劉嘉琳，鄭 芳，龍 彥，佟 柳，鄭 媛，劉小青，秦 川

1河北大學醫(yī)學部病理教研室，河北保定 0710002保定市第一中心醫(yī)院老年病科，河北保定 0710003中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021

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·論 著·

腦組織特異表達hS100B轉基因小鼠帕金森樣運動協(xié)調(diào)能力改變的初步分析

劉嘉琳1，鄭 芳2，龍 彥2，佟 柳2，鄭 媛2，劉小青2，秦 川3

1河北大學醫(yī)學部病理教研室，河北保定 0710002保定市第一中心醫(yī)院老年病科，河北保定 0710003中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021

目的 研究S100B在帕金森病發(fā)病機制中的作用并探討腦組織特異表達hS100B轉基因小鼠作為帕金森病模型小鼠的可能性。方法 構建hS100B轉基因小鼠。小鼠分為S100B轉基因組、基因敲除組和陰性對照組。爬桿法和轉棒法檢測運動協(xié)調(diào)能力；逆轉錄-PCR、Western blot對腦組織中S100B、多巴胺D1、D2受體，G蛋白偶聯(lián)受體激酶2、5及酪氨酸羥化酶的表達進行測定；高效液相色譜-熒光法檢測腦組織中酪氨酸、左旋多巴、多巴胺及高香草酸的含量。結果 與陰性對照組相比，轉基因組小鼠腦組織中S100B蛋白顯著升高(P<0.05)，3月齡時可表現(xiàn)出運動協(xié)調(diào)能力下降，且隨著月齡增加，運動協(xié)調(diào)能力下降呈明顯的進行性降低(P<0.05)；腦組織中多巴胺D2受體、G蛋白偶聯(lián)受體激酶2 mRNA和蛋白表達降低(P<0.05)；左旋多巴、多巴胺、高香草酸生成增多，高香草酸/多巴胺比值升高(P<0.05)；酪氨酸羥化酶的表達雖呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。S100B基因敲除小鼠腦組織中無S100B蛋白表達，與陰性對照組相比，各檢測指標無異常(P>0.05)。結論 S100B很可能是參與帕金森病行為學異常的重要蛋白，腦組織特異表達hS100B轉基因小鼠的建立為研究該基因在帕金森病中的作用提供了工具。

S100B；帕金森??；多巴胺受體；G蛋白偶聯(lián)受體激酶；多巴胺

ActaAcadMedSin，2017,39(2)：240-246

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的老年變性疾病，臨床主要表現(xiàn)為震顫、肌強直、運動減少、姿勢及步態(tài)不穩(wěn)等，晚期出現(xiàn)癡呆和抑郁。目前，PD確切的發(fā)病機制還不是十分清楚，對其進行較為深入的研究和探討具有重要的意義。鈣結合蛋白S100B被認為是腦內(nèi)特異蛋白，生理量的S100B蛋白主要由星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、可塑性及損傷修復都是必不可少的，但在各種原因的腦損傷中，反應性的星形膠質(zhì)細胞增殖與活化，產(chǎn)生大量的S100B蛋白，高濃度的S100B蛋白對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用，通過引起鈣超載、升高NO濃度、導致神經(jīng)纖維纏結、促進小膠質(zhì)細胞的遷移及激活等途徑誘導細胞凋亡[1]。在缺血性腦血管病、顱腦外傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、唐氏綜合征、阿爾茨海默病等疾病中均發(fā)現(xiàn)S100B表達升高[2]。S100B可通過受損的血腦屏障進入血液，因此，升高的血清S100B蛋白可作為臨床上腦損傷的標志。目前，在PD患者血清及1-甲基- 4-苯基- 1，2，3，6-四氫吡啶誘導的PD小鼠模型腦組織中均發(fā)現(xiàn)了S100B含量的升高，其表達與疾病的嚴重程度呈正比[3- 4]，筆者在α-synuclein A53T轉基因小鼠PD模型中發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織中S100B蛋白顯著升高[5]，提示S100B的過表達可能參與了PD的發(fā)生發(fā)展，但具體分子機制方面的研究，目前國內(nèi)外鮮見報道。本研究在構建腦組織特異表達hS100B轉基因小鼠模型的基礎上，結合S100B基因敲除小鼠模型，檢測S100B在小鼠腦組織過表達和不表達的情況下，小鼠的運動協(xié)調(diào)能力、與運動協(xié)調(diào)能力有關的基底節(jié)神經(jīng)環(huán)路中多巴胺D1受體(dopamine D1 receptor，D1DR)、多巴胺D2受體(dopamine D2 receptor，D2DR)、受體相關調(diào)控蛋白G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase，GRK)2、GRK5的表達以及多巴胺生成代謝途徑中酪氨酸(tyrosine，Tyr)、左旋多巴(levodopa，L-DOPA)、多巴胺(dopamine，DA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量變化，進一步探討S100B在PD發(fā)生發(fā)展中的作用。

