劉振東，岳 筱，王 波，薛 蓓，王強鋒

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000； 2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏拉薩 850032； 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川成都 610061)

不同產(chǎn)區(qū)青稞根部可培養(yǎng)內(nèi)生固氮菌的多樣性研究

劉振東1，岳 筱1，王 波2，薛 蓓1，王強鋒3

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000； 2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏拉薩 850032； 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川成都 610061)

為認識青稞內(nèi)生固氮菌群落組成，豐富內(nèi)生固氮菌資源，明確產(chǎn)地對青稞內(nèi)生固氮菌多樣性的影響，本研究利用純培養(yǎng)技術(shù)分別對在拉薩、林芝、日喀則栽培的藏青2000根部內(nèi)生固氮菌進行分離、純化，并測定各菌株的固氮酶活性及高固氮酶活性菌株的溶磷、溶鉀及產(chǎn)IAA特性，最后，通過16S rDNA基因測序和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹研究了高固氮酶活性菌株的分類學(xué)地位。結(jié)果顯示，通過Ashby培養(yǎng)基分離、純化得到內(nèi)生固氮菌37株，其中，具有高固氮酶活性的11株，占總分離菌株27%，有6株菌株具有分泌IAA的能力，2株具有溶鉀能力，1株具有溶磷能力。16S rDNA測序結(jié)果表明，11株高固氮酶活性的菌中，有5株菌屬于Bacillus，為優(yōu)勢菌屬，其余菌株分別屬于Gemmatimonas、Sphingomonas、Devosia、Agrobacterium、Mesorhizobium和Burkholderia。

青稞；根；內(nèi)生固氮菌；多樣性

氮素是植物生長發(fā)育過程中需求量最大的養(yǎng)分，也是植物生態(tài)系統(tǒng)中最常見的限制因子[1]。雖然空氣中含有大量的氮元素，但不能被植物直接利用，必須通過以植物為寄主的固氮微生物轉(zhuǎn)化后才能被利用[2-4]。固氮微生物的宿主范圍十分廣泛，相關(guān)學(xué)者已從小麥、玉米、高粱等多種農(nóng)作物上分離并鑒定得到了多種內(nèi)生固氮菌，且不同種植區(qū)域、不同農(nóng)作物品種的內(nèi)生固氮菌種屬及豐度存在較大差異[5]。植物內(nèi)生固氮菌是指能夠定殖在植物體內(nèi)、與宿主植物聯(lián)合固氮、且對宿主無害的微生物，是生物肥料的良好資源。

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.)是禾本科大麥屬的禾谷類作物，因其內(nèi)外穎殼分離，籽粒裸露，故又稱為裸大麥[6]。青稞是藏族傳統(tǒng)主食糌粑的主要原料，同時又是宗教節(jié)日中藏族人民以示祝福的祭示物，有著不可替代的物質(zhì)及精神雙重屬性，所以青稞的生產(chǎn)歷來受到國家和西藏自治區(qū)人民政府的高度重視。近年來，人們逐漸認識到青稞“三高兩低”(高蛋白、高可溶性纖維元素、高維生素和低脂肪、低糖)的營養(yǎng)價值，其豐富的β-葡聚糖是降血脂、降膽固醇和預(yù)防心血管疾病的佳品[7-8]。因此，青稞除傳統(tǒng)食用形式外，已逐漸被開發(fā)成青稞餅干、青稞米餅等多種形式的商品。隨著青稞不斷外銷和加工成各類食品，對西藏青稞生產(chǎn)提出了更高的要求。

本研究通過純培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)手段對西藏日喀則、拉薩、林芝栽培的主要青稞品種藏青2000的根部內(nèi)生固氮菌進行分離及遺傳多樣性分析，并對固氮菌的固氮活性進行初步研究，以期揭示青稞根部內(nèi)生固氮菌種群特征，為豐富內(nèi)生固氮菌種質(zhì)資源庫、開發(fā)利用青稞內(nèi)生固氮菌資源及研制更加安全環(huán)保的生物肥料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 采樣時間及地點

2014年7月13日分別在海拔3 658 m的拉薩市西藏自治區(qū)農(nóng)科院青稞試驗田、海拔2 860 m的林芝市西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實習(xí)農(nóng)場青稞試驗田和海拔3 836 m的日喀則市農(nóng)科所青稞栽培基地取青稞品種藏青2000樣品，各樣點土壤肥力中等，青稞生長良好。

