黃雪峰，王 忠，鄭方毅，林梅燕

[安發(fā)(福建)生物科技有限公司 352100]

冬蟲夏草主產(chǎn)于我國西北、西南高寒山區(qū)，是冬蟲夏草菌感染蝙蝠蛾科幼蟲后共生形成的蟲菌復(fù)合體，含蟲草素、蟲草酸及蟲草多糖等多種活性物質(zhì)，具有益腎補(bǔ)肺、調(diào)節(jié)免疫及抗腫瘤等多種功能。由于野生資源有限，市場(chǎng)需求量逐年增加，人工培育冬蟲夏草勢(shì)在必行。人工培育首要條件是成功飼養(yǎng)蟲草蝙蝠蛾幼蟲，近30年來全國先后有數(shù)十家科研單位和數(shù)千人進(jìn)行了冬蟲夏草人工培育研究和探索，通過對(duì)蝙蝠蛾昆蟲的分類分布、發(fā)育規(guī)律及其生態(tài)因子的研究，基本掌握其生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性，人工繁殖出不同齡期的幼蟲，初步探索出人工培育冬蟲夏草的生長規(guī)律，部分科研單位在云南、四川及西藏等高海拔地區(qū)建立試驗(yàn)站或仿生培育基地，取得了小面積培育有性型成功的經(jīng)驗(yàn)[1]；李文佳等[2]報(bào)道了東陽光藥在湖北宜昌成功進(jìn)行人工培植冬蟲夏草試驗(yàn)。

蝙蝠蛾昆蟲在自然條件下完成一個(gè)發(fā)育周期要4、5年時(shí)間，幼蟲在地下生活，喜低溫、潮濕環(huán)境。目前雖有研究人員在人工條件下解決了蝙蝠蛾幼蟲的離土培養(yǎng)培養(yǎng)周期縮短的缺點(diǎn)，總結(jié)出在較低海拔試驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)寄主幼蟲的技術(shù)[3-4]，完成了蟲草蝙蝠蛾1個(gè)世代的飼養(yǎng)[5]；但低海拔實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)幼蟲存活率不高。筆者在前期飼養(yǎng)蝙蝠蛾昆蟲中發(fā)現(xiàn)，感染蝙蝠蛾幼蟲的病原61.30%為細(xì)菌；死亡幼蟲中有72.37%為細(xì)菌感染。蝙蝠蛾幼蟲取食未消毒徹底的飼料可能導(dǎo)致感染進(jìn)而出現(xiàn)褐色斑、排稀便或軟腐死亡，表現(xiàn)出蟲體軟化、內(nèi)部組織腐爛，可鏡檢出細(xì)菌。幼蟲病害成為規(guī)?；曫B(yǎng)的一項(xiàng)重要制約因素，主要病害包括細(xì)菌、擬青霉、綠僵菌、白僵菌，以及線蟲、寄生蠅等[6]。昆蟲病害防治目前常見于家蠶及蜜蜂等常見經(jīng)濟(jì)昆蟲[7-8]，使用藥劑防治蝙蝠蛾病害鮮見報(bào)道。因此，在嚴(yán)格把關(guān)飼料選材及制備方法的基礎(chǔ)上，采用食下毒葉法測(cè)定13種殺菌劑對(duì)已感染細(xì)菌蝙蝠蛾幼蟲生存狀況，初步篩選出6種藥劑進(jìn)行防治幼蟲病害的試驗(yàn)，以期為人工培育冬蟲夏草提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試蟲源 5齡蝙蝠蛾幼蟲，是經(jīng)室內(nèi)飼養(yǎng)連續(xù)出現(xiàn)3次細(xì)菌感染的幼蟲。

1.1.2供試藥劑 供試藥劑主要有植物殺菌劑、蠶藥及動(dòng)物抗菌劑3類藥。植物殺菌劑：5%大蒜素(湖南佳沐生物科技有限公司)，蠟質(zhì)芽孢桿菌可濕性粉劑(西安中禾作物科學(xué)有限公司，每克含300億菌體)；蠶藥：蠶服康1號(hào)(廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站)，鹽酸環(huán)丙沙星溶液、蠶用多菌靈粉和蠶護(hù)康(廣東省前沿動(dòng)物保健有限公司)，膿病速清(四川省勁豐生物技術(shù)有限公司)，專治細(xì)菌病毒王(廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站)，特效弄僵二合一(廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站)；動(dòng)物抗菌劑：腸炎消(臺(tái)灣雷爾企業(yè))，植物抗菌肽(美國艾貝兒小動(dòng)物研發(fā)部)，納豆菌粉(江蘇微康生物科技有限公司)，鹽酸小檗堿(上海信誼天平藥業(yè)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

