（勃林格殷格翰國(guó)際貿(mào)易有限公司，北京 100027）

流行性2型PRRSV強(qiáng)毒株的廣譜中和抗體研究

陳 鍇，黃亞平（譯）；徐大為，朱連德（校）

（勃林格殷格翰國(guó)際貿(mào)易有限公司，北京 100027）

由于疫苗需要提供有效的交叉保護(hù)力對(duì)抗變異較大的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）毒株，獲得可預(yù)測(cè)PRRSV免疫保護(hù)力的評(píng)估指標(biāo)可促進(jìn)群體管理改善和疫苗研發(fā)項(xiàng)目的開展。中和抗體在動(dòng)物和人的抗病毒免疫中起著關(guān)鍵作用，故通過特異性抗體中和病毒感染性的中和效力是免疫保護(hù)的常見預(yù)測(cè)因子。然而，由于病毒中和作用不是抗PRRSV免疫應(yīng)答的標(biāo)志性和共同特征，它們抗PRRSV的保護(hù)作用被打了折扣。例如，眾多關(guān)于生長(zhǎng)豬的研究表明，PRRSV感染后數(shù)周至數(shù)月無中和抗體產(chǎn)生或以低于1/8滴度的低效價(jià)存在。目前，在PRRSV強(qiáng)毒暴發(fā)或有重復(fù)血清接種史的母豬群體中發(fā)現(xiàn)了具有廣譜反應(yīng)能力的高滴度中和抗體。進(jìn)一步的研究顯示，這些具有交叉反應(yīng)能力的中和抗體是所有受檢豬場(chǎng)母豬的共同特征，這些現(xiàn)象出現(xiàn)在免疫場(chǎng)或野毒感染場(chǎng)，與胎次無關(guān)，交叉反應(yīng)譜差異大，且在相同豬場(chǎng)的不同母豬個(gè)體中存在較大變化。例如，在一個(gè)常規(guī)接種疫苗豬場(chǎng)的所有母豬（N=20）均對(duì)VR2332具有同源血清中和活性，滴度范圍為15～256；90%的母豬對(duì)MN184具有滴度范圍為4～60的異源中和活性；20%的母豬對(duì)1型PRRSV SDEU具有滴度范圍為4～8的異源中和活性。在使用中和反應(yīng)檢測(cè)高毒力毒株P(guān)RRSV174時(shí)，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)特征不同于所有其他病毒。在細(xì)胞系中加入相同拷貝RNA的情況下，使用TCID50檢測(cè)顯示毒株MW174的感染活性比其他毒株低約1 000倍。由于TCID50是基于細(xì)胞病變效應(yīng)，提示這種高毒力毒株家族可延遲或阻斷細(xì)胞裂解從而獲得更好的生長(zhǎng)。來自兩個(gè)MW174毒株病毒暴發(fā)群體中的所有10頭母豬的血清均具有針對(duì)VR2332、MN184、MW174、NC134和1型SDEU的中和活性。在22%的樣品（N=50，每種病毒10個(gè)血清樣品）中和反應(yīng)滴度效價(jià)大于256，由于廣譜中和反應(yīng)血清可顯著降低異源PRRSV的感染，交叉抗體中和反應(yīng)活性非常重要。這些發(fā)現(xiàn)支持了PRRSV交叉保護(hù)的理論，表明免疫應(yīng)答相關(guān)的保守表位存在于1型和2型PRRSV毒株中。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

血清樣品收集于美國(guó)明尼蘇達(dá)州和北卡羅來納州的獨(dú)立商品代母豬群，這些種群被PRRSV毒株多次感染，感染途徑為疫苗免疫、自然感染或血清接種。血清樣品采集自：被多次不同毒力毒株感染的淘汰母豬、免疫過疫苗但未被強(qiáng)毒力毒株感染過的不同胎次母豬；使用強(qiáng)毒力PRRSV毒株對(duì)后備母豬進(jìn)行可控而系統(tǒng)性的馴化，實(shí)驗(yàn)性感染VR2332毒株后202 d，及來自具有較高病毒中和滴度的商品母豬群。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

