杜 娟,游雪嬌,解春艷,5,*,侯曉強,5,喬 潔,5,郭紅珍,5,吳智艷,5

(1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)院,河北廊坊 065000; 2.廣東省微生物研究所,廣東廣州 510000; 3.省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室,廣東廣州 510000; 4.廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室,廣東廣州 510000； 5.河北省高校食藥用真菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心,河北廊坊 065000)

雙酶混合水解玉米皮渣制備阿魏酰低聚糖研究

杜 娟1,游雪嬌2,3,4,解春艷1,5,*,侯曉強1,5,喬 潔1,5,郭紅珍1,5,吳智艷1,5

(1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)院,河北廊坊 065000; 2.廣東省微生物研究所,廣東廣州 510000; 3.省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室,廣東廣州 510000; 4.廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室,廣東廣州 510000； 5.河北省高校食藥用真菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心,河北廊坊 065000)

以玉米皮渣為原料,采用酶解方法制備阿魏酰低聚糖(Feruloyl oligosaccharides,FOs),通過比較不同酶解條件下阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的差異及不同酶解方式下玉米皮渣細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化,確定酶解阿魏酰低聚糖生成的方法,并優(yōu)化獲得玉米皮渣中阿魏酰低聚糖的最佳酶解條件。結(jié)果表明:纖維素酶和木聚糖酶混合酶解可使玉米皮渣細(xì)胞壁出現(xiàn)溶洞,可有效提高阿魏酰低聚糖產(chǎn)量;經(jīng)單因素和響應(yīng)面實驗確定雙酶混合酶解的最佳條件為混合酶的添加量為15.7 g/L,混合酶中纖維素酶添加比例為70%,酶解1 h,玉米皮渣底物添加量為100 g/L,在此條件下FOs產(chǎn)量最高,為1008.43 μmol/L。本研究為雙酶混合酶解制備玉米皮渣FOs提供理論依據(jù)。

玉米皮渣,阿魏酰低聚糖,混合酶解,酶解條件

玉米皮是玉米籽粒的表皮部分,其量可占玉米重量的8%～10%[1]。玉米皮渣是玉米淀粉加工過程中形成的副產(chǎn)物,主要是玉米皮及少量淀粉、蛋白質(zhì)等,報道稱玉米皮渣中含有膳食纖維(52.6%～86.0%)、蛋白質(zhì)(5.0%～13.0%)、淀粉(4.0%～20.0%)和酚類化合物(2.0%～5.5%)等[2]。玉米皮渣總酚類化合物中,阿魏酸及其聚合物占90%以上[3]。在植物中阿魏酸多以酯鍵與細(xì)胞壁多糖鏈接[4],水解后可獲得阿魏酰低聚糖(Feruloyl oligosaccharides,FOs)。

FOs是阿魏酸(Ferulic acid,FA)與糖的羥基通過酯鍵連接成的一類重要的功能性低聚糖[1],具有多種生理功效,報道稱FOs可增強小鼠免疫力[5]、改善腸道菌群[6]、預(yù)防癌癥等[7-10]作用。目前阿魏酰低聚糖的研究主要集中在其生物活性方面,也有少量以禾本科植物為原料進行FOs制備的報道[11-12],但研究僅限于制備條件的優(yōu)化,且研究中多數(shù)僅用木聚糖酶酶解,單一酶酶解效率顯著低于纖維素酶和木聚糖酶混合酶解[13],推測雙酶中酶的添加比例亦會影響產(chǎn)物的生成。本研究以玉米皮渣為原料,采用雙酶酶解制備FOs,在確定最佳酶解條件的同時,通過比較不同酶解方式下玉米皮渣細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異,探討FOs生成與酶種類及酶組成的關(guān)系。研究結(jié)果將有助于玉米皮渣的合理利用及FOs的工業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米皮渣 購自河北省滄州市淀粉加工廠;纖維素酶、木聚糖酶 由寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司提供,酶活分別為600 萬μg/min·g和200 萬μg/min·g;NaOH、濃HCl、無水乙醇、磷酸等 為國產(chǎn)分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;乙腈 為國產(chǎn)色譜級,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Hitachi S-3000N 掃描式電子顯微鏡、安捷倫1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Milli-Q純水機 美國Merck Millipore公司;MLS-3750全自動立式滅菌鍋 日本Sanyo公司;SHZ-82A恒溫振蕩器 常州朗越儀器制造有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 FOs的測定