材料和方法

實驗動物 腦組織特異表達hS100B轉基因小鼠本課題組前期已經(jīng)成功構建及鑒定[5](批準號：GC- 08- 2014)，S100B基因敲除小鼠購自日本RIKEN BRC公司(BRC- 00804)，野生型C57BL/6J小鼠由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所資源中心提供，合格證號SYXK(京)2007- 0002。將F1代轉基因小鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，S100B基因敲除小鼠雌雄交配，提取后代鼠尾DNA，PCR法進行基因型鑒定，篩選陽性小鼠進行下一步實驗。小鼠分為轉基因組、基因敲除組及陰性對照組，每組14只，雄性，安靜環(huán)境飼養(yǎng)，自由取食飲水，12 h晝夜節(jié)律。

試劑與儀器 Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、PCR引物(Invitrogen，美國)，蛋白裂解液RIPA (碧云天公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 抗體、Tyr、L-DOPA、DA、HVA對照品(Sigma，美國)，色譜純乙腈(Tedia，美國)，BCATMProtein Assay Kit (Pierce，美國)，兔抗D1DR多克隆抗體(sc- 14001)、兔抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)多克隆抗體(sc- 14007)購自美國Santa Cruz公司，兔抗S100B單克隆抗體(ab52642)，兔抗D2DR多克隆抗體(ab76967)、兔抗GRK2多克隆抗體(ab137666)、兔抗GRK5多克隆抗體(ab64943)購自英國Abcam公司。電泳儀(Bio-Rad，美國)，半干電轉儀(北京君意東方電泳設備有限公司)，PCR儀(Effendorf公司，德國)，紫外分光光度計(Amersham，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(Tiannon)，轉棒儀(KN- 75，日本)，Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent，美國)，組織勻漿機(Fisher Scientific，美國)，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18 (250×4.6 mm I.D.，5 μm)，預柱為Agilent Zorbax Extend C18(10×4.6 mm I.D.，5 μm)。

小鼠行為學檢測 3組小鼠在3、6和9月齡時進行行為學檢測。爬桿法：所用工具為直徑13 mm、高760 mm的光滑不銹鋼桿，垂直豎立，將小鼠頭向下放置在金屬桿的頂部，使其沿桿自然爬下，觀察動物在下行過程中的行為，進行計分，評分標準如下：5分：四肢并用，一步一步協(xié)調(diào)向下爬行；4分：一步一步協(xié)調(diào)向下爬行，但兼有后肢滑行行為；3分：爬過一半距離后向下滑行，但可抱緊金屬桿；2分：未爬過一半距離即出現(xiàn)滑行行為；1分：爬過一半距離后不能抓桿，從桿上掉落；0分：未爬過一半距離即不能抓桿，從桿上掉落。每只小鼠測定3次，每次間隔30 min，計算平均分。轉棒法：實驗前，每只小鼠訓練5 min，使其能夠在轉棒儀上停留，隨后休息2 min開始實驗，轉速為24 r/min，以300 s作為實驗終止時間。每只小鼠測試5次，取平均值。

逆轉錄-PCR 每組小鼠隨機選取8只，脫頸處死，去除小腦后，將一半腦組織迅速放入1 ml預冷的Trizol中冰上研磨。按Trizol試劑盒的說明要求，提取總RNA，并用DNA酶處理總RNA，瓊脂糖凝膠電泳確定RNA未降解，紫外分光光度計測定濃度。使用逆轉錄試劑盒，將RNA反轉錄為cDNA，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因的表達。目的基因檢測所用引物見表1。