通過灌洗各日齡動(dòng)物肺臟，但主要從5～6周齡保育豬收集豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）。 用含有50 μg/mL慶大霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行灌洗，并將紅細(xì)胞在無菌水中洗脫。使用70 μm過濾器過濾分離物，并重懸于采用40%RPMI培養(yǎng)基，50%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亞砜（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）配置的溶液中，冷凍保存。用RPMI培養(yǎng)基（CellgroMediatech，Manassas，VA）培養(yǎng)PAM，并添加丙酮酸鈉、硫酸慶大霉素、非必需氨基酸、HEPES緩沖液和5%FBS（Sigma，St．Louis，MO）。使用MEM培養(yǎng)基（Gibco，Grand Island NY）培養(yǎng)猿猴腎上皮MARC145細(xì)胞，并添加碳酸氫鈉、非必需氨基酸、HEPES緩沖液（Sigma，St．Louis，MO）、硫酸慶大霉素（CellgroMediatech，Manassas，CA）和10%FBS（Sigma，St．Louis，MO）。

3 PRRSV毒株

PRRSV分離株VR2332，MN184，SDEU，MW174，NC134接種并收獲于MARC145細(xì)胞，通過監(jiān)測(cè)96孔板中MARC145細(xì)胞的病變效應(yīng)，使用Reed＆Muench方法計(jì)算每個(gè)分離株的半數(shù)感染量（TCID50）。從兩個(gè)強(qiáng)毒力PRRSV流行毒株MN0111和MN1211上獲得了其ORF5的核苷酸序列信息（編碼糖蛋白5），但是并未分離到病毒。使用CLC Sequence Vie wer version 6．8．2（CLC bio/Qiagen，Cambridge，MA）對(duì)實(shí)驗(yàn)室改編毒株VR2332，疫苗株，MN184，1型PRRSV病毒 LelystadVirus (LV)株和1型田間分離株SDEU進(jìn)行序列比對(duì)分析，并在使用Geneious R6Tree Builder（Biomatters Ltd．，Auckland，New Zealand，版本6．1．7）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，bootstrap設(shè)置為100，不使用外參基因。同時(shí)使用Geneious R6分析不同毒株之間同源性差異百分比。

4 基于ELISA的血清中和抗體測(cè)定

以如下方法進(jìn)行PRRSV血清中和（SN）測(cè)定。將96孔板用25 μg/mL聚乙烯亞胺（Sigma-Aldrich，St．Louis，MO）處理，以6×104個(gè)細(xì)胞/孔接種PAM并培養(yǎng)48 h，或以6×103個(gè)細(xì)胞/孔接種MARC145細(xì)胞。將血清樣品熱滅活（56 ℃，30 min）并使用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)稀釋。將稀釋后的血清與等體積的5×104TCID50/ mL PRRSV病毒在非貼壁96孔板中混合，并孵育1 h（37 ℃，5%CO2）。將含有5 000 TCID50的血清-病毒混合物轉(zhuǎn)移至細(xì)胞孔中，在37℃下吸附1 h。PBS洗滌細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，并進(jìn)一步溫育24～48 h。使用含有3．7%甲醛（Sigma-Aldrich，St．Louis，MO）的PBS固定，隨后洗滌，透化（PBS中的0．1%Triton X-100（Sigma-Aldrich，St。Louis，MO）），并封閉1 h（5%脫脂奶粉PBS）。使用含5%脫脂奶粉的PBS以1：10 000稀釋抗PRRSV核衣殼蛋白的單克隆抗體SR30-A（Rural Technologies，Brookings，SD），并以100 μL /孔加入細(xì)胞孔，孵育1 h。以100 μL/孔加入，以1：10 000稀釋羊抗鼠HRP（H+L），反應(yīng)1 h。加入100 μLTMB（KirkegaardPerry Laboratories，Gaithersburg，MD）過氧化物酶底物進(jìn)行顯色，作用15 min。最后用100μL的1M磷酸終止反應(yīng)，平板使用Millermax酶標(biāo)儀（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）于450nm進(jìn)行讀數(shù)。在每個(gè)稀釋度下的病毒抑制比例與扣除空白背景吸光度的陽性病毒感染對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。計(jì)算出能保護(hù)50%細(xì)胞孔不產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價(jià)。

