析和免疫沉淀。蛋白質(zhì)樣品(50 μg)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在還原態(tài)下進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至Immobilon-P膜。檢測(cè)用抗體有：O-GlcNAc單克隆抗體，Akt1單抗，磷酸化-Akt1單抗(Ser473)，HA-標(biāo)記單抗，OGT多克隆抗體和GAPDH多抗；用ECL檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。在免疫沉淀中，細(xì)胞裂解產(chǎn)物與特異性抗體和蛋白A磁珠在4 ℃輕柔混合3 h。免疫沉淀物用裂解緩沖液清洗，用SDS樣品緩沖液洗脫，之后用SDS-PAGE分離。檢測(cè)磷酸化Akt1時(shí)，細(xì)胞裂解物中的Akt1蛋白用Akt1抗體免疫沉淀。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌細(xì)胞株的O-GlcNAc糖基化水平被升高或降低 為了探討O-GlcNAc糖基化是否對(duì)胃癌惡性程度具有重要的作用，以過表達(dá)OGT或抑制OGA(5 μmmol/L Thiamet-G處理，抑制劑組)來提高胃癌細(xì)胞株AGS和SGC-7901的O-GlcNAc糖基化水平，并通過沉默OGT表達(dá)來降低O-GlcNAc糖基化水平。(1)與未經(jīng)任何處理的AGS和SGC-7901細(xì)胞(對(duì)照組)相比，過表達(dá)OGT組與經(jīng)Thiamet-G處理(抑制劑組)，在24 h后，O-GlcNAc糖基化水平有效升高。(2)與對(duì)照組相比，感染CGT siRNA的沉默OGT組AGS和SGC-7901細(xì)胞中OGT蛋白表達(dá)和O-GlcNAc糖基化水平均顯著降低，見圖1。

A：AGS細(xì)胞;B:SGC-7901。

圖1 OGT過表達(dá)和OGA受抑制或沉默

OGT表達(dá)O-GlcNAc修飾水平降低

2.2 O-GlcNAc糖基化促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖活力 各組細(xì)胞相應(yīng)處理24 h和48 h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，處理24 h的胃癌細(xì)胞株AGS和SGC-7901的增殖率受O-GlcNAc糖基化的影響并不明顯。然而，48 h后與對(duì)照組細(xì)胞相比，過表達(dá)OGT組、抑制劑組AGS和SGC-7901細(xì)胞株增殖率分別增加約45%、22%和44%、27%。相反，沉默OGT組兩種細(xì)胞的增殖率分別降低約34%和25%，見圖2。

2.3 O-GlcNAc糖基化增強(qiáng)胃癌細(xì)胞集落形成能力 軟瓊脂集落試驗(yàn)表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，兩種細(xì)胞中抑制劑組細(xì)胞集落形成能力增加；同時(shí)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，沉默OGT組細(xì)胞集落形成能力降低，見圖3。

A：AGS細(xì)胞;B:SGC-7901細(xì)胞;a:P<0.05；b:P<0.01，與對(duì)照組比較。

圖2 O-GlcNAc修飾可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖

2.4 O-GlcNAc糖基化促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移 遷移試驗(yàn)顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，過表達(dá)OGT組和抑制劑組細(xì)胞遷移能力增加，而沉默OGT組細(xì)胞的遷移能力明顯抑制，見圖4。

2.5 O-GlcNAc糖基化增強(qiáng)胃癌細(xì)胞侵襲性 O-GlcNAc糖基化在胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用也通過24 h體外侵襲試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，過表達(dá)OGT和抑制劑組的侵襲性增強(qiáng)，相反，沉默OGT組細(xì)胞侵襲性明顯受抑制，見圖5。

a:P<0.01，與對(duì)照組比較。

圖3 O-GlcNAc糖基化可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞集落形成能力

a:P<0.01，與對(duì)照組比較。

圖4 O-GlcNAc糖基化可促進(jìn)胃癌細(xì)胞體外遷移

a:P<0.01，與對(duì)照組比較。

圖5 O-GlcNAc糖基化可促進(jìn)胃癌細(xì)胞體外侵襲性

2.6 上調(diào)O-GlcNAc糖基化會(huì)提高Akt1 Ser473位點(diǎn)磷酸化水平 與對(duì)照組細(xì)胞相比，抑制劑組細(xì)胞Akt1 Ser473位點(diǎn)磷酸化水平增加(AGS:t=2.764，P=0.031；SGC-7901：t=2.586,P=0.027)，沉默OGT組細(xì)胞的Ser473位點(diǎn)磷酸化水平降低(AGS:t=2.694，P=0.029；SGC-7901：t=2.766,P=0.027)，見圖6。

