李志芳 秦嶺 賀若曦 胡新月 湯渝玲 胡成平 馮俊濤

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·論著·

神經(jīng)生長(zhǎng)因子通過(guò)c-fos促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞NK-1R表達(dá)

李志芳1秦嶺1賀若曦1胡新月1湯渝玲2胡成平1馮俊濤1

目的探討神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)通過(guò)c-fos影響支氣管上皮細(xì)胞NK-1R的表達(dá)。方法 以人支氣管上皮細(xì)胞(NHBEC)為研究對(duì)象，通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體將c-fos siRNA 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，然后用NGF干預(yù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)五組：對(duì)照組、NGF干預(yù)組、NGF+c-fos siRNA組、NGF+空白脂質(zhì)體組、NGF+非特異性dsRNA組。轉(zhuǎn)染12 h后，用NGF干預(yù)60 min，采用 Western blot法測(cè)定c-fos蛋白表達(dá)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和RT-PCR從蛋白和mRNA水平觀察細(xì)胞中NK-1R的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比，NGF組c-fos蛋白、NK-1R蛋白和NK-1RmRNA表達(dá)均明顯增加(P<0.01)；與NGF組比，NGF+c-fos siRNA組中c-fos蛋白、NK-1R蛋白和NK-1RmRNA表達(dá)均明顯減少(P<0.01)，而NGF組、NGF+空白脂質(zhì)體組、NGF+非特異性dsRNA組之間的c-fos蛋白、NK-1R蛋白和NK-1RmRNA表達(dá)無(wú)顯著差異。結(jié)論NGF可通過(guò)c-fos促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞中NK-1R的表達(dá)，介導(dǎo)哮喘神經(jīng)源性炎癥，RNAi技術(shù)可以減少NGF誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞c-fos蛋白及NK-1R的表達(dá)。

支氣管哮喘； 神經(jīng)生長(zhǎng)因子； c-fos； NK-1R

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)是參與調(diào)節(jié)哮喘中神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)失衡機(jī)制的重要因素[1-2]。哮喘發(fā)病過(guò)程中，NGF刺激神經(jīng)節(jié)使感覺(jué)神經(jīng)肽(sensory nerve peptide, SP)合成增多，隨后SP由神經(jīng)突觸分泌并作用于氣道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥的產(chǎn)生。此外，在NGF作用下，分布在支氣管上皮細(xì)胞表面的SP的主要受體NK-1R表達(dá)也明顯增強(qiáng)[3-5]。絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)通路是迄今為止研究最為透徹的一條通路，它參與了支氣管哮喘發(fā)病的多個(gè)關(guān)鍵過(guò)程。本研究組前期的研究結(jié)果提示NGF可上調(diào)支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)源性炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Ras/MAPK/c-fos的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)哮喘神經(jīng)源性炎癥[6]。而在對(duì)大鼠紋狀體內(nèi)源性鎮(zhèn)痛機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，c-fos與NK-1R的表達(dá)量呈正相關(guān)[7]。因此，本研究中我們選定下游信號(hào)分子c-fos作為研究靶點(diǎn)，構(gòu)建特異性siRNA抑制c-fos表達(dá)，從正反兩方面觀察NGF是否通過(guò)c-fos影響支氣管上皮細(xì)胞NK-1R的表達(dá)。為探索NGF參與的哮喘神經(jīng)源性機(jī)制提供理論依據(jù)和研究線索。