1.1.2 采樣方法

于灌漿期在試驗田約300 m2區(qū)域內(nèi)采用對角線5點法采集樣品，每點采青稞整株3株，每個小區(qū)采15株；搖晃去掉根部土壤，用無菌剪分別剪下根部并放入50 mL無菌離心管中，迅速擰緊管蓋，并用PE膜封口貼上標簽，置于4 ℃保溫箱中迅速帶回實驗室。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 固氮菌的分離與種群密度測定

將青稞根系用無菌水洗 3 次，每次3 min；用吸水紙吸去根系表面水分，70%酒精中浸泡 2 min；無菌水洗 3 次，3%NaClO 浸泡 2 次，每次 1 min；用無菌水沖洗 3 次，每次 2 min，將最后一次的沖洗液涂布于Ashby培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基上無菌落產(chǎn)生證明表面消毒完全。

消毒后的青稞根系用無菌研缽研磨成漿，靜置后，吸取上清液，稀釋至10-3～10-7的不同濃度梯度，分別吸取各稀釋濃度的提取液100 μL，涂布于Ashby培養(yǎng)基上，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)，28 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，挑取差異菌落純化，鏡檢，斜面保藏，分析其固氮酶活性。

1.2.2 菌株的生理特性測定

固氮酶活性采用乙炔還原法[9]測定。溶磷、溶鉀能力采用溶解圈法，測定菌株在Pikovaskaia培養(yǎng)基、硅酸鹽細菌培養(yǎng)基上溶解圈的直徑，以溶解圈直徑與菌落直徑比值(HD/CD)作為內(nèi)生固氮菌的溶磷、溶鉀能力指標[10]。分泌IAA能力采用 Salkowski 比色法[11]測定。

1.2.3 基因組 DNA提取與16S rDNA 的PCR擴增

將保存的固氮菌菌株活化后接種于Ashby培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落采用CTAB法提取基因組DNA，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA純度。以基因組 DNA 為模板、上游引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGA ACGAACGCT-3′)、下游引物1492R(5′-TACGG CTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)進行菌株16S rDNA 基因片段擴增。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqMaster Mix 15 μL，Primer 27F(10 μmol·L-1)1 μL，Primer 1492R(10 μmol·L-1)1 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延長1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物的測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及分析

將菌株的測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST比對，并下載與之相似性最高的菌株16S rDNA序列，采用MEGA 5.1軟件用Neighbor-joining方法進行發(fā)育樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生固氮菌的種群密度

由3個產(chǎn)地的青稞根樣中，共分離到內(nèi)生固氮菌37株，種群密度屬于同一數(shù)量級，但數(shù)量上有一定差異，其種群密度依次為：日喀則(0.25×104cfu·g-1)> 拉薩(0.22×104cfu·g-1)> 林芝(0.16×104cfu·g-1)。

2.2 內(nèi)生固氮菌的固氮酶活性、溶磷、溶鉀能力和產(chǎn)IAA能力

3個青稞主產(chǎn)區(qū)藏青2000根部分離得到的37株內(nèi)生固氮菌中，有11株固氮菌的固氮酶活性高于0.8 nmol·h-1·mL-1，其中，日喀則樣本5株，拉薩樣本4株，林芝樣本2株。酶活性以來自日喀則樣本的RKZ10菌株最高，其固氮酶活性為2.98 nmol·h-1·mL-1(表1)。

在固氮能力高的11株內(nèi)生固氮菌中，有兩株菌株(LS17、LZ32)具有溶鉀特性，只有LS17具有溶磷特性，具有產(chǎn)IAA能力的菌株有6株。

2.4 16S rDNA 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對11株高固氮酶活性菌株的16S rDNA序列在NCBI中進行Blast，查詢與其相似性最高的序列，在Mega 5.1軟件中通過Clustal W進行多序列比較后采用Neighbor-joining方法進行發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這11株菌株分別屬于Bacillus、Gemmatimonas、Sphingomonas、Devosia、Agrobacterium、Mesorhizobium和Burkholderia，其中，Bacillus為優(yōu)勢菌屬(5株)，在林芝、日喀則和拉薩三個地區(qū)的根樣中均有分離株。Gemmatimonas、Agrobacterium為拉薩特有種屬，Sphingomonas、Mesorhizobium為林芝特有種屬，Devosia、Burkholderia為日喀則特有種屬。

表1 內(nèi)生固氮菌的生理特征

nd：未檢測到。

nd:Not detected.

括號中序號表示序列的Genebank登錄號。

Numbers in brackets represent Genebank accession number.