Western blot 將另一半腦組織加入RIPA裂解液，提取總蛋白，BCA法測定濃度，取等量蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后將蛋白電轉至聚偏二氟乙烯膜上。膜先在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，加入一抗(D1DR 1∶200；S100B 1∶1000；D2DR、GRK2、GRK5、TH為1∶500稀釋)，4℃雜交過夜。將膜轉移到辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體中(1∶10 000稀釋)，室溫雜交1 h。將膜置于化學發(fā)光液中，曝光、顯影及定影。

表 1 目的基因檢測所用引物

GAPDH：甘油醛- 3-磷酸脫氫酶；D1DR：多巴胺D1受體；D2DR：多巴胺D2受體；GRK：G蛋白偶聯(lián)受體激酶

GAPDH：glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase；D1DR：dopamine D1 receptor；D2DR：dopamine D2 receptor；GRK：G protein-coupled receptor kinase

高效液相色譜熒光法 將每組剩余的6只小鼠脫頸處死后，在冰盤上迅速分離中腦組織，精密稱重后，加入2 ml的冰甲醇，制備勻漿，加入100 μl氯仿-異丙醇渦旋混合、離心后提取上清液，高效液相色譜分離，檢測參數(shù)：進樣量10 μl；熒光檢測波長激發(fā)波長=280 nm，發(fā)射波長=330 nm；柱溫25 ℃；洗脫梯度如下：0～5 min，2%～5% (B)；5～13 min，5%～8% (B)；13～25 min，8%～15% (B)；26～30 min，25%～60% (B)；流速0.8 ml/min。檢測峰值面積，依據(jù)標準曲線計算檢測樣本蛋白含量。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，先進行數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗，組間比較采用獨立性t檢驗。

結 果

行為學檢測結果 與陰性對照小鼠相比，3月齡轉基因小鼠已經(jīng)表現(xiàn)出運動協(xié)調(diào)能力下降，表現(xiàn)為行為學評分降低，在轉棒儀上停留的時間縮短(P<0.05)，且隨著月齡的增加，運動協(xié)調(diào)能力下降更加明顯，而S100B基因敲除小鼠較陰性對照小鼠運動協(xié)調(diào)能力改變不明顯(P>0.05)(圖1、2)。

9月齡小鼠腦組織中D1DR、D2DR、GRK2、GRK5 mRNA的表達 與陰性對照組相比，S100B轉基因小鼠腦組織中D2DR和GRK2 mRNA 表達明顯降低(P<0.05)，而D1DR和GRK5 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，S100B基因敲除小鼠各檢測指標均無改變(P>0.05)(圖3)。

TG：轉基因組；KG：基因敲除組；CG：對照組；與陰性對照組相比，aP<0.05

TG：transgenic group；KG：knockout group；CG：control group；aP<0.05 compared with negative control group

圖 1 爬桿法的實驗結果

Fig 1 The results of pole-climbing test

與陰性對照組相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with negative control group

圖 2 轉棒法的實驗結果

Fig 2 The results of rota-rod performance

與陰性對照組相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with negative control group

A. 瓊脂糖凝膠電泳檢測各指標mRNA的表達情況；B. 各指標mRNA的相對表達

A. detection of target mRNA by agarose gel electrophoresis imaging；B. relative expression of target mRNA

圖 3 D1DR、D2DR、GRK2、GRK5 mRNA在各組小鼠腦組織中的表達

Fig 3 mRNA expressions of D1DR，D2DR，GRK2，and GRK5 in the brain tissues of different groups mice

9月齡小鼠腦組織中S100B、D1DR、D2DR、GRK2、GRK5、TH蛋白的表達 S100B蛋白在轉基因小鼠腦組織中的表達明顯高于陰性對照組(P<0.05)，而在基因敲除小鼠腦組織中無表達。與陰性對照組相比，S100B 轉基因小鼠腦組織中 D2DR 和 GRK2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，而 D1DR 和 GRK5蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，S100B基因敲除小鼠腦組織中各檢測指標均無改變(P>0.05)。TH的表達雖在轉基因小鼠腦組織中呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4)。

TH:酪氨酸羥化酶；Mr：相對分子質(zhì)量；與陰性對照組相比，

aP<0.05

TH：tyrosine hydroxylase;Mr：relative molecular mass；aP<0.05 compared with negative control group

A.十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測各指標蛋白的表達情況；B. 各指標蛋白的相對表達