A：AGS細(xì)胞;B:SGC-7901細(xì)胞。

圖6 O-GlcNAc糖基化對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲性

的調(diào)控與PI3K/Akt1信號(hào)通路有關(guān)

2.7 胃癌細(xì)胞中Akt1蛋白的沉默 為了評(píng)價(jià)Akt1在O-GlcNAc糖基化調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲性中的作用，本研究用兩個(gè)siRNA (干擾Akt1-1和干擾Alt1-2)下調(diào)AGS和SGC-7901細(xì)胞株中Akt1的表達(dá)水平。對(duì)照細(xì)胞則轉(zhuǎn)染非沉默亂序RNA(Ctrl組)。用實(shí)時(shí)RT-PCR和Western blot分析評(píng)估RNAi的沉默效果。兩個(gè)siRNA均可明顯降低Akt1 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平(圖7)。然而，與siAkt1-1比較，siAkt1-2在降低Akt1水平上更為有效，因此其被選擇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(沉默Akt1組)。

A：Akt1 mRNA分析圖；B：Akt1 Western blot圖。

圖7 siRNA沉默胃癌細(xì)胞Akt1基因的表達(dá)

2.8 Akt1沉默可阻斷O-GlcNAc糖基化對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲性的促進(jìn)作用 Akt1表達(dá)沉默的AGS細(xì)胞株用5 μmol/L Thiamet-G處理以評(píng)估Akt1對(duì)O-GlcNAc糖基化增強(qiáng)胃癌細(xì)胞侵襲性的影響。結(jié)果表明，Akt1表達(dá)沉默可顯著減弱由Thiamet-G處理所誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲性，但其侵襲性仍然高于僅轉(zhuǎn)染Akt1 shRNA的細(xì)胞。換言之，Thiamet-G能恢復(fù)Akt1表達(dá)沉默胃癌細(xì)胞的侵襲性，但仍相對(duì)低于僅被Thiamet-G處理的細(xì)胞而又相對(duì)高于對(duì)照組細(xì)胞(圖8C、D)。Western blot分析(圖8B)結(jié)果顯示了Akt1蛋白水平及其 Ser473位點(diǎn)磷酸化水平。在SGC-7901細(xì)胞株也得到了類似結(jié)果(圖8B)。

2.9 Akt信號(hào)通路激活可增強(qiáng)O-GlcNAc糖基化對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲性作用 為進(jìn)一步驗(yàn)證Akt1在O-GlcNAc糖基化調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲性過程中的作用，筆者向AGS和SGC-7901細(xì)胞株轉(zhuǎn)染攜帶HA-標(biāo)記豆蔻酰化Akt1(MAH組)的表達(dá)載體。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，MAH組細(xì)胞株顯示出高水平的Akt1表達(dá)(圖9A)。將MAH細(xì)胞用5 μmol/L Thiamet-G處理后檢測(cè)其侵襲性，結(jié)果表明，Akt1過表達(dá)可進(jìn)一步增強(qiáng)由Thiamet-G所誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲性(圖9B)，此結(jié)果進(jìn)一步支持了上述關(guān)于Akt1與O-GlcNAc糖基化一齊促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲性相關(guān)的結(jié)論。

A：AGS細(xì)胞侵襲性試驗(yàn)分析圖；B：AGS細(xì)胞Western blot；C:Western blot分析圖；a:P<0.05,b:P<0.01。

圖8 沉默Akt1基因表達(dá)可阻遏O-GlcNAc糖基化對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲性的促進(jìn)作用