5 結(jié)果與討論

通常認(rèn)為，PRRSV感染后體液免疫應(yīng)答較弱，中和抗體水平效價(jià)低且出現(xiàn)晚，出現(xiàn)在感染后期急性病毒血癥已經(jīng)減弱時(shí)，或者根本不出現(xiàn)。目前這些類型的研究主要基于幼齡動(dòng)物的攻毒實(shí)驗(yàn)。這些研究還發(fā)現(xiàn)，中和抗體在淋巴組織的持續(xù)性感染過程中效價(jià)也未提高至更高水平。但是，這些中和反應(yīng)實(shí)驗(yàn)并未在成年豬上進(jìn)行研究，成年豬經(jīng)歷多次感染或抗原接觸，并隨著動(dòng)物年齡的增長(zhǎng)和時(shí)間推移可能會(huì)發(fā)生免疫變化。我們假設(shè)有PRRSV感染史的成年豬的中和抗體反應(yīng)是不同的，首先需要從有PRRSV暴發(fā)史的商品代母豬場(chǎng)中分離并檢測(cè)PRRSV中和抗體。

圖1 5個(gè)從174 RFLP型PRRSV暴發(fā)場(chǎng)隨機(jī)抽取血清樣品的廣譜中和反應(yīng)滴度

在兩個(gè)場(chǎng)的多胎次母豬中發(fā)現(xiàn)了高均勻度的高效價(jià)中和抗體，此中和抗體可與2型毒株VR2332反應(yīng)，未知是否接觸相關(guān)疫苗株Ingelvac MLV。2個(gè)群體間最大中和作用是相同的，群體1 中50%中和效力的滴度為512，最高個(gè)體值達(dá)2 187，群體2中50%中和效力滴度為81。中和活力與劑量相關(guān)，曲線結(jié)構(gòu)在兩個(gè)群體間也類似。

南達(dá)科他州立大學(xué)Eric Nelson應(yīng)用目前廣泛使用的熒光聚焦中和實(shí)驗(yàn)（F lurescent Focus Neutralization， FFN）對(duì)來自一個(gè)群體的5個(gè)血清樣品使用多個(gè)1型和2型PRRSV分離株進(jìn)行檢測(cè)。血清與90%的2型PRRSV毒株發(fā)生反應(yīng)，滴度為16～56；并意外發(fā)現(xiàn)可與90%的I型PRRSV發(fā)生反應(yīng)，滴度大于80。廣譜中和活性與胎次并無相關(guān)性。高滴度中和抗體也在每月使用PRRSV強(qiáng)毒株馴化的后備母豬上發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明：廣譜中和抗體可存在于各種不同生產(chǎn)日齡和不同PRRSV感染群體，包括生長(zhǎng)豬、成年豬、強(qiáng)毒力感染和弱毒疫苗免疫。

中和抗體在同一豬場(chǎng)和有感染史豬群間變異系數(shù)均較大。例如，在一個(gè)常規(guī)接種疫苗豬場(chǎng)的所有母豬（N=20）均對(duì)VR2332具有同源血清中和活性，滴度范圍為15～256；90%的母豬對(duì)MN184具有滴度范圍為4～60的異源中和活性；20%的母豬對(duì)MN184具有滴度范圍為4～60的異源中和活性；20%的母豬對(duì)1型PRRSV SDEU具有滴度范圍為4～8的異源中和活性。在使用中和反應(yīng)檢測(cè)強(qiáng)毒株MW174時(shí)，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)特征不同于所有其他病毒。在細(xì)胞系中加入相同拷貝RNA的情況下，使用TCID50檢測(cè)顯示毒株MW174的感染活性比其他毒株約低1 000倍。由于TCID50是基于細(xì)胞病變效應(yīng)，提示這種高毒力毒株家族可延遲或阻斷細(xì)胞裂解從而獲得更好的生長(zhǎng)。從兩個(gè)174毒株暴發(fā)場(chǎng)收集的10母豬樣品顯示，對(duì)VR2332、MN184、MW174、NC134和1型毒株SDEU均有中和反應(yīng)活性；22%的樣品（N=50，每種病毒10個(gè)血清樣品）中和反應(yīng)滴度大于256。圖1顯示了同一豬場(chǎng)中5頭不同母豬血清對(duì)上述病毒的中和反應(yīng)滴度。

由于廣譜中和反應(yīng)血清可顯著降低異源PRRSV的感染，因此交叉中和反應(yīng)活性非常重要。這些發(fā)現(xiàn)支持了PRRSV交叉保護(hù)的基礎(chǔ)理論，表明免疫相關(guān)的保守表位存在于1型和2型PRRSV中。

注：本文選自2017-AASV論文集

2017-03-08）