材料與方法

一、 材料與試劑

siRNA合成試劑盒(美國(guó)Ambion公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hycolone公司)；Pgenesil-1質(zhì)粒表達(dá)載體(武漢晶賽生物工程公司)及酶類：BamHI、HindⅢ、T4 DNA Ligase、EcoRI(New England Biolabs)。線性化Pgenesil-1質(zhì)粒表達(dá)載體及酶類：T4 DNA Ligase、BamHI、HindⅢ、SalI、PstI、EcoRI、XbaI、SacI(NEB公司)。siRNA熒光素標(biāo)記試劑盒及RNaseZap(美國(guó)Ambion公司)；人支氣管上皮細(xì)胞株(NHBEC)(湖南遠(yuǎn)泰生物工程公司)；大腸桿菌(DH5α)(武漢晶賽生物工程公司)；HindⅢ Marker、EcoT-14 I Marker、DL2000 Marker(New England Biolabs)；NK-1R的引物和擴(kuò)增β-Actin(武漢伯杰生物工程公司)，rTaq、dNTP、Oligo dT、Trizol(New England Biolabs公司)；PD98059、AG490、NGF及 PMA (美國(guó)Sigma公司)；Western blot用兔抗人Anti-c-fos抗體、Anti-GAPDH，羊抗兔IgG(Santa Cruz Biotechnology公司)，ECL Western blot檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Santa Cruz公司)；免疫組化用兔抗人Anti-NK-1R抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，羊抗兔IgG(武漢博士德生物有限公司)，SABC免疫組化試劑盒。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng): 人支氣管上皮細(xì)胞株(normal human bronchial epithelial cells, NHBEC)用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含100 μ/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)在37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，隔天換液，顯微鏡下查看細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至基質(zhì)的70%～80%表面面積時(shí)予以傳代。將一部分細(xì)胞傳代至六孔板中培養(yǎng)，剩下的細(xì)胞繼續(xù)于50 cm3培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至基質(zhì)的75%表面面積時(shí)進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)。

2. 小干擾RNA(siRNA)的確定及合成: 通過(guò)Ambion公司提供的工具把特異針對(duì)人bcl xL基因的siRNA靶序列挑選出來(lái),依據(jù)Tuschl設(shè)計(jì)siRNA的方法,選定siRNA序列如下：CTG CTT ACA CGT CTT CCT T，再使用沉默小干擾RNA合成試劑盒合成siRNA。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒配套的工作手冊(cè)進(jìn)行。將體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA根據(jù)配套手冊(cè)中的方法用紫外分光光度計(jì)定量，具體如下：①將少量siRNA樣品和三羥甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸電泳緩沖液按1︰25比例混合,隨后用紫外分光光度計(jì)測(cè)量3次A260吸光度值,取平均數(shù)；②用公式siRNA濃度(μmol/L)=檢測(cè)液A260×1 000/143計(jì)算siRNA濃度；③用熒光素標(biāo)記，標(biāo)記后，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3. siRNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染： 以脂質(zhì)體為載體，將沉默c-fos表達(dá)的特異性siRNA轉(zhuǎn)染至NHBEC。采用0.3%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞5 min后，DMEM培養(yǎng)液終止，以離心半徑8 cm，1 000 r/min 離心10 min后棄上清，用適量PBS重懸細(xì)胞。通過(guò)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)來(lái)調(diào)整細(xì)胞濃度,將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶。在含10%胎牛血清DMEM中，37 ℃、5% CO2條件下,培養(yǎng)至18%～60%的融合率。把轉(zhuǎn)染液配制的陽(yáng)離子脂質(zhì)體液分別與siRNA和dsRNA(非特異性)混合，使脂質(zhì)體充分包裹，再加入細(xì)胞中轉(zhuǎn)染20 h。

4. 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率: 將熒光素標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染至NHBEC內(nèi)，當(dāng)終濃度達(dá)到50 nmol/L時(shí)在避光條件下孵育48 h，隨后用4 ℃ PBS洗滌3次，消化收集細(xì)胞，涂片，通過(guò)熒光顯微鏡查看綠色熒光細(xì)胞。