A：Western blot；B：Western blot分析圖。a：P<0.05,b：P<0.01。

圖9 促進(jìn)Akt1基因表達(dá)可增強(qiáng)O-GlcNAc糖基化對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲性的促進(jìn)作用

3 討 論

胃癌在最常見惡性腫瘤類型中排第4位，而且是最常見的癌癥死亡原因之一。盡管早期胃癌的臨床治療已經(jīng)取得了重大成效，但晚期胃癌患者的長期存活率仍然相當(dāng)有限。晚期或轉(zhuǎn)移性胃癌的5年生存率是僅為5%～20%，中位生存期少于1年[4]。因此，調(diào)控胃癌發(fā)生、發(fā)展的確切分子機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

研究發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc糖基化在多種人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。許多原癌基因和抑癌基因如c-Fos、c-Jun、c-Myc、pRB和p53均被 O-GlcNAc修飾[5]。Gu等[6]發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc和OGT蛋白表達(dá)水平在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系中顯著升高；此外，Mi等[7]也指出，乳腺腫瘤組織中O-GlcNAc表達(dá)水平明顯高于與之配對(duì)的相鄰組織。以上研究結(jié)果提示，高O-GlcNAc糖基化水平可能參與乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另外，還有報(bào)道指出，O-GlcNAc與胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌惡性程度的調(diào)控相關(guān)[8-10]。綜上所述，O-GlcNAc糖基化對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。

然而，O-GlcNAc糖基化同胃癌的關(guān)系目前尚不清楚。在本研究中，筆者分析了O-GlcNAc糖基化在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。本研究結(jié)果表明，O-GlcNAc糖基化通過促進(jìn)體外細(xì)胞增殖、錨定非依賴性生長、遷移和侵襲進(jìn)而增強(qiáng)胃癌惡性程度。不過，胃癌細(xì)胞的增殖在O-GlcNAc糖基化水平升高或降低處理24 h并未受到顯著影響(圖2)，而細(xì)胞的遷移能力和侵襲性在O-GlcNAc糖基化升高或降低處理24 h卻均被促進(jìn)或抑制，這提示細(xì)胞遷移能力和侵襲性受O-GlcNAc糖基化的調(diào)控可能并不依賴于其對(duì)細(xì)胞活力的影響。而在處理48 h后，O-GlcNAc糖基化則表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。這些結(jié)果提示，O-GlcNAc糖基化水平升高可能會(huì)啟動(dòng)和促進(jìn)胃癌的形成和轉(zhuǎn)移。并且，一系列有關(guān)O-GlcNAc糖基化在腫瘤發(fā)展中作用的研究均支持了本研究結(jié)果[5-11]。

作為一種應(yīng)激傳感器，O-GlcNAc糖基化水平在受不同應(yīng)激作用的多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞株中出現(xiàn)迅速且動(dòng)態(tài)性升高，細(xì)胞借此重建其代謝和信號(hào)途徑以促進(jìn)生存[12]。腫瘤細(xì)胞的異常代謝或生長由多種形式的刺激和應(yīng)激作用引起，它們包括活性氧、細(xì)胞外基質(zhì)成分、基底膜、營養(yǎng)缺乏、缺氧和免疫系統(tǒng)攻擊。O-GlcNAc糖基化可通過增強(qiáng)FOXO4轉(zhuǎn)錄活性從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[13]。此外，通過降低OGT表達(dá)水平或阻斷己糖胺生物合成途徑(hexosamine biosynthetic pathway,HBP)來降低 O-GlcNAc糖基化能夠使細(xì)胞對(duì)凋亡刺激更加敏感[12]。因此，O-GlcNAc糖基化水平升高也可能有利于胃癌細(xì)胞抵抗凋亡刺激，從而加速腫瘤的形成和發(fā)展。

