鄧寒霜，曹華，李筱玲

（商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

葡萄，葡萄屬（Vitis）藤本植物，約 60種，原產(chǎn)于亞洲北部，目前廣泛栽培于地中海地區(qū)。在我國(guó)長(zhǎng)江流域以北各地葡萄種植面積和產(chǎn)量都非常高，國(guó)內(nèi)主產(chǎn)區(qū)在新疆，約占全國(guó)栽培面積的30%[1]。葡萄主要用于釀造葡萄酒、白蘭地和甜露酒等，也可鮮吃或制成干果食用，如葡萄干、淡黃葡萄干和無(wú)核小葡萄干等。隨著葡萄產(chǎn)量的增加以及對(duì)葡萄的使用，在葡萄制品的生產(chǎn)加工過(guò)程中產(chǎn)生了許多廢棄物，如葡萄籽、葡萄皮、葡萄渣等。其中葡萄籽主要為葡萄汁和葡萄酒加工等產(chǎn)業(yè)的廢棄物，約占整個(gè)葡萄重量的5%～7%[2]。我國(guó)葡萄資源豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)2013年全國(guó)葡萄總產(chǎn)量高達(dá)1121.20萬(wàn)噸[3]，據(jù)此計(jì)算，每年葡萄籽的產(chǎn)量高達(dá)數(shù)十萬(wàn)噸。相關(guān)研究表明葡萄籽里包含葡萄籽油、蛋白質(zhì)、原花青素等物質(zhì)，這些物質(zhì)擁有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有相當(dāng)好的保健功能，在食品、藥品、保健品等行業(yè)都可被安全使用[4]。早期對(duì)于葡萄籽的研究多集中在葡萄籽油[5]和多糖[6]的范圍內(nèi)。近年來(lái)，人們從葡萄籽和皮中分離出了具有較強(qiáng)抗氧化和清除自由基能力的功能因子——原花青素，其抗自由基的氧化能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍[7]。目前，大量的葡萄籽資源被當(dāng)作廢棄物處理，或者直接做成簡(jiǎn)單的飼料賣(mài)給農(nóng)戶(hù)，易造成環(huán)境污染，降低天然資源的生物利用度，也不符合創(chuàng)新、協(xié)調(diào)、綠色、開(kāi)放、共享的發(fā)展理念。為了提高葡萄籽的生物利用度，本文對(duì)其中原花青素的提取工藝進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葡萄籽，采自市售葡萄，干燥至恒重后粉碎，過(guò)45目篩，裝袋備用[8]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

精密稱(chēng)取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用無(wú)水乙醇溶解并定容至50 mL，得標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精確吸取上述儲(chǔ)備液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別加入2.0 mL 30 g·L-1香草醛甲醇溶液及2.0 mL 30%H2SO4甲醇溶液，以無(wú)水乙醇定容至10 mL，混均，在避光條件下于30℃水浴反應(yīng)20 min，以濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)液為空白，在500 nm處測(cè)定吸光度[9]。以原花青素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程y=2.2592x+0.1022，R2=0.9977。線(xiàn)性范圍為0～0.24 mg·mL-1。

1.2.2 樣品溶液處理

精密稱(chēng)取葡萄籽粉末1 g，置150 mL三角瓶中，按設(shè)定條件進(jìn)行超聲波輔助提取，離心，取上清液，殘?jiān)礈旌蟪恋?，二次離心，合并兩次上清液，定容至50 mL，得到樣品溶液。取稀釋5倍后的樣品溶液1 mL，依照1.2.1的方法進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算原花青素提取率。

式中：C——樣品原花青素濃度（mg·mL-1），V——提取液的體積（mL），n——稀釋倍數(shù)，W——葡萄籽粉末樣品重量（mg）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1）乙醇濃度對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

精密稱(chēng)取葡萄籽粉末1 g，固定料液比為1∶10，提取時(shí)間 10 min，分別在 40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇濃度下，提取2次，依照1.2.2的方法進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算原花青素提取率。

2）超聲時(shí)間對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

精密稱(chēng)取葡萄籽粉末1 g，固定乙醇濃度為80%，料液比 1∶10，分別超聲處理 10、20、30、40、50、60 min，提取2次，依照1.2.2的方法進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算原花青素提取率。

3）料液比對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

精密稱(chēng)取葡萄籽粉末1 g，固定乙醇濃度為80%，超聲時(shí)間 20 min，分別以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，提取2次，依照1.2.2的方法進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算原花青素提取率。

4）提取次數(shù)對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

精密稱(chēng)取葡萄籽粉末1 g，固定乙醇濃度為80%，超聲時(shí)間 20 min，料液比 1∶20，分別提取 1次、2次、3次，依照1.2.2的方法進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算原花青素提取率。