1.2.1.1 FOs含量 阿魏酰低聚糖是阿魏酸與低聚糖以酯鍵形式連接,經(jīng)堿解后可釋放阿魏酸,現(xiàn)報道的FOs結(jié)構(gòu)中阿魏酸與低聚糖組成比例相同[14],即阿魏酸摩爾含量與FOs摩爾含量相同,故本實驗中測定FOs樣品液及其堿解液中阿魏酸含量,換算得出FOs的摩爾含量[15]。

1.2.1.2 FOs堿解處理 取玉米皮渣酶解液1 mL于10 mL離心管中,添加1 mL濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液,于100 ℃水解90 min,冷卻后用1 mol/L的鹽酸溶液中和。

1.2.1.3 阿魏酸的液相色譜測定條件 采用Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),25 ℃,進行HPLC分離,檢測器為紫外檢測器(UV);洗脫液為0.1%磷酸水(V/V)(A)和乙腈(B),兩者比例為17∶83,流速為1.0 mL/min,進液量為20 μL,檢測波長為320 nm。

1.2.2 酶種類對玉米皮渣FOs生成的影響 以高壓蒸煮后的玉米皮渣為原料[12],取一定量的玉米皮渣粉,按底物添加量為100 g/L添加磷酸鹽緩沖溶液(50 mmol/L,pH為5.0),再分別添加纖維素酶、木聚糖酶以及兩者的復(fù)合酶(纖維素和木聚糖酶添加比例為1∶1),添加量為10 g/L,于60 ℃酶解1 h,95 ℃滅酶10 min,4000 r/min離心15 min,分別測定上清液中FOs含量。

高壓蒸煮處理方法:取200 g玉米皮渣,添加100 mL蒸餾水,置于500 mL三角瓶中,于高壓滅菌鍋中,采用121 ℃下處理20 min,溫度降至70 ℃時,取出,于60 ℃烘箱中烘干待用。

1.2.3 酶解玉米皮渣制備FOs最佳條件研究 采用單因素和響應(yīng)面實驗對玉米皮渣FOs酶解的最佳條件進行優(yōu)化。

1.2.3.1 單因素實驗 外源酶酶解效果受底物添加量、酶解時間、pH、酶添加量等因素的影響[14],本研究中分別對上述各因素進行單因素實驗,找出各因素水平范圍。

分別設(shè)置底物添加量25、50、75、100和125 g/L,酶添加量分別設(shè)定為5、10、15和20 g/L(酶比例為纖維素酶∶木聚糖酶為1∶1),酶解時間分別設(shè)定1、2、4、6和8 h,pH分別設(shè)定為4.5、5.0、5.5和6.0。按照上述設(shè)定方法進行單因素實驗,在實驗中,后次實驗均以上次實驗的最佳點作為實驗參數(shù),即當(dāng)?shù)孜锾砑恿孔罴蚜看_定后,后面均以該濃度為設(shè)定濃度,進行實驗。

酶解結(jié)束后,分別于95 ℃滅酶10 min,4000 r/min離心15 min,測定上清液中FOs含量。

1.2.3.2 響應(yīng)面實驗 為進一步優(yōu)化混合酶酶解制備FOs最佳條件,在單因素實驗基礎(chǔ)上以纖維素酶添加比例(纖維素酶占混合酶的比例)、酶解時間、加酶量和底物添加量為變量,以FOs生成量為響應(yīng)值,選用四因素三水平的Box-Behnken 中心組合設(shè)計進行實驗,實驗設(shè)計見表1。通過Design-Expert 8.0設(shè)計出如下29組實驗。