A. detection of target protein by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis imaging；B. relative expression of target protein

圖 4 S100B、D1DR、D2DR、GRK2、GRK5、TH蛋白在各組小鼠腦組織中的表達

Fig 4 The protein expressions of S100B，D1DR，D2DR，GRK2，GRK5，and TH in the brain tissues of different groups mice

9月齡小鼠腦組織中Tyr、L-DOPA、DA、HVA的含量 與陰性對照組相比，S100B 轉基因小鼠腦組織中Tyr含量無變化(P>0.05)，但L-DOPA、DA、HVA 的含量及HVA/DA的比值顯著增高(P<0.05)，S100B基因敲除小鼠各檢測指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖5、6)。

討 論

PD是一類發(fā)病機制尚不明確的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，S100B作為腦內(nèi)特異蛋白，在PD患者血清及PD小鼠模型腦組織中均發(fā)現(xiàn)了其含量的升高。Schaf等[6]在檢測了40例PD患者血清中S100B的含量后發(fā)現(xiàn)，S100B的表達水平與Hoehn-Yahr分級呈明顯正相關，而與基本日?；顒映拭黠@負相關，表明S100B可能參與了PD患者運動障礙的產(chǎn)生。運動障礙是PD患者的主要臨床表現(xiàn)之一，PD模型小鼠會出現(xiàn)與人類PD患者類似的運動不能、減少或者遲緩等行為學改變。爬桿法和轉棒法是目前檢測小鼠運動協(xié)調(diào)能力較為常用的兩種方法。本研究使用這兩種方法對小鼠的行為學能力進行檢測，發(fā)現(xiàn)結果是一致的：S100B轉基因小鼠可表現(xiàn)出運動協(xié)調(diào)能力下降，且其同小鼠的增齡呈現(xiàn)相關關系。證實S100B過表達能夠促進小鼠PD樣運動障礙的出現(xiàn)。

Tyr：酪氨酸；L-DOPA：左旋多巴；DA：多巴胺；HVA：高香草酸；與陰性對照組相比，aP<0.05

Tyr：tyrosine；L-DOPA：levodopa；DA：dopamine；HVA：homovanillic acid；aP<0.05 compared with negative control group

圖 5 Tyr、L-DOPA、DA及HVA在各組小鼠腦組織中的含量

Fig 5 The levels of Tyr，L-DOPA，DA，and HVA in the brain tissues of different groups mice

與陰性對照組相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with negative control group

圖 6 各組小鼠腦組織中HVA/DA比值

Fig 6 The ratios of HVA/DA in the brain tissues of different groups mice

DA分別通過D1DR和D2DR在黑質(zhì)紋狀體直接和間接通路中發(fā)揮相反的功能，運動系統(tǒng)疾病，如PD，就是由直接和間接通路的失衡所導致的。與陰性對照組相比，S100B轉基因小鼠腦組織中D1DR mRNA和蛋白未發(fā)生明顯改變，D2DR mRNA和蛋白明顯降低。Liu等[7]通過體內(nèi)及體外實驗均證實，S100B 可與D2DR結合而導致細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2通路的激活以及腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制，提示S100B可能作為D2DR一新的配體而介導D2DR的信號傳導。多巴胺受體具有較強的可塑性，能隨著生理病理條件的變化而出現(xiàn)表達變化，如：過多的DA作用于突觸后D2DR可引起該受體表達下調(diào)[8]。筆者推測，由于S100B在轉基因小鼠胚胎期就會出現(xiàn)高表達，D2DR可能在其配體長期作用下出現(xiàn)受體失敏而表達下調(diào)。D2DR的變化是PD病理改變中最主要的病變，缺少D2DR基因的動物表現(xiàn)為運動不佳、動作遲緩、自發(fā)性運動減少，與PD的臨床癥狀相類似。D2DR的減少可導致DA能輸出的降低，在間接環(huán)路中，從紋狀體到蒼白球的γ-氨基丁酸抑制功能過強，使椎體外系運動功能受到明顯的抑制，導致小鼠運動協(xié)調(diào)能力降低。