5. 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞干預(yù): 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合達(dá)50%～80%，將培養(yǎng)基換成無(wú)血清DMEM，并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分組和干預(yù)如下：①對(duì)照組：加入500 μl無(wú)血清DMEM；②NGF組：加入100 ng/ml NGF干預(yù)60 min；③NGF+dsRNA組：加入非特異性dsRNA脂質(zhì)體復(fù)合物500 μl預(yù)刺激后，再加入100 ng/ml NGF干預(yù)60 min后收獲細(xì)胞；④NGF+siRNA組：加入500 μl c-fos siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物預(yù)刺激后，再加入100 ng/ml NGF干預(yù)60 min；⑤NGF+空白脂質(zhì)體組：加入250 μl脂質(zhì)體稀釋液及25 μl無(wú)血清DMEM預(yù)刺激后，再加入100 ng /ml NGF干預(yù)60 min。每組3個(gè)復(fù)孔，顯微鏡下查看細(xì)胞形態(tài)變化。提取細(xì)胞總蛋白及RNA備用。

6. 應(yīng)用western-blot測(cè)定細(xì)胞c-fos蛋白含量: 經(jīng)上述分組干預(yù)后，將NHBEC刮下，以離心半徑8 cm，1 000 r/min 離心10 min，隨后將細(xì)胞移至EP管中。依照細(xì)胞數(shù)加裂解液裂解30 min(冰上進(jìn)行)。4 ℃，以離心半徑8 cm 13 000 r/min 離心20 min，取上清，用Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。200 V電壓下12%聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h。100 V下電轉(zhuǎn)移1 h，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h。兔抗人c-fos抗體(1︰500稀釋)孵育2 h，羊抗兔IgG(1︰1 000稀釋)孵育1 h，配置ECL試劑盒工作液，顯示蛋白條帶，定影。顯帶的X線片在凝膠成像分析系統(tǒng)上分析，得出每條帶的積分光密度(integral optical density, IOD)值。

7. RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NK-1R mRNA的表達(dá): 用Trizol提取細(xì)胞總RNA，采用2 μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一條互補(bǔ)DNA(cDNA)，再以此為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)操作。NK-1R引物序列：上游 5′-GGG ACT CCT CTG ACC GCT AC-3′；下游 5′-TCC AGG CGG CTG ACT TTG TA-3′，片段長(zhǎng)度376 bp (753～1 128)。β-Actin引物序列：上游 5′-CCT TCC TGG GCA TGG AGT C-3′；下游 5′-GAG GAG CAA TGA TCT TGA TCT TC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度204 bp(867～1 070)。反應(yīng)條件：95 ℃變性10 min；94 ℃ 30 s，70 ℃(-2 ℃/Cycle)30 s，72 ℃ 30 s，5個(gè)循環(huán)后，再94 ℃ 30 s，55 ℃(+0.2 ℃/Cycle)30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。

8. 間接法(免疫細(xì)胞化學(xué))檢測(cè)NK-1R在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)： 細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗滌3次，5 min/次，然后加入1︰200一抗(Anti-NK-1R)，4 ℃過(guò)夜。PBS洗滌3次，5 min/次，滴加1︰100二抗，37 ℃溫箱中孵育30 min。PBS洗滌3次，5 min/次，DAB顯色試劑進(jìn)行顯色，蒸餾水洗滌3次，3 min/次，50 %緩沖甘油(將純甘油與0.5 mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液按照1︰1體積比充分混勻)封片，200倍顯微鏡下觀察。采用IPP6.0軟件分析各組NK-1R的表達(dá)強(qiáng)度：以細(xì)胞胞漿或核中出現(xiàn)棕黃色產(chǎn)物為陽(yáng)性反應(yīng)。免疫組化結(jié)果采用定性分析[8]，陰性(-)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5 %；弱陽(yáng)性(+)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%；中度陽(yáng)性(++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、細(xì)胞的一般情況

光鏡下顯示NHBEC轉(zhuǎn)染各組試劑后，生長(zhǎng)活躍，細(xì)胞形態(tài)正常。siRNA轉(zhuǎn)染組以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)清晰的綠色熒光為轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上。