表1 因素水平表Table 1 The factors and levels graph

1.2.4 玉米皮渣電鏡掃描 對不同酶酶解處理過的玉米皮渣進行電子顯微鏡掃描(scanning electron microscope,SEM),加速電壓15.0 kV,放大倍數(shù)1500×,通過電鏡掃描圖觀察不同酶酶解前后玉米皮渣原料縱橫切面形態(tài)的變化。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酰低聚糖液相分析

如圖1所示,FOs原樣液液相圖譜中在阿魏酸出峰時間內(nèi)有較小峰出現(xiàn)但堿解后阿魏酸峰面積顯著增加,原因是FOs經(jīng)堿水解后阿魏酸酯堿斷裂,釋放阿魏酸,依據(jù)目前報道的阿魏酰低聚糖的結(jié)構(gòu)可用阿魏酸的摩爾量代替FOs的摩爾量。

圖1 酶解獲得FOs上清液堿解前后及阿魏酸標(biāo)品液相圖Fig.1 HPLC figures of FOs before and after hydrolysis and HPLC figure of ferulic acid standard注:圖中A、B、C分別為阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品、FOs液堿解前和堿解后的液相圖。

2.2 酶種類對玉米皮渣FOs生成的影響

以高壓蒸煮后的玉米皮渣為原料,采用外源酶處理,測定玉米皮渣經(jīng)木聚糖酶、纖維素酶和兩者1∶1比例混合酶處理后FOs生成量,結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶種類對FOs生成的影響Fig.2 Effects of enzyme kinds on the production of FOs

由圖2可知纖維素酶與木聚糖酶按1∶1比例添加時,玉米皮渣中FOs生成量顯著高于單一酶的處理,在單一酶處理中又以纖維素酶處理獲得的FOs量較高。其原因是玉米皮渣中細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中纖維素與半纖維素及木質(zhì)素緊密相連[16-17],外源酶進入需打破這種連接,纖維素酶可作用于玉米皮細(xì)胞壁,使纖維素降解,進而可促進木聚糖酶作用于玉米皮渣細(xì)胞壁,獲得FOs;單一酶中又以纖維素酶最佳,分析可能是該酶純度不高,其中含有木聚糖酶。后續(xù)酶解中用兩種酶的復(fù)合酶進行。

2.3 玉米皮渣經(jīng)酶處理后細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化

圖3 外源酶酶解后玉米皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖Table 3 SEM of maize bran cell wall treated by different enzyme注:圖中A為玉米皮渣原樣,B～D分別為纖維素酶、木聚糖酶及兩者共同酶解后樣品,圖中A～D為放大1500倍的效果圖。

玉米皮渣經(jīng)外源酶處理后,其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)如圖3所示。結(jié)果顯示玉米皮渣酶解過程中因所用酶的不同而造成其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異,與未酶解的玉米皮渣細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相比,酶解后結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)斷裂,且不同酶處理玉米皮渣斷裂層不同,這與酶解后FOs生成量的趨勢相同;纖維素酶處理后玉米皮渣橫縱向出現(xiàn)裂痕,縱向斷裂情況明顯;木聚糖酶處理后在玉米皮渣內(nèi)層裂痕明顯,縱向未見斷裂;經(jīng)兩酶共同處理后,玉米皮渣結(jié)構(gòu)溶解,出現(xiàn)大的空洞,此結(jié)果與張暻等[18]采用混合酶處理麥麩后麥麩細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化情況類似。但復(fù)合酶處理后玉米皮渣縱向結(jié)構(gòu)變化比單一纖維素酶處理要小,原因是在復(fù)合酶中纖維素酶比例為50%與單一纖維素酶相比酶量較少,造成縱向斷裂效果不顯著,由此推測在復(fù)合酶酶解過程中纖維素酶與木聚糖酶比例亦會影響玉米皮渣細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化,同時造成FOs生成量的差異。

2.4 酶解玉米皮渣制備FOs的條件優(yōu)化

2.4.1 底物添加量對FOs生成的影響 由圖4可知,FOs產(chǎn)量隨著底物添加量的增加先上升后保持不變;底物添加量為75 g/L時,FOs產(chǎn)量達(dá)到最大值(為886 μmol/L);底物添加量低于75 g/L時,隨著底物的增加,FOs產(chǎn)量增加,而超過75 g/L時,底物添加量的增加對FOs產(chǎn)量影響不顯著。其原因是在酶添加量一定的情況下,底物增加可增加提供FOs的主體,而當(dāng)其增大到一定量下,外源酶已不足以使其完全水解獲得FOs,致使FOs產(chǎn)量保持不變。