圖1 高固氮酶活性菌株 16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

Fig.1 Phylogeny constructed by 16S rDNA sequences of the high nitrogenase activity strains

3 討 論

非豆科植物固氮能力的研究，一直是內(nèi)生菌研究的熱點，關(guān)于小麥、玉米、水稻等禾本科農(nóng)作物的內(nèi)生固氮菌的研究已有報道，且在農(nóng)業(yè)上具有較大的應(yīng)用潛力[12-15]。而針對青稞的研究主要集中在在青稞營養(yǎng)成分、栽培管理方法及青稞植株基因分析等方面。目前，針對青稞內(nèi)生固氮菌的研究還未見相關(guān)報道。本研究利用純培養(yǎng)技術(shù)對青稞根部內(nèi)生固氮菌進行分離，雖然純培養(yǎng)法由于培養(yǎng)條件等限制，在研究微生物群落多樣性時，還需要結(jié)合多種現(xiàn)代生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)更詳細地闡明微生物群落狀況[16]。但是，該方法在微生物資源開發(fā)和利用中起著重要的作用[17]，且只有能夠經(jīng)過人工培養(yǎng)的內(nèi)生固氮菌才有開發(fā)利用的潛在價值。

西藏耕種土壤養(yǎng)分基本狀況為氮素偏低，本研究發(fā)現(xiàn)，青稞根部內(nèi)生固氮菌多樣性較為豐富。林芝、拉薩、日喀則三地均為高海拔地區(qū)，三個地區(qū)同一品種優(yōu)勢內(nèi)生固氮菌均為芽孢桿菌，其可能的原因之一是季節(jié)性凍融的影響，芽孢桿菌因能形成芽孢休眠體而具有較高的抗逆性[18]。3個產(chǎn)區(qū)內(nèi)生固氮菌種屬差異較大，林芝、拉薩、日喀則三地氣候是由濕潤向半濕潤、半干旱過渡，土壤由黃棕壤向山地灌叢草原土、亞高山草甸土過渡，有機質(zhì)含量由高至低，土壤pH值由低至高[19]，土壤性質(zhì)及氣候不同可能是藏青2000根部內(nèi)生固氮菌種屬存在差異的主要原因。

4 結(jié) 論

藏青2000根部內(nèi)生固氮菌多樣性較為豐富，且不同地區(qū)的內(nèi)生固氮菌多樣性存在一定差異。

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Diversity of Culturable Endophytic Nitrogen-Fixing Bacteria in Naked Barley Roots from Different Production Regions

LIU Zhendong1, YUE Xiao1, WANG Bo2, XUE Bei1, WANG Qiangfeng3

(1.Department of Food Science, Tibet Agricultural and Animal Husbandry College, Nyingchi, Tibet 860000, China; 2.Agricultural Institute, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa, Tibet 850032, China; 3.Institute of Biological&Nuclear Technology Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu, Sichuan 610061, China)

In order to understand the community composition of endophytic nitrogen-fixing bacteria in the naked barley, and the effect of planting regions on the diversity of endophytic nitrogen-fixing bacteria, endophytic nitrogen-fixing bacteria in naked barley roots from different planting regions were isolated and their diversity was investigated. In this study, culture techniques were used to isolate and purify endophytic nitrogen-fixing bacteria from the roots of naked barley ZQ2000 planted in Lhasa, Nyingchi, and Xigaze. Nitrogenase activity of the strains was determined, and dissolved phosphorus and potassium and characteristics of IAA production of the strains with high nitrogenase activity were examined. Taxonomy of the strains with high nitrogenase activity was studied by 16S rDNA gene sequencing and phylogenetic tree construction. The results showed that 37 endophytic nitrogen-fixing bacteria were isolated and purified using Ashby medium, including eleven strains with high nitrogenase activity, accounting for 27% of the isolates. While among these eleven strains with high nitrogenase activity, six strains were capable to secrete IAA, and two strains were capable to dissolve potassium, and one strain were capable to dissolve phosphorus. The results of 16S rDNA sequencing showed that five of the eleven strains with high nitrogenase activity belonged toBacillus, which was the dominant genus, and the rest strains belonged toGemmatimonas,Sphingomonas,Devosia,Agrobacterium,MesorhizobiumandBurkholderia.

Naked barley; Root; Endophytic nitrogen-fixing bacteria; Diversity

時間：2017-04-07

2016-07-16

2016-08-09 基金項目：西藏自治區(qū)青年教師創(chuàng)新計劃項目(QCZ2016-45);西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2015212-14-23); 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(大麥、青稞)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系加工試驗站項目(CARS-05)

E-mail：liu304418091@126.com

王強鋒(E-mail:wqf198808@126.com)

S512.3；S314

A

1009-1041(2017)04-0565-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170407.1021.040.html