二、Western-blot測(cè)定細(xì)胞c-fos蛋白含量

與對(duì)照組相比，NGF干預(yù)后c-fos蛋白表達(dá)明顯增加。如圖中顯示NGF組、NGF+dsRNA組、NGF+空白脂質(zhì)體組的c-fos蛋白表達(dá)均明顯強(qiáng)于對(duì)照組，P<0.01；與單純NGF干預(yù)組相比，NGF+siRNA組的c-fos表達(dá)水平明顯減少(P<0.01)。而dsRNA和脂質(zhì)體組的c-fos表達(dá)量與單純NGF干預(yù)組無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖1，表1。

圖1 Western-blot 半定量檢測(cè)c-fos蛋白表達(dá)；注：1和2：NGF 組；3和4：NGF+siRNA組；5和6：對(duì)照組

表1 Western-blot 半定量檢測(cè)c-fos蛋白表達(dá)

注：與對(duì)照相比aP<0.01；與NGF組相比bP<0.01

三、RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NK-1R mRNA的表達(dá)

與對(duì)照組比，NGF作用1 h后，NK-1R mRNA表達(dá)水平顯著增高，圖中可見(jiàn)NGF組、NGF+dsRNA組、NGF+空白脂質(zhì)體組的NK-1R mRNA表達(dá)均明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.01)。c-fos siRNA可抑制NGF誘導(dǎo)NHBEC表達(dá)NK-1RmRNA，即NGF+siRNA組的 NK-1RmRNA 表達(dá)水平要明顯低于 NGF 干預(yù)組(P<0.01)。而dsRNA和脂質(zhì)體均無(wú)此抑制作用，見(jiàn)圖2。

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察NK-1R表達(dá)；注：A: 對(duì)照組 (SABC×200)；B: NGF組 (SABC×200)；C：NGF+空白脂質(zhì)體組(SABC×200)；D：NGF+siRNA組 (SABC×200)；E：NGF+dsRNA組 (SABC×200)

圖2 RT-PCR半定量檢測(cè)NK-1R mRNA表達(dá)；注：與對(duì)照相比*P<0.01；與NGF組相比#P<0.01

四、間接法(免疫細(xì)胞化學(xué))檢測(cè)NK-1R在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

NK-1R陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，以胞漿表達(dá)為主。對(duì)照組無(wú)明顯的NK-1R表達(dá)，為陰性反應(yīng)，NGF組及NGF+空白脂質(zhì)體組為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，NGF+非特異dsRNA組呈陽(yáng)性反應(yīng)，而NGF+siRNA組表達(dá)明顯減少，為弱陽(yáng)性反應(yīng)。提示NGF可以刺激NHBEC表達(dá)NK-1R，而c-fos siRNA可以抑制NGF對(duì)NHBEC內(nèi)NK-1R表達(dá)的刺激作用，見(jiàn)圖3。

討 論

支氣管哮喘是肺部最常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制與氣道炎癥，氣道高反應(yīng)性及氣道重塑相關(guān)[9-12]。支配氣道的感覺(jué)神經(jīng)及其相關(guān)營(yíng)養(yǎng)因子與氣道炎癥的形成密切相關(guān)[13-15]。目前已知與哮喘密切相關(guān)的感覺(jué)神經(jīng)肽有P物質(zhì)(substance P, SP)、神經(jīng)激肽A(neurokinin A, NKA)、神經(jīng)激肽B(neurokinin B, NKB)等[16-17]，它們通過(guò)與相應(yīng)的受體結(jié)合而促發(fā)氣道神經(jīng)源性炎癥[18]。

既往研究證實(shí)，哮喘大鼠肺組織中NGF明顯增多，并參與氣道源性炎癥[19]。在NGF的作用下，SP及其主要受體 NK-1R的表達(dá)也顯著增多。在本研究中，NGF對(duì)NK-1R表達(dá)的促進(jìn)作用再次得到證實(shí)。而在對(duì)大鼠紋狀體內(nèi)源性鎮(zhèn)痛機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，c-fos與NK-1R的表達(dá)量呈正相關(guān) ,依據(jù)以上線索，我們推測(cè)NGF可能是通過(guò)活化MAPK通路中的c-fos信號(hào)分子，進(jìn)而促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞中NK-1R的表達(dá)的，并構(gòu)建siRNA阻斷c-fos表達(dá)，從反方向?qū)ι鲜黾僬f(shuō)加以驗(yàn)證。