PI3K/Akt信號(hào)通路可通過多種途徑傳遞侵襲和轉(zhuǎn)移信號(hào)并且還參與多種因素介導(dǎo)的腫瘤血管生成過程。PI3K通過與E-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白及血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2)相互作用從而參與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)，進(jìn)而激活PI3K/Akt通路；此外，VEGFR-2和αVβ3復(fù)合體也可通過PI3K依賴信號(hào)通路介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和遷移[14]；PI3K/Akt還能夠通過促進(jìn)由腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移從而調(diào)節(jié)腫瘤血管生成[15]。有報(bào)道指出，O-GlcNAc糖基化的上調(diào)會(huì)通過增加Akt1活性從而促進(jìn)甲狀腺未分化癌細(xì)胞的增殖[16]。本研究發(fā)現(xiàn)O-GlcNAc糖基化能提高胃癌細(xì)胞的侵襲性。Akt1表達(dá)沉默可減弱由Thiamet-G所誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲性，但其侵襲性仍然僅高于Akt1表達(dá)沉默的細(xì)胞(圖8A、C)。此外，Akt1過表達(dá)還能夠增強(qiáng)由Thiamet-G所誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲性。以上結(jié)果提示，O-GlcNAc糖基化可部分經(jīng)Akt1調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞侵襲性，不過，還可能有其他信號(hào)通路或蛋白質(zhì)參與該調(diào)控過程。細(xì)胞表面E-鈣黏蛋白的減少和細(xì)胞黏附的減弱可能是 O-GlcNAc糖基化誘導(dǎo)乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制[7]。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白-人肌動(dòng)蛋白素(cofilin)在OGT的作用下發(fā)生O-GlcNAc糖基化，并在由OGT調(diào)控的細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮關(guān)鍵的介導(dǎo)作用[17]。在乳腺癌細(xì)胞三維細(xì)胞侵襲過程中，cofilin的Ser-108位點(diǎn)的O-GlcNAc糖基化是其正確定位于乳腺癌細(xì)胞前緣侵襲性偽足的必要條件[17]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，O-GlcNAc糖基化的靶標(biāo)蛋白和O-GlcNAc調(diào)節(jié)的信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[8-11]。因此，有必要進(jìn)一步深入研究以更好地理解由 O-GlcNAc糖基化誘導(dǎo)的胃癌侵襲的潛在機(jī)制。此外，Akt至少包括3個(gè)家族成員:Akt1、Akt2和Akt3，每個(gè)成員在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中均發(fā)揮各自作用。除Akt1外，其他Akt家族成員的活性變化對(duì)O-GlcNAc糖基化調(diào)控細(xì)胞惡性的影響仍有待闡明。

總之，本研究提供的以上證據(jù)表明，O-GlcNAc糖基化能夠影響胃癌的惡性程度。顯然，理解異常O-GlcNAc糖基化與腫瘤生物學(xué)行為之間的明確關(guān)系必將有利于癌癥的診斷和治療。

[1]Hart GW,Housley MP,Slawson C.Cycling of O-linked beta-N-acetylglucosamine on nucleocytoplasmic proteins[J].Nature,2007,446(7139):1017-1022.

[2]Arboleda MJ,Lyons JF,Kabbinavar FF,et al.Overexpression of AKT2/protein kinase B beta leads to up-regulation of beta 1 integrins,increased invasion,and metastasis of human breast and ovarian cancer cells[J].Cancer Res,2003,63(1):196-206.

[3]Herrero R,Park JY,Forman D.The fight against gastric cancer-the IARC Working Group report[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol,2014,28(6):1107-1114.

[4]Kamangar F,Dores GM,Anderson WF.Patterns of cancer incidence,mortality,and prevalence across five continents:defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world[J].J Clin Oncol,2006,24(14):2137-2150.

[5]Kamemura K,Hayes BK,Comer FI,et al.Dynamic interplay between O-glycosylation and O-phosphorylation of nucleocytoplasmic proteins:alternative glycosylation/phosphorylation of THR-58,a known mutational hot spot of c-Myc in lymphomas,is regulated by mitogens[J].J Biol Chem,2002,277(21):19229-19235.

[6]Gu Y,Mi W,Ge Y,et al.GlcNAcylation plays an essential role in breast cancer metastasis[J].Cancer Res,2010,70(15):6344-6351.