1.2.4 正交試驗(yàn)

因提取2次后樣品中原花青素提取率增加不大，為提高工作效率，將提取次數(shù)固定為2，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

在實(shí)驗(yàn)中能觀察到，隨著乙醇濃度的增大，提取液的澄清度越來(lái)越好。同時(shí)，由圖1可知，隨著乙醇濃度增加，提取率有一個(gè)持續(xù)上升的過(guò)程。但當(dāng)乙醇濃度大于80%后，原花青素提取率有所下降。分析原因可能是當(dāng)乙醇濃度高于80%時(shí)，一些醇溶性雜質(zhì)、色素和脂溶性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些成分與原花青素爭(zhēng)奪乙醇—水分子，使原花青素的溶出率下降，從而導(dǎo)致提取率降低。

圖1 乙醇濃度對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)超聲時(shí)間小于30 min時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄籽原花青素提取率逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)30 min后，提取率開(kāi)始下降。分析原因可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理會(huì)導(dǎo)致原花青素的結(jié)構(gòu)遭到破壞所致?？紤]到超聲處理30 min相對(duì)處理20 min時(shí)提取率只有略微增加，為提高工作效率，最優(yōu)超聲時(shí)間以20 min為宜。

圖2 提取時(shí)間對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

2.1.3 料液比對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

由圖3可知，隨著溶劑用量的增加，葡萄籽原花青素提取率逐漸增加，當(dāng)料液比超過(guò)1：20后，提取率已經(jīng)趨于穩(wěn)定。說(shuō)明當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，原花青素已能充分溶出，再增加提取溶劑，提取率也不會(huì)有明顯的增長(zhǎng)，因此，料液比選擇1∶20 為宜。

圖3 料液比對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

由圖4可知，經(jīng)過(guò)2次提取，大部分原花青素已充分溶出，為提取工作效率，在正交試驗(yàn)中不再對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行考察。

圖4 提取次數(shù)對(duì)葡萄籽原花青素提取率的影響

2.2 葡萄籽原花青素提取率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2和表3分析可知，影響葡萄籽原花青素提取率的因素主次順序?yàn)锳＞B＞C，即乙醇濃度對(duì)原花青素提取率的影響最大，其次是提取時(shí)間，最后為料液比。由正交分析可得最佳工藝條件為：A2B2C3，即乙醇濃度為80%，提取時(shí)間為20 min，料液比為 1∶25。

表2 葡萄籽原花青素提取率正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 葡萄籽原花青素提取率的極差分析

2.3 葡萄籽中原花青素提取率驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

精密稱(chēng)取葡萄籽粉末5份，每份1 g，按正交試驗(yàn)所得最佳工藝條件，即乙醇濃度80%，提取時(shí)間 20 min，料液比 1：25，重復(fù)提取2次，依照1.2.2的方法測(cè)定含量，計(jì)算原花青素提取率。由表4可以得知，在最優(yōu)條件下，葡萄籽中原花青素提取率平均值為4.45%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.25%，表明該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行。

表4 葡萄籽原花青素提取率的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

原花青素的提取方法有熱回流提取法、微波輔助法、超聲波輔助法、超聲—微波協(xié)同提取技術(shù)、超臨界流體提取法、酶提取法等[10-13]。傳統(tǒng)的熱回流提取法以及有機(jī)溶劑浸提法存在時(shí)間長(zhǎng)、溶劑使用成本高，且能耗大、提取率低等問(wèn)題。超聲輔助提取法和微波輔助提取法等是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型提取技術(shù)，具有選擇性高、耗時(shí)少、能耗低、溶劑耗量少、排污量少等優(yōu)點(diǎn)，是目前天然產(chǎn)物提取的創(chuàng)新技術(shù)。

本文以葡萄籽原花青素提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)超聲波輔助法提取葡萄籽中原花青素的工藝條件進(jìn)行了研究。得到最優(yōu)提取工藝為以80%的乙醇為溶劑，在料液比1：25條件下，超聲提取時(shí)間20 min，在此條件下重復(fù)提取2次，葡萄籽原花青素平均提取率為4.45%。經(jīng)5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該工藝條件操作穩(wěn)定、可行，有很好的重復(fù)性。據(jù)蘇芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)超聲功率對(duì)提取結(jié)果影響不大，故本研究未考察該因素的影響情況，為了給葡萄籽原花青素的提取工藝研究提供更詳實(shí)的數(shù)據(jù)支持，在后續(xù)的工作中有必要對(duì)其進(jìn)行更系統(tǒng)的研究。

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