激活的多巴胺受體可被GRKs磷酸化，抑制樣蛋白隨之結合到磷酸化的受體，使受體與G蛋白脫偶聯(lián)并發(fā)生內(nèi)吞，阻止受體本身再次偶聯(lián)G蛋白，從而有效地降低細胞膜上功能受體的水平，使受體介導的信號轉導效應消失或降低。其中，GRK2和GRK5的表達異常與PD的發(fā)病密切相關。本研究顯示，S100B轉基因小鼠腦組織中GRK5 mRNA和蛋白未發(fā)生改變，而GRK2 mRNA及蛋白隨著D2DR表達降低而降低，提示D2DR與GRK2可能存在相互的協(xié)調(diào)作用。Namkung等[9]研究顯示，GRK2過表達抑制D2DR在細胞表面的表達并增強激動劑誘導的D2DR的脫敏和內(nèi)化，相反，RNA干擾技術抑制GRK2蛋白的表達后，可導致細胞表面D2DR表達升高而增強D2DR介導的信號傳導。Daigle等[10]通過條件性基因敲除的方法使小鼠表達D2DR的神經(jīng)元出現(xiàn)GRK2表達的缺失，結果顯示D2DR的活性明顯增強。Theilade等[11]研究顯示，阻斷ERK1/2途徑可使GRK2表達降低，而D2DR介導ERK1/2途徑的激活。推測在轉基因小鼠腦組織中D2DR表達減少，可能降低ERK1/2途徑的傳導，而使依賴該途徑的GRK2表達降低。而GRK2表達降低，可減少D2DR的內(nèi)吞作用，使其在細胞表面分布增多，進而與G蛋白重新偶聯(lián)，增強D2DR介導的信號傳導作用，發(fā)揮機體的反饋調(diào)節(jié)作用，其可能是對S100B過表達引起的D2DR表達水平降低的補償作用或者負反饋作用。研究顯示GRK2+/-小鼠與野生型小鼠相比，腫瘤壞死因子-α在腦組織中的含量明顯升高，且該小鼠大腦神經(jīng)元對神經(jīng)興奮性毒素鵝膏蕈氨酸及谷氨酸誘導的細胞毒性更加敏感[12]。所以，S100B轉基因小鼠GRK2表達的降低，一方面可以反饋性增強D2DR介導的信號傳導，另一方面卻發(fā)揮不利作用，導致腦組織對損傷的敏感性增強。

D2DR作為一種特異的自身受體，在調(diào)節(jié)DA神經(jīng)元放電、合成、釋放與重攝取方面發(fā)揮著重要的作用。研究顯示DA生物合成的負反饋調(diào)控是由突觸前D2DR介導的，與D1DR無關[13]，D2DR基因敲除小鼠DA生成及代謝明顯增強[14]。與陰性對照相比，S100B轉基因小鼠腦組織中Tyr的含量未發(fā)生改變，L-DOPA、DA含量明顯增多，但其催化酶TH含量無變化，提示在該轉基因小鼠腦內(nèi)可能存在TH的活性升高。TH多個絲氨酸位點發(fā)生磷酸化均可導致該酶活性的升高，Stoof和Kebabian[15]研究顯示，D2DR拮抗劑通過減弱D2DR對cAMP的抑制作用而促進TH Ser 40位點磷酸化的發(fā)生。推斷D2DR通過抑制性Gi與腺苷酸環(huán)化酶的活性負偶聯(lián)，抑制依賴cAMP的蛋白激酶A對TH Ser 40位點的磷酸化激活，從而抑制DA的生物合成，S100B過表達通過降低D2DR的表達而減弱這種抑制作用，促進cAMP依賴的TH Ser 40位點的磷酸化。當然，在轉基因小鼠腦內(nèi)TH的活化可能是一個多位點磷酸化的過程，這有待于更深一步的研究。

DA不僅是內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)，其自身的生理生化特點決定了它極易處于氧化應激狀態(tài)，DA經(jīng)單胺氧化酶B或兒茶酚胺氧位甲基轉移酶進行降解生成HVA過程中及自身發(fā)生非酶促氧化生成半醌和醌的過程中均伴有大量活性氧的生成，對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生氧化損傷。在S100B轉基因小鼠腦內(nèi)DA含量及HVA/DA比值的升高，提示存在過度活躍的DA代謝，導致大量活性氧的生成，活性氧通過攻擊生物膜和組織的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)，誘導炎性細胞因子及凋亡相關蛋白的生成等途徑，引發(fā)或加劇多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。