對(duì)蝙蝠蛾幼蟲的毒性安全評(píng)價(jià)目前未見有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)準(zhǔn)則》中家蠶毒性試驗(yàn)的食下毒葉法，制備胡蘿卜薄片1.5 g為飼料，殺菌劑使用量為產(chǎn)品推薦用量。

1.2.1不同藥劑對(duì)蝙蝠蛾幼蟲存活狀況的影響 13種藥劑處理(表1)，分別浸漬胡蘿卜切片(下同)，以10 mL藥液浸漬10 g胡蘿卜10 s，晾干備用，設(shè)置無菌水漂洗過的胡蘿卜為對(duì)照(CK)。挑取饑餓48 h的受試幼蟲，每組藥劑處理5頭感染幼蟲(幼蟲生命力處于較為活躍狀態(tài))，重復(fù)3次，放入養(yǎng)蟲箱保濕培養(yǎng)，置于溫度(11±1)℃、相對(duì)濕度50%～70%條件下培養(yǎng)，7 d更換1次飼料，14 d后觀察記錄受試幼蟲死亡率、是否產(chǎn)生不適(吐水、拒食)、平均取食率。以幼蟲正常取食飼料≥50%及以上、死亡率≤10%、不適幼蟲≤20%為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2不同藥劑對(duì)蝙蝠蛾幼蟲病害的防效 經(jīng)初步篩選試驗(yàn)(1.2.1)篩選出6種藥劑，進(jìn)一步進(jìn)行防治蝙蝠蛾幼蟲病害的防效試驗(yàn)。6種藥劑處理(表2)分別浸漬胡蘿卜，以10 mL藥液浸漬10 g胡蘿卜10 s ，晾干備用，設(shè)皿無菌水漂洗過的胡蘿卜為對(duì)照(CK)。挑取初期感染的活躍幼蟲，作48 h的饑餓處理，備用。將饑餓幼蟲接入各處理飼料的培養(yǎng)皿，每組10頭感染幼蟲，重復(fù)3次。放入養(yǎng)蟲箱保濕培養(yǎng)，置于溫度(11±1)℃、相對(duì)濕度50%～70%條件下培養(yǎng)，每14 d更換各處理的飼料，60 d后觀察記錄幼蟲生存狀態(tài)，計(jì)算幼蟲病情指數(shù)、存活率及藥劑防治效果。計(jì)算公式：

死亡率(%)=幼蟲死亡數(shù)/幼蟲總數(shù)×100；

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/(1-對(duì)照死亡率)×100；

病情指數(shù)=∑(各級(jí)幼蟲發(fā)病數(shù)量×相對(duì)病級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總蟲數(shù)×3)×100；

防治效果(%)=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組區(qū)病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100；

發(fā)病率(%)=幼蟲發(fā)病數(shù)量/幼蟲總數(shù)量×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)照組死亡率≤10%為有效試驗(yàn)，數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理后用SPSS 22.0軟件對(duì)不同處理間的差異進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA) 和Duncan氏多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對(duì)蝙蝠蛾幼蟲存活狀況的影響

由表1可以看出，從取食率看，經(jīng)藥劑飼養(yǎng)處理14 d后，13種藥劑處理的幼蟲取食率均低于對(duì)照。表明這13種劑對(duì)幼蟲取食飼料均產(chǎn)生影響，其中以蠶護(hù)康影響最大，取食率僅為23.17%；大蒜素、蠟質(zhì)芽孢桿菌、腸炎消、植物抗菌肽、蠶用多菌靈、鹽酸環(huán)丙沙星、特效膿僵二合一的取食率均高于50%。從死亡率看，大蒜素、蠟質(zhì)芽孢桿菌、煙酸小檗堿、腸炎消、鹽酸環(huán)丙沙星、特效膿僵二合一和蠶服康1號(hào)處理與對(duì)照相當(dāng)，死亡率低于7%。從幼蟲不適比例看，大蒜素、植物抗菌肽和特效膿僵二合一與對(duì)照組一致，蠟質(zhì)芽孢桿菌、蠶用多菌靈、鹽酸環(huán)丙沙星和蠶護(hù)康處理的幼蟲不適比例均在20%或20%以下。綜合1.2.1中的篩選標(biāo)準(zhǔn)，初步獲得大蒜素、蠟質(zhì)芽孢桿菌、植物抗菌肽、蠶用多菌靈、鹽酸環(huán)丙沙星和特效膿僵二合一等6種殺菌劑用于防治幼蟲病害的試驗(yàn)。