圖4 底物添加量對FOs生成含量Fig.4 Effects of substrate addition on the production of FOs

2.4.2 酶添加量對FOs生成的影響 由圖5可知,FOs產(chǎn)量隨酶添加量的增加先增加后下降,當(dāng)酶的添加量為15 g/L時FOs產(chǎn)量達(dá)到最大值746 μmol/L,原因可能是,當(dāng)?shù)孜锾砑恿恳欢ǖ那闆r下,FOs的產(chǎn)量會隨著酶的添加量的增加而增加,直至達(dá)到最大限度,之后酶再繼續(xù)添加便會抑制產(chǎn)物的生成,酶中可能有一些物質(zhì)會使FOs分解,從而使FOs產(chǎn)量下降。

圖5 酶添加量對FOs生成的影響Fig.5 Effects of enzyme addition on the production of FOs

2.4.3 酶作用時間對FOs生成的影響 由圖6可知,FOs產(chǎn)量隨著酶處理時間的延長呈先增加后減小的變化趨勢,當(dāng)酶處理時間是2 h時,FOs的產(chǎn)量達(dá)到最大值,之后其值有下降的趨勢。其原因是:酶作用于底物需要一定的時間,達(dá)到一定時間時FOs的產(chǎn)量最大,時間再延長FOs被分解使其產(chǎn)量下降。所以酶的最適作用時間是2 h。

圖6 酶解作用時間對FOs生成含量Fig.6 Effects of enzyme time on the production of FOs

2.4.4 pH對FOs生成的影響 由圖7可知,在4.5～6.0范圍內(nèi),隨著pH的升高,FOs產(chǎn)量先增大后減小,在5.0～5.5時,FOs產(chǎn)量最大,原因是所用商品酶中木聚糖酶和纖維素酶的最適pH均為5.0～5.5,由FOs產(chǎn)量比較,FOs制備的最適pH應(yīng)為5.5。

圖7 pH對FOs生成量的影響Fig.7 Effects of pH on the production of FOs

2.5 FOs酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化研究

在單因素實驗基礎(chǔ)上,選取纖維素酶添加比例、酶解時間、加酶量和底物添加量四因素,采用響應(yīng)面優(yōu)化法對上述四因素生成FOs最佳參數(shù)進行優(yōu)化,實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface

利用Design-Expert8.0軟件對表2實驗數(shù)據(jù)擬合,得到FOs產(chǎn)量(Y)對纖維素酶比例(A)、酶解時間(B)、酶添加量(C)、底物添加量(D)的二次多項回歸模型為:

Y=568.15+144.59A-85.08B+24.02C+170.58D-78.85BD-183.22A2-86.81C2+77.19D2

利用Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析,得到方差分析結(jié)果見表3。分析可知,模型是極顯著的(p<0.01),因素A、B、D(p值分別為<0.001,0.0012和<0.0001)對FOs產(chǎn)量的影響極顯著;由實驗值與回歸方程預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)R2=0.9188,可知模型預(yù)測值與實際值擬合情況良好,說明采用響應(yīng)曲面法進行FOs制備條件優(yōu)化實驗設(shè)計所得回歸方程模型是可行的。

從表3中各因素F值大小分析可知,影響FOs生成的大小順序依次為D(底物添加量)、A(纖維素酶添加比例)、B(酶解時間)、C(酶添加量),其中纖維素酶添加比例、作用時間和底物添加量達(dá)到極顯著水平,此結(jié)果與前面顯微觀察推測相同,由此說明在復(fù)合酶酶解制備FOs的過程中除了兩種酶的添加外,兩種酶比例亦是酶解控制的重要參數(shù)。此外,底物添加量和酶解時間的交互作用對FOs產(chǎn)量的影響顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注：*代表影響顯著(p<0.05),**代表影響極顯著(p<0.01)。