本研究觀察到，經(jīng)NGF干預(yù)后，NHBEC中c-fos蛋白的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，這與我們之前的研究結(jié)果基本一致[6]，同時(shí)RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果提示NGF可以促進(jìn)NK-1R在支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)，這說(shuō)明NGF不但能通過(guò)促進(jìn)P物質(zhì)的釋放[20]，還能刺激其受體在支氣管上皮細(xì)胞的表達(dá)來(lái)參與氣道神經(jīng)源性炎癥。為明確NGF是否通過(guò)c-fos蛋白來(lái)調(diào)控NK-1R的表達(dá)，我們用siRNA沉默c-fos基因表達(dá)，結(jié)果表明，當(dāng)c-fos基因未阻斷時(shí)，NGF作用后NK-1R表達(dá)明顯增強(qiáng)，而用siRNA阻斷c-fos基因后，NGF對(duì)NK-1R表達(dá)的促進(jìn)作用受到抑制。提示NGF對(duì)NK-1R表達(dá)的促進(jìn)作用是通過(guò)c-fos蛋白實(shí)現(xiàn)的。已知c-fos是Ras/MAPK通路中的重要下游蛋白，因此NGF對(duì)NK-1R表達(dá)的促進(jìn)作用很可能是通過(guò)活化Ras/MAPK/c-fos信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NGF可通過(guò)c-fos促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞中NK-1R的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)哮喘神經(jīng)源性炎癥。應(yīng)用RNAi技術(shù)可以減少NGF誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞c-fos蛋白及NK-1R的表達(dá)。本研究結(jié)論為哮喘的機(jī)制研究和治療靶點(diǎn)提供了新的線索。

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(本文編輯：張大春)

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Nerve growth factor stimulates the expressions of NK-1R in bronchial epithelial cells via c-fos

LiZhifang1,QinLing1,HeRuoxi1,HuXinyue1,TangYuling2,HuChengping1,FengJuntao1.

1DepartmentofRespiratoryMedicine,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstHospitalofChangsha,Changsha410005,China

HuChengping,Email：huchengp28@126.com

Objective To investigate whether the effect of nerve growth factor on NK-1R expression of bronchial epithelial cells is via c-fos. Methods Human bronchial epithelial cells (NHBEC) were taken as the research object, the c-fos siRNA was transected into cells through the positive ion fat plastid, and then the NGF intervention was carried on. The control group, NGF intervention group, NGF+c-fos siRNA group, NGF+ liposomes group, NGF+non-specific dsRNA group were decided. After trans-infection for 12 h and then intervention for 60min, the protein expression of c-fos was detected by western-blot. The protein and mRNA expression of NK-1R was determined by RT-PCR and immune cell chemical definite quality respectively. Results Compared with the control group, the expressions of c-fos protein, NK-1R protein and NK-1RmRNA were significantly increased in NGF group (P<0.01); compared with NGF group, the expressions of c-fos protein, NK-1R protein and NK-1RmRNA were significantly reduced in NGF+c-fos siRNA group (P<0.01), NGF intervention group, NGF+liposomes group, NGF+ non-specific dsRNA group had no significant difference in the expression of them. Conclusion NGF stimulates the expressions of NK-1R in bronchial epithelial cells via c-fos. and then mediate neurogenic inflammation of asthma. RNAi could reduced the of c-fos protein and NK-1R induced by NGF in human bronchial epithelial cells.

Bronchial asthma; Nerve growth factor; C-fos; NK-1R

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.007

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81400022,81270080)

410008 長(zhǎng)沙，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院呼吸科1410005 長(zhǎng)沙，長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院呼吸科2

胡成平，Email：huchengp28@126.com

R563

A

2017-01-17)