表1 13種藥劑對(duì)蝙蝠蛾幼蟲存活狀態(tài)的影響

2.2 不同藥劑對(duì)幼蟲病害細(xì)菌的防治效果

由表2可見，除蠶用多菌靈處理外，其他處理的幼蟲細(xì)菌病害發(fā)病率均顯著或極顯著低于對(duì)照，其中以蠟質(zhì)芽孢桿菌處理的幼蟲細(xì)菌病害發(fā)病率最低，為36.67%，低于對(duì)照36.66個(gè)百分點(diǎn)；大蒜素處理次之，為50.00%，低于對(duì)照23.33個(gè)百分點(diǎn)。從病情指數(shù)看，除了蠶用多菌靈外，其他5種殺菌劑的病情指數(shù)均極顯著低于對(duì)照，其中以大蒜素和蠟質(zhì)芽孢桿菌的病情指數(shù)最低，分別為2.10和2.15，分別比對(duì)照低55.79%和54.74%。從防治效果看，大蒜素處理和蠟質(zhì)芽孢桿菌處理的防效最高，分別為55.71%和54.68%；其次為鹽酸環(huán)丙沙星處理和特效膿僵二合一處理，與對(duì)照相當(dāng)； 植物抗菌肽和蠶用多菌靈的防效較低，分別為24.00%和4.17%。

表2 6種藥劑對(duì)蝙蝠蛾幼蟲病害細(xì)菌的防治效果

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選的6種殺菌劑對(duì)幼蟲病害細(xì)菌有一定的防治作用，在一定程度上降低幼蟲的發(fā)病率，但對(duì)飼料的適口感造成一定的影響，導(dǎo)致蝙蝠蛾幼蟲對(duì)飼料的取食率降低，且防效差異較大，大蒜素和蠟質(zhì)芽孢桿菌防治效果高于50%，其余3個(gè)處理防治效果較差。因此，在蝙蝠蛾幼蟲發(fā)病時(shí)可選用大蒜素和蠟質(zhì)芽孢桿菌作為防治藥劑。大蒜素對(duì)幼蟲病害細(xì)菌防治效果較好，可能與其自身具較強(qiáng)的抗菌消炎作用有關(guān)，原理是由于大蒜素分子中的氧原子可與細(xì)菌生長繁殖所必需的半胱氨酸分子中的巰基相結(jié)合而抑制細(xì)菌的生長和繁殖。而蝙蝠蛾幼蟲對(duì)大蒜素飼料取食率偏低，可能與大蒜素自身帶有的刺激性氣味有關(guān)，因此對(duì)大蒜素用量需要進(jìn)一步的試驗(yàn)探索。本研究目前僅針對(duì)一種蟲源開展試驗(yàn)，殺菌劑對(duì)不同地域、不同品種的蝙蝠蛾昆蟲可能會(huì)有不一樣的影響效果，這有待于今后在其他的蝙蝠蛾昆蟲上展開后續(xù)試驗(yàn)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]古德祥，張古忍，王江海，等.冬蟲夏草研究的回顧與展望[J].中國食品學(xué)報(bào)，2006，6(2)：137-141.

[2]李文佳，董彩虹，劉杏忠，等.冬蟲夏草培植技術(shù)研究進(jìn)展[J].菌物學(xué)報(bào)，2016，35(4)：375-387.

[3]尹定華，唐雪梅.冬蟲夏草人工培殖研究的進(jìn)展[J].中國中藥雜志，1995，20(12)：707-709.

[4]高祖紃，陳健，余虹，等.全人工培養(yǎng)冬蟲夏草研究：康定蟲草寄主蝠蛾研究初報(bào)[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，1991(1)：1-5.

[5]李建民，李福安.淺談青海冬蟲夏草的研究進(jìn)展[J].青海醫(yī)藥雜志，2004，34(8)：59-61.

[6]賀宗毅，劉飛，陳仕江，等.青藏高原特色資源冬蟲夏草培育過程中的病蟲害研究進(jìn)展[J].重慶中草藥研究，2012(1)：57-58.

[7]梁勤，陳大福.蜜蜂病害與敵害防治[M].北京：金盾出版社，2006.

[8]朱丹丹，邵彬.家蠶飼養(yǎng)中常見的病害及其防治[J].高等繼續(xù)教育學(xué)報(bào)，2008，21(3)：59-61.