圖8 底物添加量和酶解時間對FOs產(chǎn)量的影響Fig.8 Influence of substrate addition and enzyme time on the yield of FOs

對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到二次回歸方程的響應(yīng)曲面圖,見圖8。由圖8可知,底物添加量和酶解時間具有交互作用,隨著底物添加量的增大FOs的生成量有明顯的增加,隨著酶解作用時間的增加FOs生成量略有減少。

通過數(shù)據(jù)分析,雙酶混合制備FOs的最佳工藝條件為:纖維素酶添加比例69.73%,混合酶添加量15.68 g/L,酶解時間1.0 h,底物添加量100 g/L,在此條件下,FOs的產(chǎn)量為1010.04 μmol/L。考慮到可操作性,將條件調(diào)整為纖維素酶添加比例70%,混合酶添加量15.7 g/L,酶解時間1.0 h,底物添加量100 g/L。進行驗證實驗得到FOs的產(chǎn)量為1008.43 μmol/L,與理論值基本相符,進一步驗證了回歸模型的可靠性,因此響應(yīng)面法對雙酶混合制備FOs條件優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

經(jīng)酶解FOs生成量的測定及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)觀察,明確了外源酶酶解制備FOs需要在纖維素酶和木聚糖酶的共同作用下效果最佳,基于此,通過單因素與響應(yīng)面優(yōu)化相結(jié)合的方法確定了混合酶酶解玉米皮渣制備FOs的最佳條件為混合酶中纖維酶添加比例為70%、酶解時間1 h、酶添加量15.7 g/L和底物添加量100 g/L,在此條件下,FOs產(chǎn)量可達(dá)1008.43 μmol/L。

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Study on production of feruloyl oligosaccharides by compound enzymatic hydrolysis from maize bran

DU Juan1,YOU Xue-jiao2,3,4,XIE Chun-yan1,5,*,HOU Xiao-qiang1,5,QIAO Jie1,5,GUO Hong-zhen1,5,WU Zhi-yan1,5

(1.College of Life Sciences,Langfang Teachers University,Langfang 065000,China; 2.Microbiology Institute of Guangdong Province,Guangzhou 510000,China; 3.State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China,Guangzhou 510000,China; 4.Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application,Guangzhou 510000,China; 5.Applied Technology Researcher Center of Medicinal and Edible Mushroom of Higher Education School of Hebei Province,Langfang 065000,China)

Production of feruloyl oligosaccharides by enzymatic hydrolysis form maize bran was investigated in this paper. In order to explore the reason that influenced the yield of feruloyl oligosaccharides,maize bran was hydrolyzed by different enzymes and the cell wall of maize bran was also determined. In the end,the optimal enzyme hydrolysis condition was optimized by single factor and response surface experiment. Results showed that the mixture of cellulase and xylanase could improve maize bran cell wall dissolving,and could improve the yield of feruloyl oligosaccharides. The optimal condition for FOs production was mixture enzyme addition of 15.7 g/L,which was consist with 70% cellulase addition,and the maize bran material addition was at 100 g/L,and hydrolysis for 1 h,under this condition,the yield of FOs was 1008.43 μmol/L. This result provides theoretical basis for FOs production by compound enzymatic hydrolysis from maize bran.

maize bran;feruloyl oligosaccharides;compound enzymatic hydrolysis;hydrolysis condition

2016-09-19

杜娟(1983-),女,碩士,實驗師,研究方向:生物化學(xué),E-mail:dujuan0203@163.com。

*通訊作者:解春艷(1983-),女,博士,副教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:xcy8046@163.com。

河北省科技計劃項目(15222913);河北省教育廳優(yōu)秀青年基金項目(YQ2013027);河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(Z2014049);河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心項目(YF201411-321);河北省高等學(xué)校遺傳學(xué)重點發(fā)展學(xué)科項目(201221);廊坊師范學(xué)院微生物學(xué)重點學(xué)科項目(201501);廊坊師范學(xué)院博士基金項目(LSLB201407)。

TS210.1

A

1002-0306(2017)08-0193-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.029