TH是腦內(nèi)DA神經(jīng)元的蛋白標志。與陰性對照組相比，TH在轉基因小鼠腦組織中呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，表明轉基因小鼠未出現(xiàn)明顯的DA神經(jīng)元不可逆性損傷，損傷因子作用下，由于機體的調(diào)控作用，神經(jīng)元首先出現(xiàn)可逆性損傷，只有損傷因子持續(xù)作用超過機體的適應能力后才會出現(xiàn)不可逆性損傷，而PD作為一種老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其DA神經(jīng)元的損傷也是多種致病因素長期作用的結果，故這一現(xiàn)象可能與小鼠的年齡及病程的進展有關，需要進一步研究與觀察。

S100B基因敲除小鼠與陰性對照組小鼠相比，各檢測指標均無改變。Schulte-Herbrüggen等[16]對10月齡S100B基因敲除小鼠海馬、皮層多巴胺、5-羥色胺、5-羥吲哚乙酸含量進行檢測，這些物質(zhì)的含量與野生型小鼠相比未發(fā)現(xiàn)異常，并且S100B基因敲除小鼠較野生型小鼠相比，腦組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達無改變，但腦源性生長因子表達升高。表明雖然生理量的S100B對腦組織發(fā)揮營養(yǎng)保護作用，但這種作用可能是非必需的，在其缺乏時，其他營養(yǎng)因子也許發(fā)揮了營養(yǎng)代償作用。

因此，S100B過表達通過降低腦組織中D2DR、GRK2的含量，促進DA的合成及代謝而參與PD的發(fā)生發(fā)展，抑制其過表達有可能為臨床PD的治療提供新的研究思路和方向。

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Preliminary Analysis of Parkinson-like Motor Coordination Abnormity in Brain-specific hS100B Transgenic Mice

LIU Jialin1，ZHENG Fang2，LONG Yan2，TONG Liu2，ZHENG Yuan2，LIU Xiaoqing2，QIN Chuan3

1Department of Pathology，Hebei University Medical College，Baoding，Hebei 071000，China2Department of Geratology，the First Central Hospital of Baoding，Baoding，Hebei 071000，China3Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences， Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China

Corresponding author：QIN Chuan Tel：010- 67779915，E-mail：qinchuan0111@outlook.com

Objective To investigate the role of S100B in the development of Parkinson’s disease (PD) and explore the possibility of brain-specific S100B transgenic mice as PD animal model. Methods The hS100B transgenic mice were established. The mice were divided into S100B transgenic group (TG)，S100B knockout group (KG)，and the non-transgenic control group (CG). Motor coordination ability of mice was measured by the rota-rod and pole-climbing test. The expressions of S100B，dopamine D1 receptor，dopamine D2 receptor，G protein-coupled receptor kinase (GRK)2，GRK5，and tyrosine hydroxylase in brain tissue were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction and Western blot. The levels of tyrosine,levodopa，dopamine，and homovanillic acid in brain tissue were measured by high-performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection. Results Compared with CG，the S100B protein expression in brain tissue significantly increased in TG (P<0.05)；the motor coordination ability of mice showed progressive decline (P<0.05)；the mRNA and protein expressions of dopamine D2 receptor and GRK2 significantly decreased (P<0.05)；the levels of levodopa，dopamine，and homovanillic acid were significantly elevated (P<0.05)；the expression of tyrosine hydroxylase was also down-regulated，although there was no significant difference (P>0.05). Compared with CG，there was no obvious change of the above indicators in KG (allP>0.05). Conclusions S100B plays an important role in the motor coordination abnormity of PD. The brain-specific S100B transgenic mice can be used in research on the role of S100B gene in the development of PD.

S100B;Parkinson’s disease;dopamine receptor;G protein-coupled receptor kinase;dopamine

保定市科學技術研究與發(fā)展指導計劃(14ZF003)、河北大學醫(yī)學學科建設基金(2014A1002)和河北大學博士科研啟動基金(一省一校專項經(jīng)費)Supported by Baoding Sciences and Technology Research and Development Program (14ZF003)，Development Fund for Hebei University Medical Science (2014A1002)，and Research Fund for the Doctoral Program of Hebei University (Special Funds for A Provincial University)

秦 川 電話：010- 67779915，電子郵件：qinchuan0111@outlook.com

R741

A

1000- 503X(2017)02- 0240- 07

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2016- 01- 04)