[7]Mi W,Gu Y,Han C,et al.O-GlcNAcylation is a novel regulator of lung and colon cancer malignancy[J].Biochim Biophys Acta,2011,1812(4):514-519.

[8]Banerjee S,Sangwan V,McGinn O,et al.Triptolide-induced cell death in pancreatic cancer is mediated by O-GlcNAc modification of transcription factor Sp1[J].J Biol Chem,2013，288(47):33927-33938.

[9]Kamigaito T,Okaneya T,Kawakubo M,et al.Overexpression of O-GlcNAc by prostate cancer cells is significantly associated with poor prognosis of patients[J].Prostate Cancer Prostatic Dis,2014，17(1):18-22.

[10]de Queiroz RM,Madan R,Chien J,et al.Changes in O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) homeostasis activate the p53 pathway in ovarian cancer cells[J].J Biol Chem,2016，291(36):18897-18914.

[11]Ma Z,Vosseller K.Cancer metabolism and elevated O-GlcNAc in oncogenic signaling[J].J Biol Chem,2014,289(50):34457-34465.

[12]Sohn KC,Lee KY,Park JE,et al.OGT functions as a catalytic chaperone under heat stress response:a unique defense role of OGT in hyperthermia[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,322(3):1045-1051.

[13]HoSR,WangK,WhisenhuntTR,etal.O-GlcNAcylationenhancesFOXO4transcriptionalregu-lation in response to stress[J].FEBS Lett,2010,584(1):49-54.

[14]Tan PH,Xue SA,Manunta M,et al.Effect of vectors on human endothelial cell signal transduction:implications for cardiovascular gene therapy[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(3):462-467.

[15]Zhang R,Xu Y,Ekman N,et al.Etk/Bmx transactivates vascular endothelial growth factor 2 and recruits phosphatidylinositol 3-kinase to mediate the tumor necrosis factor-induced angiogenic pathway[J].J Biol Chem,2003,278(51):51267-51276.

[16]Krzeslak A,Jó?wiak P,Lipińska A.Down-regulation of β-N-acetyl-D-glucosaminidase increases Akt1 activity in thyroid anaplastic cancer cells[J].Oncol Rep,2011,26(3):743-749.

[17]Huang X,Pan Q,Sun D,et al.O-GlcNAcylation of cofilin promotes breast cancer cell invasion[J].J Biol Chem,2013,288(51):36418-36425.

Effects of O-GlcNAcylation modification and Akt1 on proliferation and invasion of gastric cancer cells

ZhangNuobei1，ChenXin2△

(1.DepartmentofGastroenterology;2.DepartmentofNuclearMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To study the influence of O-GlcNAcylation on on proliferation and invasion of gastric cancer cells and evaluate the role of Akt1 on O-GlcNAcylation promotting cells proliferation and invasion in gastric cancer.Methods Build the cell model:O-GlcNAc glycosylation levels rise or fall.The cell viability was determine by MTT.To investigate whether O-GlcNAcylation affected colony formation ability of gastric cancer cells,soft agar colony assays were carried out.Cell migration or invasion was using transwell chambers.The expression of Akt1 was detected through Western blot.Thiamet-G was used to eualuate the role of Akt1 on O-Gcnac cylation regulating invasion in gastric Cancei.Results O-GlcNAcylation was increased the gastric cancer cells proliferation ability,colony formation ability,migration and invasion ability in vitro.Akt1 was activated by Ser473 phosphorylation upregulation though O-GlcNAcylation.Akt1 shRNA was inhibition the cell invasive which induced by Thiamet-G.Akt1 overexpression was promoted by Thiamet-G-induced cell invasion.Conclusion O-GlcNAcylation enhanced oncogenic phenotypes possibly partially involving Akt1.

stomach neoplasms;neoplasm invasiveness;cell proliferation;O-GlcNAcylation;Akt1

章諾貝(1982-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事消化系腫瘤基因治療研究。△

，E-mail:13870979404@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.007

R735.7

A

1671-8348(2017)08-1027-05

2016-10-22

2016-12-20)